QPNC-PAGE

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QPNC-PAGE (Abkürzung für engl.: quantitative preparative native continuous polyacrylamide gel electrophoresis) ist eine standardisierte Variante der nativen Gelelektrophorese.[1] Diese analytische Methode der Biochemie und Bioanorganischen Chemie dient zur Trennung von geladenen Molekülen in einem homogenen elektrischen Feld und gestattet die quantitative Abtrennung und Isolierung von Metalloproteinen aus menschlichen, pflanzlichen oder tierischen Proben mit hoher Auflösung. Proteine werden entsprechend den isoelektrischen Punkten aufgetrennt und mit Hilfe der NMR-Spektroskopie analysiert. Die Methode wird zur Strukturaufklärung von nativen und denaturierten Metalloproteinen sowie Isoformen und deren Interaktionen in komplexen Proteingemischen verwendet.

Prinzip[Bearbeiten]

Elektrophorese-Apparatur[Bearbeiten]

Geräte für die präparative Gelelektrophorese von Proteinen

Die Trennung der Proteine erfolgt in einer handelsüblichen Elektrophoresekammer für präparative Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE). Sie ist aufgebaut aus verschiedenen Komponenten, der oberen und unteren Elektrophoresekammer sowie der Gelsäule mit Elutionskammer und Kühlfinger. Als Zusatzgeräte zur Elektrophoresekammer dienen eine Gleichspannungsquelle, eine peristaltische Pumpe für den Transport des Eluenten zu einem Fraktionssammler, ein UV-Detektor mit Rekorder und eine Pumpe für einen Kühlkreislauf des unteren Elektrophoresepuffers zur Kühlung des Gels. Alle Geräte, außer Spannungsquelle und Rekorder, werden während der Elektrophorese in einem Kühlschrank konstant bei 4 °C gekühlt (siehe Abbildung).

Elektrophoresepuffer und Gel[Bearbeiten]

Als kontinuierlicher Elektrophoresepuffer wird bei QPNC-PAGE eine spezielle Pufferlösung, eine Mischung aus 20 mM Tris-HCl und als Biozid 1 mM NaN3, mit dem pH-Wert 10,00 gewählt. Kontinuierlich bedeutet in diesem Zusammenhang, dass sowohl der Anodenpuffer, als auch der Kathodenpuffer sowie der Puffer zur Herstellung des Polyacrylamid-Gels die gleiche chemische Zusammensetzung und Konzentration haben. Die meisten Proteine eines lebenden Organismus sind aufgrund ihres isoelektrischen Punkts bei dem pH-Wert von 10,00 negativ geladen und wandern im elektrischen Feld daher von der Kathode zur Anode. Der Stromfluss zwischen Kathode und Anode bewirkt in der Pufferlösung die elektrophoretische Bewegung geladener Moleküle und als Nebenreaktion auch Elektrolysevorgänge mit den damit verbundenen Elektrodenreaktionen. An der Kathode entsteht dabei gasförmiger Wasserstoff und an der Anode entsteht vornehmlich Sauerstoff im Verhältnis 2:1, in geringerem Umfang auch elementares Chlor. An der Anode werden bei diesen elektrochemischen Prozessen gleichzeitig Wasserstoffionen erzeugt, die mit Tris-Molekülen zu einwertigen Tris-Ionen reagieren. Die positiv geladenen Tris-Ionen wandern durch das Gel zur Kathode und reagieren dort mit Hydroxidionen zu Tris-Molekülen und Wasser. Der Tris-basierte Pufferungsmechanismus bewirkt einen konstanten pH-Wert im Puffersystem. Die bei der Elektrophorese im Gel entstehende Wärme wird einerseits durch Kühlung von außen, und andererseits durch einen inneren Kühlkreislauf in der Elektrophoresekammer abgeführt.[2]

Das Polyacrylamid-Gel muss auf Grund der technischen Vorgaben der verwendeten Elektrophoresekammer vor jedem Lauf frisch hergestellt werden. Die Herstellung erfolgt prinzipiell wie bei der Polyacrylamid-Gelelektrophorese, jedoch wird bei QPNC-PAGE ein Trenngel ohne Sammelgel verwendet. Das fertige Gel verfügt im Vergleich zu anderen Gelelektrophoresen über eine relativ großporige Struktur mit einem Gesamtmonomeranteil von 4 % T (T = Gesamtanteil von Acrylamid und N,N-Methylenbisacrylamid im Gel [w/v]) mit einer Quervernetzung von 2,67 % C (C = Verhältnis N,N-Methylenbisacrylamid/Acrylamid [w/w]). Es verfügt über eine Höhe von 40 mm mit einem inneren Durchmesser von 28 mm. Als Katalysator für die Polymerisierung werden 0,5 µl TEMED/ml Gel eingesetzt, der Anteil an APS als Radikalstarter bezogen auf den Gesamtmonomerengehalt des Gels beträgt 1,25 % [w/w].

Das Gel wird außerhalb der Elektrophoresekammer auf einer speziellen Vorrichtung, auf der die Gelsäule und der Kühlfinger befestigt sind, gegossen. Es benötigt insgesamt 69 Stunden zur vollständigen Polymerisation bei Raumtemperatur, wobei es sich um eine exotherme Reaktion handelt. Die dabei entstehende Wärme wird mit Hilfe des inneren Kühlkreislaufs der Elektrophoresekammer abgeführt. Dieses Vorgehen bewirkt, dass sich keine freien Monomere mehr im Gel befinden, wodurch Reaktionen von Gelkomponenten (Gelmatrix) mit den zu isolierenden Analyten (Proteine) ausgeschlossen werden können. Molekularsiebeffekte oder sonstige Interaktionen der Gelmatrix mit den Analyten (siehe Gelelektrophorese) können auf Grund der Porengröße und Homogenität des Gels im Vergleich zu einem Trenngel bei einer anderen nativen Gelelektrophorese oder bei einer SDS-PAGE näherungsweise als vernachlässigbar betrachtet werden. Das Gel ist mechanisch stabil und daher handhabbar. Die Polymerisationsdauer des Gels verbunden mit der Komprimierung der Gelporen hat entscheidende Bedeutung für die Reproduzierbarkeit der Elutionszeiten von Metalloproteinen im Elektropherogramm.

Zu analysierende Proben werden vor der Elektrophorese mit 10 % [v/v] Glycerin vermischt, um eine Denaturierung der Inhaltsstoffe bei der Probenaufgabe zu vermeiden. Die Probe selbst, deren Gesamtproteingehalt nicht mehr als 0,5 mg betragen soll, erhält dadurch eine höhere Dichte und lässt sich kontrolliert unter den Kathodenpuffer auf die Geloberfläche applizieren.

Quantifizierung[Bearbeiten]

Elektropherogramm eines hochmolekularen Metallproteins (≈ 200 ku) aus vier PAGE-Läufen in Abhängigkeit von unterschiedlichen Polymerisationszeiten des verwendeten Gels (4% T, 2,67% C)

Die in der Probe vorliegenden negativ geladenen Molekülionen (Anionen) wandern durch das Gel in Richtung Anode und werden in der Elutionskammer kontinuierlich eluiert. Bei diesem Vorgang werden zuerst die kleinen anorganischen und organischen Anionen eluiert und danach die Proteine in Fraktionen gesammelt. Folglich werden die Analyte aus dem Gel entfernt.

Die Eigenschaften der QPNC-PAGE bewirken ferner, dass bei einem elektrophoretischen Lauf weder die Größen (Molekülmassen) noch die Formen (Gestalt) der zu isolierenden Proteine eine Trennung beeinflussen. Stattdessen erfolgt die Isolierung der aufgetrennten Proteine (Metalloproteine, Proteine mit organischen Cofaktoren und ohne Cofaktoren) und Peptide ausschließlich entsprechend den isoelektrischen Punkten (pI). Native und denaturierte Moleküle eines Proteinkomplexes haben jeweils unterschiedliche isoelektrische Punkte, wobei die Geschwindigkeit der Migration eines Proteins durch das Gel direkt vom jeweiligen pI abhängig ist. Isomere von Proteinen sowie native und denaturierte Metalloproteine, die beispielsweise nebeneinander in einer Probe vorliegen, werden daher getrennt in einem Elektropherogramm dargestellt.

Die aufgetrennten Moleküle wandern jeweils mit unterschiedlich konstanter Geschwindigkeit als ringförmige Proteinbanden durch das Gel und werden dann von einem physiologischen Puffer (20 mM Tris-HCl, 1 mM NaN3, pH 8,00) reproduzierbar eluiert und in Fraktionen isoliert. Bei einer Trennung werden weder die vorliegenden Metall-Proteinkomplexe dissoziiert, noch die nativen Konformationen verändert. Das Auflösungsvermögen der QPNC-PAGE für Metallcofaktoren (z. B. Fe, Cu, Zn, Ni, Mo, Pd, Co, Mn, Pt, Cr oder Cd) bewegt sich im physiologisch wirksamen Bereich von ungefähr 1 ng/ml. Nach einer Identifizierung und absoluten Quantifizierung der Metallcofaktoren mit der ICP-MS (Abkürzung für engl.: inductively coupled plasma mass spectrometry) kann ein isoliertes Metallprotein aufgrund seiner hohen Reinheit und optimierten Konzentration der NMR-Spektroskopie quantitativ zugeführt werden.

Anwendungen[Bearbeiten]

Blatt von Ginkgo biloba. Ginkgo-Extrakte werden u. a. zur frühen Behandlung von Demenzerkrankungen eingesetzt. Ginkgoblätter enthalten biologisch aktive Kupferchaperonproteine, die möglicherweise Bedeutung für die ursächliche Behandlung der Alzheimer-Krankheit haben.[3]

Mit Hilfe der NMR-Spektroskopie können ein- oder mehrdimensionale Proteinstrukturen in bestimmten Fraktionen von nativen und fehlgefalteten Proteinen aufgeklärt und mit Hilfe der Bioinformatik Struktur-Funktionsbeziehungen für verschiedene Metalloproteine (z. B. Metallochaperone, Prionen, Metalloenzyme, Metallopeptide (z.B. Beta-Amyloid u. a.) ermittelt werden. Proteine und deren Interaktionen können dabei analysiert werden. Besonders wichtig ist dieser Ansatz für die klinische Diagnostik und Therapie im Bereich von Proteinfehlfaltungserkrankungen, deren Ursachen in einer Fehlfaltung der Proteine liegen, wozu beispielsweise die Alzheimersche Krankheit oder die Creutzfeldt-Jakob-Krankheit zählen. Besondere Bedeutung für die Entwicklung neuer Medikamente für bestimmte Proteinfehlfaltungserkrankungen haben mittlerweile Heilpflanzen und Nutzpflanzen erlangt. Im industriellen Maßstab werden zu diesem Zweck pharmakologisch wirksame rekombinante Proteine (siehe Molecular Pharming) oder andere biologisch aktive Pflanzeninhaltsstoffe erzeugt, deren Wirkung im Organismus (engl.: „relative biochemical impact“) mit Hilfe einer Strategie bestehend aus analytischen, biochemischen und biophysikalischen Verfahren nachgewiesen werden kann. Die interdisziplinäre Ausrichtung der verwendeten Methodik vermindert die Gefahr, dass es sich bei den entsprechenden Ergebnissen um Artefakte handelt.

Literatur[Bearbeiten]

  • Noor Fitri, Bernd Kastenholz, Buchari, Muhammad B. Amran, Fida M. Warganegara: Molybdenum speciation in raw phloem sap of castor bean. In: Analytical Letters. Bd. 41, Nr. 10, 2008, ISSN 0003-2719, S. 1773–1784, doi:10.1080/00032710802162442.

Weblinks[Bearbeiten]

Einzelnachweise[Bearbeiten]

  1. Bernd Kastenholz: Important Contributions of a New Quantitative Preparative Native Continuous Polyacrylamide Gel Electrophoresis (QPNC-PAGE) Procedure for Elucidating Metal Cofactor Metabolisms in Protein-Misfolding Diseases - A Theory. In: Protein & Peptide Letters. Bd. 13, Nr. 5, 2006, S. 503–508, doi:10.2174/092986606776819637.
  2. Bernd Kastenholz: Comparison of the Electrochemical Behavior of the High Molecular Mass Cadmium Proteins in Arabidopsis Thaliana and in Vegetable Plants on Using Preparative Native Continuous Polyacrylamide Gel Electrophoresis (PNC-PAGE). In: Electroanalysis. Bd. 18, Nr. 1, 2006, S. 103–106, doi:10.1002/elan.200403344.
  3. Bernd Kastenholz, David E. Garfin: Medicinal Plants: A Natural Chaperones Source for Treating Neurological Disorders. In: Protein & Peptide Letters. Bd. 16, Nr. 2, 2009, ISSN 0929-8665, S. 116–120, doi:10.2174/092986609787316234.