CRISPR

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CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) sind Abschnitte sich wiederholender DNA (repeats), die im Erbgut von vielen Bakterien und Archaeen auftreten. Sie dienen einem Mechanismus, der Resistenz gegen das Eindringen von fremdem Erbgut durch Viren oder Plasmide verschafft und sind hierdurch ein Teil des Immunsystem-Äquivalents von vielen Prokaryoten. CRISPR ist Teil des CRISPR/Cas-Systems, das in der Gentechnik zur Erzeugung von gentechnisch veränderten Organismen genutzt wird.

Entdeckung und Eigenschaften[Bearbeiten]

Die Existenz der DNA-Abschnitte, die heute als CRISPR bekannt sind, wurde bereits 1987 im Bakterium E. coli entdeckt.[1] 2002 wurde bekannt, dass ähnliche Strukturen im Genom vieler verschiedener Prokaryoten existieren, und der Name CRISPR wurde geprägt. Außerdem wurde eine Gruppe von Genen entdeckt, die in allen untersuchten Organismen nahe am Genlokus der CRISPR lagen und daher cas-Gene (CRISPR-associated) genannt wurden.[2]

Heute ist bekannt, dass das Genom von etwa 45 % der bislang sequenzierten Bakterien und 83 % der Archaeen mindestens eine CRISPR-Struktur beinhaltet.[3]

CRISPR haben eine Länge, die zwischen 23 und 47 bp variiert. Die Einzelsequenzen des sich wiederholenden Grundmotives wechseln sich ab mit Spacern, die eine Länge von 21 bis 72 bp haben. Während innerhalb einer CRISPR-Struktur die sich wiederholende Sequenz erhalten bleibt, variiert die Sequenz der CRISPR in verschiedenen Mikroorganismen stark.[4] Die Sequenz von CRISPR repeats ist in der Regel palindromisch, was eine stabile Sekundärstruktur der zugehörigen RNA zufolge hat.

Die Sequenzen der Spacer-Abschnitte variieren stark, sowohl innerhalb einer CRISPR-Struktur als auch in verschiedenen Prokaryoten. 2005 wurde entdeckt, dass die Spacer-Sequenzen mit Fremd-DNA aus Bakteriophagen und Plasmiden identisch sind.[5][6][7] Dies führte zur Hypothese, dass die Funktion von CRISPR darin besteht, den Organismus gegen Fremd-DNA zu verteidigen.

Pathogene der Art Francisella verwenden das CRISPR-Cas-System zur Immunevasion.[8] Bei Neisseria meningitidis und Campylobacter jejuni ist das System ein Pathogenitätsfaktor mit bisher unbekanntem Mechanismus.[8]

Immunität durch CRISPR[Bearbeiten]

2007 wurde von Barrangou et al. gezeigt, dass Bakterien, die mit Phagen infiziert werden, Teile der Fremd-DNA als Spacer in die CRISPR-Bereiche ihres Genoms integrieren und hierdurch Immunität gegen die Phagen entwickeln können.[9] Zudem zeigten sie, dass Spacer-Sequenzen, die künstlich in die CRISPR-Bereiche von Bakterien eingefügt werden, diese gegen die zugehörigen Phagen resistent machen. Werden die Spacer-Sequenzen wieder herausgeschnitten, ist auch die Resistenz aufgehoben. Es wurde außerdem gezeigt, dass die cas-Gene eine essentielle Rolle bei der Phagenabwehr spielen: Das Inaktivieren einiger cas-Gene (cas1) verhindert trotz vorhandener Spacer die Abwehr von Phagen. Die Aktivität anderer cas-Gene (cas7) ist notwendig zur Integration neuer Spacer in die CRISPR-Sequenz.

Mechanismus[Bearbeiten]

Skizze des möglichen CRISPR-Mechanismus (nach Horvath, Barrangou 2010[4])

Trotz großer Fortschritte in den letzten Jahren wird der Mechanismus, durch den das CRISPR/cas-System Prokaryoten Immunität verschafft, noch nicht genau verstanden. Man geht davon aus [4], dass im Immunisierungsprozess die exogene DNA durch einen Cas-Proteinkomplex erkannt und als neuer Spacer in die CRISPR-Bereiche integriert wird. Wie diese Vorgänge im Detail ablaufen, ist noch unbekannt.

Die Anfangssequenz eines CRISPR-Bereiches agiert höchstwahrscheinlich als Promotor und bewirkt die Transkription des gesamten CRISPR-Bereiches in ein langes RNA-Molekül. Dieses wird dann mit Hilfe eines Cas-Komplexes (Cascade) in Einzelteile zerlegt, die jeweils einen Spacer und an den Rändern einen Teil der palindromischen Repeats enthalten.[10] Im Zusammenspiel mit den Cas-Proteinen können die einzelnen RNA-Sequenzen in einem ebenfalls noch nicht genau bekannten Mechanismus fremde DNA bzw. RNA erkennen und deaktivieren und somit den Prokaryoten gezielt Immunisierung gegen diejenigen Phagen verschaffen, deren Genom die Spacer-Sequenz enthält. Dieser Mechanismus weist Parallelen zur RNA-Interferenz bei Eukaryoten auf, es bestehen jedoch auch wesentliche Unterschiede, vor allem in der unterstützenden Protein-Maschinerie.

Evolutionäre Auswirkungen[Bearbeiten]

Durch den CRISPR-Cas-Mechanismus können Bakterien Immunität gegen bestimmte Phagen erwerben und die so erworbene Immunität weitervererben, da sie einen virusspezifischen Spacer in ihr Genom integrieren und somit bei der Replikation weitergeben. Aus diesem Grund wurde die provokante These geäußert, dass es sich beim CRISPR-Cas-System um den ersten wirklich lamarckistischen Vererbungsmechanismus handele.[11] Der molekulare Mechanismus von CRISPR selbst ist allerdings durch "klassische" Evolution entstanden.

Anwendungen[Bearbeiten]

Hauptartikel: CRISPR/Cas-System

Es gibt mehrere Vorschläge, CRISPR biotechnologisch auszunutzen:[12]

  • Künstliche Immunisierung gegen Phagen durch Hinzufügen passender Spacer bei industriell wichtigen Bakterien, z.B. in der Milch- oder Weinindustrie
  • Knockdown von endogenen Genen durch Transformation mit einem Plasmid, das einen CRISPR-Bereich beinhaltet, mit einem Spacer, der zu dem stillzulegenden Gen passt
  • Multiplex Genome Editing erlaubt das gleichzeitige Mutieren verschiedener Zielsequenzen, was die Herstellungzeit von transgenen Tieren wie Mäusen von bis zu zwei Jahren auf wenige Wochen verkürzt.[13]
  • Unterscheidung verschiedener Bakterienstämme durch Vergleich der Spacer-Regionen (spoligotyping)
  • Gentherapie
  • Fluoreszenzmarkierung

Einzelnachweise[Bearbeiten]

  1. Ishino Y, Shinagawa H, Makino K, Amemura M, Nakata A:Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. J Bacteriol 169: 5429–5433 (1987)
  2. Jansen R, Embden JD, Gaastra W, Schouls LM: Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes. Mol Microbiol 43: 1565–1575 (2002)
  3. 125/150 Archaeen, 1126/2480 Bakterien CRISPRdb, Stand: 19. Januar 2013
  4. a b c Horvath A., Barrangou R.: CRISPR/Cas, the Immune System of Bacteria and Archaea. Science 327, S. 167 (2010)
  5. Mojica F. J., Diez-Villasenor C., Garcia-Martinez J., Soria E.: Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements. J. Mol. Evol. 60, 174–182 (2005).
  6. Pourcel C., Salvignol G., Vergnaud G.: CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies. Microbiology 151, 653–663 (2005).
  7. Bolotin A., Quinquis B., Sorokin A., Ehrlich S. D.: Clustered regularly interspaced short palindrome repeats (CRISPRs) have spacers of extrachromosomal origin. Microbiology 151, 2551–2561 (2005).
  8. a b T. R. Sampson, D. S. Weiss: Alternative roles for CRISPR/Cas systems in bacterial pathogenesis. In: PLoS pathogens. Band 9, Nummer 10, 2013, S. e1003621, ISSN 1553-7374. doi:10.1371/journal.ppat.1003621. PMID 24146613. PMC 3798603 (freier Volltext).
  9. Barrangou R, Fremaux C, Deveau H, Richards M, Boyaval P, Moineau S, Romero DA, Horvath A:CRISPR Provides Acquired Resistance Against Viruses in Prokaryotes. Science 315, 1709 - 1712 (2007)
  10. Brouns SJJ, Jore MM, Lundgren M, Westra ER, Slijkhuis RJH, Snijders APL, Dickman MJ, Makarova KS, Koonin EV, Van der Oost J : Small CRISPR RNAs Guide Antiviral Defense in Prokaryotes. Science 321: 960 (2008)
  11. Koonin EV, Wolf YI: Is evolution Darwinian or/and Lamarckian?. Biology Direct 4:42 (2009)
  12. Sorek R, Kunin V, Hugenholtz P: CRISPR - a widespread system that provides acquired resistance against phages in bacteria and archaea. Nat Rev Microbiol 6: 181 (2007)
  13. H. Wang, H. Yang, C. S. Shivalila, M. M. Dawlaty, A. W. Cheng, F. Zhang, R. JaenischOne-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering, Cell, Volume 153, Issue 4, 9 May 2013, Pages 910–918