Enzymkinetik

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Die Enzymkinetik ist ein Teilgebiet der biophysikalischen Chemie. Sie beschreibt, wie schnell enzymkatalysierte chemische Reaktionen verlaufen. Die Enzymkinetik findet breite Anwendung in Biologie und Medizin, da auch biologische Substrate (Reaktionspartner) – darunter solche, die im Menschen auftreten – untersucht werden. Ein Hauptziel der Enzymkinetik ist die Beschreibung der Konzentrationsabhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit mit geeigneten Formeln, sowie die Bestimmung der dazugehörigen Parameter für ein bestimmtes Protein (Enzymaktivität und katalytische Effizienz). Da Enzyme dazu dienen, Reaktionen zu beschleunigen und zu lenken, ist die enzymkinetische Analyse zum Verständnis von Enzymfunktionen unerlässlich.

Theorie[Bearbeiten]

Der erste, der den Zusammenhang zwischen Substrat-Konzentration [S] und Umsatzgeschwindigkeit eines Enzymes v beschrieb, war der französische Physikochemiker Victor Henri 1902. Allerdings war die Bedeutung der Wasserstoffionenkonzentration für enzymatische Reaktionen damals noch nicht bekannt, erst nachdem Sørensen 1909 den pH-Wert definiert und die Pufferung eingeführt hatte, konnten der Deutsche Leonor Michaelis und seine kanadische Post-Doktorandin Maud Menten 1913 die Ergebnisse Henris experimentell bestätigen. Die Henri-Michaelis-Menten-Gleichung wurde 1925 von G. E. Briggs und J. B. S. Haldane verallgemeinert (Michaelis-Menten-Theorie).

Henris Schlüsselidee war es, die enzymatische Reaktion in zwei Phasen zu zerlegen, die Bindung des Substrates S an das Enzym E und die Umsetzung des resultierenden Enzym-Substrat-Komplexes ES in Enzym und Produkt P:

 \begin{align} 
 E + S 
 \underset{k_{-1}}{\overset{k_{1}}
 {\begin{smallmatrix}\displaystyle\longrightarrow \\ \displaystyle\longleftarrow \end{smallmatrix}}}
  ES
   \overset{k_{cat}}
  {\longrightarrow}
  E + P
\end{align}

Die Bindungsreaktion kann nach dem Massenwirkungsgesetz beschrieben werden, sie wird charakterisiert durch Dissoziationskonstante K_d = k_{-1} / k_{+1}. Dabei ist K_d diejenige Konzentration des Substrates, bei der (in Abwesenheit der Umsetzung zu Produkt) die Hälfte aller Enzymmoleküle Substrat gebunden haben. Sie ist umgekehrt proportional zur Affinität des Enzymes für das Substrat: Je besser das Enzym das Substrat bindet, umso niedriger ist die für eine Halbsättigung des Enzyms erforderliche Substratkonzentration.

Die Umsetzung des Enzym-Substrat-Komplexes zu Enzym und Produkt wird bestimmt durch eine Geschwindigkeitskonstante 1. Ordnung, k_{cat}. Die tatsächliche Geschwindigkeit der enzymatischen Reaktion ergibt sich zu v = k_{cat} * [ES]. Allerdings vermindert die Zerfallsreaktion die Konzentration von [ES], es ist deshalb erforderlich, diese statt mit K_d mit K_m = \frac{k_{-1} + k_{cat}}{k_{+1}} zu berechnen. Dann ergibt sich[1]

\begin{align}v = k_{cat} [E]_t \frac{ [S]}{ K_m + [S]} = v_{max} \frac{ [S]}{K_m + [S]} \end{align}

Dies ist die Gleichung einer Hyperbel, sie nähert sich für unendlich hohe Substratkonzentrationen, wenn alle Enzymmoleküle Substrat gebunden haben, einem Grenzwert v_{max} = k_{cat} \times [E]_t an. Dabei steht [E]_t für die totale Enzymkonzentration. Die Konzentration, bei der die Reaktionsgeschwindigkeit gerade die Hälfte des Maximalwertes erreicht, ist die Michaelis-Konstante K_m. Zur Bestimmung von V_{max} und K_m aus Messreihen von v und [S] dienen computergestützte Verfahren wie die nichtlineare Regressionsanalyse (Simplex- oder Levenberg-Marquardt-Verfahren). Graphische Extrapolationsverfahren (Linearisierungen) wie etwa die doppelt-reziproke Auftragung nach Lineweaver und Burk sollten dafür nicht verwendet werden, da sie zu ungenau sind. Sie eignet sich jedoch sehr gut zur Präsentation der Ergebnisse enzymkinetischer Versuche, weil das menschliche Auge Abweichungen von einer Geraden leichter erkennen kann als die von einer Kurve.

Direkt-lineare Auftragung[Bearbeiten]

Direkt-lineare Auftragung

Enzymkinetische Parameter lassen sich bequem und präzise direkt aus einer Sättigungshyperbel gemäß der Abbildung herleiten („direkt-lineare Auftragung“ auch „Cornish-Bowden-Diagramm“ genannt). In dieser Hyperbel ist die enzymatische Umsatzgeschwindigkeit v (y-Achse) als Funktion der Substratkonzentration [S] dargestellt.

Für die direkt-lineare Auftragung überträgt man die Anfangsgeschwindigkeiten des enzymatischen Umsatzes direkt in das v-[S]-Diagramm. Die [S]-Werte sind vor Versuchsbeginn bekannt (eingestellte Substratkonzentrationen); während der Versuchsreihe ist dann der Ordinatenwert für v (die Anfangsgeschwindigkeit) nachzutragen. Aus der maximalen Umsatzgeschwindigkeit vmax lässt sich die halbe maximale Umsatzgeschwindigkeit 0,5 vmax ableiten. Graphisch kann man daraus den Koordinatenwert für Km ermitteln. Die katalytische Effizienz folgt übrigens aus der Steigung der Tangente an den Ursprung: vmax/Km; daraus ergibt sich kcat/Km.

Die Fehlerbehandlung wird im direkt-linearen Plot weitgehend vereinfacht: Mittelwertsbildung gibt dann die wahrscheinlichen Werte für die Parameter Km und Vmax. Bei Inspektion der Streubreite der Messpunkte (nicht identisch mit deren Standardabweichung) können Ausreißer leicht identifiziert und sogenannte Mediane abgelesen werden.

An dieser Stelle sei erwähnt, dass alle (auch die nachfolgenden) Auswertungsverfahren nicht nur für Enzyme, sondern auch für die Bindungsvorgänge von Carriern oder Rezeptoren Gültigkeit haben. Historisch gesehen wurden all diese Methoden (Hanes und Eadie-Hofstee-Auftragung für Enzyme, Scatchard und Hill-Auftragungen für Carrier) ursprünglich von Woolf entwickelt.

Linearisierungsverfahren[Bearbeiten]

Linearisierungsverfahren wurden in der Vergangenheit sehr häufig für die schnelle grafische Bestimmung der wichtigen Kinetikparameter Km und Vmax verwendet. Sie sind zwar einprägsam und verbreitet, führen jedoch zu einer teils erheblichen Verfälschung des Ergebnisses durch Messfehler und sind zur Fehlerbetrachtung mehr oder weniger ungeeignet. Mittlerweile hat die Ermittlung der Michaelis-Menten-Parameter durch nichtlineare Regression stark an Bedeutung gewonnen, die zu deutlich genaueren Ergebnissen führt. Deshalb sollen die Linearisierungsverfahren hier nur gestreift werden.

Lineweaver-Burk-Diagramm[Bearbeiten]

Lineweaver-Burk-Diagramm

Hans Lineweaver (1907–2009) und Dean Burk (1904–1988) haben 1934 eine doppelt-reziproke Darstellung vorgestellt, bei der 1/v als Funktion von 1/[S] aufgetragen wird.[2]

Aus der Michaelis-Menten-Gleichung

v = v_\max\frac{[S]}{K_m + [S]}

wird durch Umformung:

{1 \over v} = {{K_m + [S]} \over v_{\max} [S]} = {K_m \over v_\max} {1 \over [S]} + {1 \over v_\max}

Daher schneidet der Graph die x-Achse bei −1/Km, und die y-Achse bei 1/vmax, was direkt von der graphischen Auftragung abgelesen werden kann. Obwohl sie zur Datenrepräsentation meist verwendet wird, ist diese Methode zur Auswertung jedoch unverlässlich. Kleine Fehler in v ergeben bei kleinen [S]-Werten eine große Abweichung in 1/v, bei großen [S]-Werten ist diese eher zu vernachlässigen. Die Autoren der Methode haben die Unsicherheit großer 1/v Werte betont und darauf hingewiesen, dass diese grundsätzlich geringer zu gewichten sind. Spätere Anwender haben dies zumeist ignoriert. Wo immer möglich sollte dieses durch Computerverfahren zur Bestimmung enzymkinetischer Parameter ersetzt werden.

Eadie-Hofstee-Diagramm[Bearbeiten]

Das Eadie-Hofstee-Diagramm, auch Woolf–Eadie–Augustinsson–Hofstee- oder Eadie–Augustinsson-Diagramm, nimmt eine Mittelstellung ein. Hierbei wird v über (v/[S]) aufgetragen.

Eine Umformung der Michaelis-Menten-Gleichung ergibt die folgende Gleichung:

v = -K_m { v \over [S] } + v_{max}

Aus dem Diagramm lassen sich vmax als y-Achsenabschnitt und Km als negative Steigung der Regressionsgeraden ableiten.

Der Fehler wächst mit v/[S]. Da v bei beiden Koordinaten eingeht, konvergieren alle Abweichungen zum Ursprung.

Scatchard-Diagramm[Bearbeiten]

Das Scatchard-Diagramm

v/[S] als Funktion von v.

gleicht dem vorigen (Achsen sind vertauscht) und wird zumeist zur Repräsentation von Bindungsmessungen (anstelle enzymkinetischer Daten) angewendet. Scatchard- und Eadie-Hofstee-Diagramme gelten als die besten Werkzeuge zur Diagnose kooperativer Phänomene. Im Falle negativer Kooperativität oder nicht-identischer, isolierter Bindungsplätze entsteht ein konkaver Verlauf mit linearem Endast. Die Steigungen entsprechen hier den Affinitäten (Kd beziehungsweise Km) und die Gesamtzahl der Bindungsplätze (aktiven Zentren) ist aus dem Schnittpunkt mit der x-Achse abzulesen.

Hanes-Woolf-Diagramm (Hanes(-Wilkinson)-Diagramm)[Bearbeiten]

Hanes-Woolf-Diagramm

Das Hanes-Woolf-Diagramm[3] ist die bestmögliche lineare Auftragungsmöglichkeit. Es geht auf Charles Samuel Hanes (1903–1990) und Barnet Woolf (1902–1983) zurück. Hierbei wird [S]/v als Funktion von [S] aufgetragen, was nach Auflösen folgende Gleichung ergibt:

 {[S] \over v} = {1 \over v_\max }[S] + {K_m \over v_\max }

Fehler in [S]/v sind eine weit bessere Annäherung der Fehler in v. Aufgrund einer unverfälschten Spreizung der Messpunkte entlang der [S]-Achse wird das Ergebnis durch einzelne Ausreißer prinzipiell weniger verfälscht. Da aber abhängige und unabhängige Variable vermischt werden ist auch hier eine Datenoptimierung durch lineare Regression nicht sinnvoll. Der Anstieg der Regressionsgeraden beträgt 1/vmax, der Schnittpunkt mit der y-Achse entspricht Km/vmax und der mit der x-Achse −KM.

Hill-Diagramm[Bearbeiten]

Das Hill-Diagramm ist eine graphische Methode nach Archibald Vivian Hill,[4][5] die ursprünglich zur Bestimmung der kooperativen Bindung von Sauerstoff an Hämoglobin eingesetzt wurde. Der Hill-Plot wird vorrangig für die Bestimmung eines kooperativen Bindungsvorganges für ein Protein (Enzym) verwendet. Gebunden werden Substrate S (bzw. Liganden L) Die Graphik setzt Kenntnis von Vmax (beziehungsweise n) voraus. Die Auftragung von

log v/(Vmax-v) als Funktion von log [S] beziehungsweise
log r/(n-r) als Funktion von log [L]

ist eine Gerade der Steigung 1 (nH = 1), wenn die Bindungsplätze voneinander unabhängig sind. Bei kooperativen Systemen kann die Steigung am Nullpunkt (der Hill-Koeffizient nH) theoretisch der Zahl der Untereinheiten (n) gleichen, wird aber praktisch darunter bleiben. Falls die individuellen Km-(Kd-)Werte nicht durch Tangenten an die 45°- Ausläufer der Kurve extrapolierbar sind, ist nH ein Ersatzmaß der Kooperativität einzusetzen; nur für nH = 1 gleicht der Nulldurchgang ln Km (beziehungsweise ln Kd). Für Hämoglobin (n = 4), das als klassisches, hochkooperatives Protein gilt, wurde nH zu 2,8-2,9 bestimmt.

Linearisierungen einer Hyperbel

Die Hill-Gleichung:

 \theta =  \dfrac {[L]^n} {K_d + [L]^n} = \dfrac {[L]^n} {(K_A)^n + [L]^n} = \dfrac {1} {( \dfrac {K_A} {[L]} )^{n+1}}

mit  \theta als Anteil der besetzten Bindungsstellen, an denen das Pharmakophor des Ligand, [L] als Konzentration des ungebundenen Liganden, K_d als scheinbare Dissoziationskonstante aus dem Massenwirkungsgesetz, K_A als Konzentration des Liganden mit halbmaximaler Bindung, n als Hill-Koeffizient.

Ein Hill-Koeffizient von 1 zeigt eine voneinander unabhängige Bindung zweier Liganden an, ein Wert größer als 1 weist auf eine positive Kooperativität hin, unter 1 weist auf negative Kooperativität hin. Bei einer Unabhängigkeit (n=1) gleicht sich die Hill-Gleichung der Langmuir-Gleichung an.

Wird der Kehrwert gebildet, umgestellt, erneut der Kehrwert gebildet und logarithmiert, erhält man eine alternative Formulierung der Hill-Gleichung:

 \log\left( \dfrac {\theta} {1-\theta} \right) = n\log{[L]} - \log{K_d}

Inhibitoren[Bearbeiten]

Hauptartikel: Enzymhemmung

Viele Therapeutika und Gifte sind Hemmstoffe (Inhibitoren) von Enzymen. Aus diesem Grunde ist der Aufklärung des Wirkungsmechanismus immer eine besondere Bedeutung zugekommen. Die Nomenklatur der Hemmtypen wurde von William Wallace Cleland (* 1930) 1963 auf eine systematische Grundlage gestellt, leider werden in vielen Lehrbüchern immer noch Begriffe abweichend verwendet.

Hier sollte allerdings beachtet werden, dass sich klassische Analysen auf reversibel bindende Stoffe beschränken. Irreversible Bindung einer Substanz an ein Enzym führt zur Inaktivierung, nicht zur Hemmung.

Abgeleitet aus der Michaelis-Menten-Gleichung v = V_\max \cdot [\mathrm{S}] / (K_m + [\textrm{S}]) stellt sich die allgemeine Inhibitionsgleichung wie folgt dar:

v =
 \frac { V_\max \cdot [\mathrm{S}] }
 { K_m (1 + \frac{[\mathrm{I}]}{K_i}) + [\mathrm{S}] (1 + \frac{[\mathrm{I}]}{K_{ii}}) }

Danach kann das Verhältnis des K_i-Wertes (Dissoziationskonstante des Komplexes EI) und des K_{ii}-Wertes (Dissoziationskonstante des Komplexes EIS) zur Ableitung des Inhibitionstyps dienen:

Kompetitiv[Bearbeiten]

Enzymhemmung

Inhibitor und Substrat schließen sich gegenseitig von der Bindung an das Enzym aus. Dies bedeutet jedoch nicht notwendigerweise, dass der Inhibitor an der gleichen Bindungsstelle bindet wie das Substrat. Auch wenn die Bindung von Substrat bzw. Inhibitor zu Konformationsänderung im Enzym führen, welche die Bindungsstelle für den jeweils anderen blockieren, ist die Hemmung kompetitiv. Wenn Substrat und Inhibitor allerdings die gleiche Bindungsstelle haben, dann ist der Hemmtyp notwendig kompetitiv.

Bei der Kompetitiven Hemmung kann der Inhibitor durch Substrat aus dem Enzym verdrängt werden, V_\max ändert sich also nicht. Allerdings wird für jede gewünschte Geschwindigkeit eine höhere [\mathrm{S}] benötigt, die scheinbare K_m wird also mit steigender [\mathrm{I}] höher. Im Lineweaver-Burk-Diagramm führt dies zu einer Schar von Geraden, die einen gemeinsamen Schnittpunkt auf der y-Achse (1/V_\max) haben.

Unkompetitiv[Bearbeiten]

Der Inhibitor bindet nicht an das freie Enzym, sondern an den ES-Komplex. Höhere Konzentrationen des Substrates können daher den Hemmstoff nicht vom Enzym verdrängen, sondern führen zu vermehrter Bindung. Umgekehrt vermindert Bindung des Hemmstoffes die Konzentration von ES, nach dem Prinzip von Le Chatelier muss sich also zusätzliches ES aus E und S bilden: Die scheinbare K_m vermindert sich, die Affinität des Enzymes für das Substrat steigt mit steigender [\mathrm{I}]. Gleichzeitig nimmt natürlich V_{max} ab. Im Lineweaver-Burk-Diagramm finden wir eine Schar paralleler Geraden.

Nicht-kompetitiv[Bearbeiten]

Der Inhibitor kann sowohl an E als auch an ES binden. Im einfachsten Fall ist dabei K_i = K_{ii}, d.h., dass die Substratbindung die Affinität des Enzymes für den Inhibitor nicht verändert, etwa durch Konformationsänderung. Dann folgt natürlich auch, dass die Bindung des Inhibitors die Affinität des Enzymes für das Substrat nicht ändert und K_s = K_{ss}. Wegen des Zusammenhangs zwischen K_s und K_m ändert die Bindung von Inhibitor also auch nicht K_m.

Es lässt sich nun zeigen (durch Substitution und Eliminierung aus den Definitionen von K_i, K_{ii}, K_s und K_{ss}), dass K_i / K_{ii} = K_s / K_{ss}. Wenn also K_i < K_{ii}, dann folgt K_s < K_{ss} und die scheinbare K_m steigt mit [\mathrm{I}]. Falls andererseits K_i > K_{ii}, dann folgt K_s > K_{ss} und die scheinbare K_m sinkt mit steigendem [\mathrm{I}].

Die nicht-kompetitive Hemmung führt im Lineweaver-Burk-Diagramm zu einer Schar von Geraden mit gemeinsamen Schnittpunkt links von der y-Achse, der Schnittpunkt liegt auf der x-Achse wenn K_i = K_{ii}, er liegt über der x-Achse falls K_i < K_{ii} und unter der x-Achse falls K_i > K_{ii}.

Gemischt-kompetitive Hemmung[Bearbeiten]

Der Mechanismus dieses Hemmtyps (der in der Praxis von geringer Bedeutung ist) ähnelt der nicht-kompetitiven Hemmung, allerdings hat der EIS-Komplex noch eine katalytische Aktivität. Auch das Lineweaver-Burk-Diagramm sieht aus wie bei der nicht-kompetitiven Hemmung (mit allen 3 Möglichkeiten). Im sog. Sekundärdiagramm (Steigung bzw y-Schnittpunkt im Lineweaver-Burk-Diagram als Funktion von [\mathrm{I}]) sieht man aber im Falle der nicht-kompetitiven Hemmung Geraden, im Falle der gemischt-kompetitiven jedoch Kurven.

Einzelnachweise[Bearbeiten]

  1. für eine Herleitung, siehe hier.
  2. Lineweaver, H. und Burk, D. (1934). The Determination of Enzyme Dissociation Constants. In: Journal of the American Chemical Society 56; S. 658–666. doi:10.1021/ja01318a036.
  3. Hanes, CS. (1932). Studies on plant amylases: The effect of starch concentration upon the velocity of hydrolysis by the amylase of germinated barley. In: Biochemical Journal 26: 1406–1421; PMID 16744959; PDF (freier Volltextzugriff, engl.).
  4. A. V. Hill: The possible effects of the aggregation of the molecules of hæmoglobin on its dissociation curves. (PDF) In: J Physiol. 40, Nr. Suppl, 22. Januar 1910, S. iv-vii. Abgerufen am 18. März 2009.
  5. T. L. Williams, D. A. Smith, N. R. Burton, T. W. Stone: Amino acid pharmacology in neocortical slices: evidence for bimolecular actions from an extension of the Hill and Gaddum-Schild equations. In: Br J Pharmacol. (1988), Band 95, Nr. 3, S. 805-810. PMID 2905185; PMC 1854217 (freier Volltext).

Siehe auch[Bearbeiten]

Literatur[Bearbeiten]

  • H. Bisswanger: Enzymkinetik - Theorie und Methoden. 3. Auflage, Wiley-VCH, Weinheim 2000, ISBN 978-3-527-30096-9.
  • E. Buxbaum: Fundamentals of protein structure and function. Springer, New York 2007, ISBN 978-0-387-26352-6.
  • G. E. Briggs und J. B. Haldane: A Note on the Kinetics of Enzyme Action. In: Biochemical Journal. Band 19, Nr. 2, 1925, S. 338–229; PMID 16743508.
  • W. W. Cleland: The kinetics of enzyme-catalyzed reactions with two or more substrates or products. In: Biochimica et Biophysica Acta. Band 67, 1963, S. 104–137, 173–187, 188–196.
  • R. Eisenthal und A. Cornish-Bowden: The direct linear plot. A new graphical procedure for estimating enzyme kinetic parameters. In: Biochemical Journal. Band 139, Nr. 3, 1974, S. 715–720; PMID 4854723.
  • J. B. S. Haldane: Graphical methods in enzyme chemistry. In: Nature. Band 179, 1957, S. 832.
  • V. Henri: Theorie generale de l'action de quelques diastases. In: Comptes rendues l'Academie des sciences. Band 135, 1902, S. 916–919.
  • A. V. Hill: The possible effects of the aggregation of the molecules of haemoglobin on its dissociation curves. In: The Journal of Physiology Band 40, Supplement, 1910, S. iv–vii.
  • L. Michaelis und M. L. Menten: Die Kinetik der Invertin-Wirkung. In: Biochemische Zeitschrift. Band 49, 1913, S. 333–369.
  • I. H. Segel: Enzyme Kinetics. Wiley, New York 1975 (Nachdruck 1993).
  • S. P. L. Sørensen: Enzymstudien II. Über die Messung und Bedeutung der Wasserstoffionenkonzentration bei enzymatischen Prozessen. In: Biochemische Zeitschrift. Band 21, 1909, S. 131–304.

Weblinks[Bearbeiten]