DNase Footprinting Assay

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DNase Footprinting Assay (DNase-Fußabdruck-Untersuchung) ist ein molekularbiologisches Verfahren zur Bestimmung von Protein-DNA-Interaktionen.

Prinzip[Bearbeiten]

Dabei wird ausgenutzt, dass DNA an Stellen, an denen ein Protein gebunden ist, zu einem gewissen Grad vor enzymatischen Spaltungen geschützt ist. Bei dem Verfahren wird das Enzym Desoxyribonuklease (kurz: DNase) verwendet. Es wird gewährleistet, dass DNA-Ketten durch das Enzym einmalig bzw. an wenigen Stellen gespalten werden.

Die untersuchten DNA-Ketten sind am Ende eines der beiden Stränge radioaktiv markiert. Sie werden einer Probe von Zellproteinextrakt oder einer Probe von spezifisch ausgewählten Proteinen zugegeben. Es bilden sich unter Umständen DNA-Protein-Bindungen aus. Durch Zugabe von DNase entstehen DNA-Bruchstücke verschiedenster Länge. Insbesondere sind jene Bruchstücke beliebiger Länge interessant, die das markierte Ende enthalten, denn nur diese sind bei der sich anschließenden Gelelektrophorese sichtbar. Nach Wirkung der DNase werden die Proteine von der DNA getrennt. In der Gelelektrophorese ergibt sich eine fast kontinuierliche Verteilung der Bruchstücke, da die Geschwindigkeit eines DNA-Fragmentes proportional zu dessen Länge ist und beliebige Längen vorkommen sollten. Lediglich auf Abschnitten auf denen Proteine gebunden waren, konnte die DNase nicht wirken. DNA-Fragmente, deren Länge in diesen Bindungsbereich fällt, fehlen, was durch eine Lücke der kontinuierlichen Ausbreitung im Gel sichtbar wird. Eine solche Lücke wird als Fußabdruck des Proteins auf der DNA bezeichnet. Die Bindungssequenz der DNA an Protein kann aufgrund des bekannten Abstands der Bindungsstelle vom markierten Ende rekonstruiert werden.

Literatur[Bearbeiten]