STED-Mikroskop

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Vergleich von Standard-Konfokalmikroskopie und STED-Mikroskopie bei der Abbildung von Proteinen des Kernporenkomplexes.

Ein STED-Mikroskop (STED = Stimulated Emission Depletion) ist ein Fluoreszenzmikroskop, dessen Auflösung nicht beugungsbegrenzt ist und das nach dem RESOLFT-Prinzip arbeitet. Es wurde 1994 von Stefan Hell und Jan Wichmann theoretisch beschrieben[1] und 1999 von Stefan Hell und Thomas Klar experimentell realisiert[2].

In den Bereich der Forschungsmikroskope gehören neben konventionellen Lichtmikroskopen auch verschiedene Arten von Laser-Scanning-Mikroskopen, und zwar konfokale Laserscanningmikroskope nach dem Punktscanner-Prinzip sowie 4Pi-Mikroskope und STED-Mikroskope. Mit diesen beiden Mikroskoptypen, die auf Forschungsarbeiten von Stefan Hell und Mitarbeitern beruhen, kann die Abbe'sche Auflösungsgrenze umgangen werden, so dass Strukturen mit einer größeren Detailschärfe und einem Zugewinn an struktureller Information räumlich dargestellt werden können.[3] Das STED-Mikroskop und die Gruppe um Stefan Hell wurden für ihre Ergebnisse im Jahr 2006 mit dem Deutschen Zukunftspreis ausgezeichnet. Im Oktober 2014 wurde Stefan Hell für die Arbeiten am STED mit dem Nobelpreis der Chemie[4][5][6][7] ausgezeichnet. Es wird unter anderem in der Arbeitsgruppe von Stefan Hell am Max-Planck-Institut für biophysikalische Chemie in Göttingen weiterentwickelt.

Aufgrund von Beugung ist die Auflösung herkömmlicher Lichtmikroskope begrenzt, eine Grenze die als Abbe-Limit bezeichnet wird. Es lassen sich daher keine Details auflösen, die kleiner als circa die halbe Wellenlänge des verwendeten Lichts sind. Nebeneinander liegende Strukturen werden nur ab einem Abstand von ca. 200 nm aufgelöst. Die Auflösung für hintereinander liegende Objekte (Tiefenauflösung) ist deutlich schlechter. Beim STED-Mikroskop wird durch gezieltes Ausschalten von Fluoreszenzfarbstoffen der übrigbleibende noch fluoreszierende Bereich stark verkleinert und damit die Auflösung unter der Beugungsgrenze ermöglicht. Es konnte bereits eine Auflösung von 2,4 nm (lateral) gezeigt werden.[8]

Grundlagen[Bearbeiten]

Ein STED-Mikroskop baut auf Fluoreszenz-Laser-Raster-Mikroskopen auf. Um das Funktionsprinzip besser zu verstehen, ist es notwendig, auf die wichtigsten Gesichtspunkte von Fluoreszenz, stimulierter Emission und der Laser-Raster-Mikroskopie einzugehen.

Fluoreszenz und Stimulierte Emission[Bearbeiten]

Bei der STED-Mikroskopie werden sogenannte Fluoreszenzfarbstoffe zum Markieren einzelner Bereiche eines Präparats eingesetzt. Solche Farbstoffe können durch Licht bestimmter Wellenlängen (Farben) „angeregt“ werden: Sie absorbieren ein Photon und gehen in einen energiereicheren Zustand über. Aus diesem Zustand können sie nach kurzer Zeit spontan durch Aussenden eines Photons größerer Wellenlänge (anderer Farbe) wieder in den Grundzustand zurückkehren. Diese spontane Abstrahlung von Licht nennt man Fluoreszenz. Durch geeignete Farbfilter kann das Fluoreszenzlicht vom Anregungslicht getrennt werden.

Ein angeregtes Farbstoffmolekül kann außer durch Fluoreszenz auch durch stimulierte Emission wieder in den Grundzustand zurückkehren. Dies passiert, wenn das angeregte Farbstoffmolekül mit Licht von ungefähr der gleichen Wellenlänge wie der des Fluoreszenzlichts bestrahlt wird. Das angeregte Farbstoffmolekül kann so zum sofortigen Übergang in den Grundzustand durch Aussenden eines Photons exakt derselben Wellenlänge stimuliert werden. Spontanes Fluoreszenzlicht kann dann nicht mehr ausgesandt werden, das Molekül ist ja nicht mehr im angeregten Zustand. Fluoreszenzmoleküle können also durch stimulierte Emission ausgeschaltet werden: Wenn sie zur Emission des Lichtes stimuliert werden, können sie danach kein spontanes Fluoreszenzlicht mehr abgeben. Spontanes Fluoreszenzlicht und Licht von der Stimulierten Emission können z. B. durch Farbfilter voneinander getrennt werden.

Fluoreszenz-Laser-Raster-Mikroskopie[Bearbeiten]

Für die Untersuchung in einem Fluoreszenzmikroskop werden Fluoreszenzfarbstoffe an bestimmte Stellen des zu untersuchenden Präparats gebracht. Wird das Präparat nun mit Licht geeigneter Wellenlänge beleuchtet, so werden die Farbstoffe zur Fluoreszenz angeregt und man erhält ein Bild der Farbstoffverteilung im Präparat. Im Laser-Raster-Mikroskop wird nicht das ganze Präparat auf einmal beleuchtet, sondern ein Laserstrahl („Anregungsstrahl“) wird lediglich auf einen kleinen Punkt in dem Präparat fokussiert. Die in diesem Bereich angeregte Fluoreszenz wird detektiert. Durch Bewegen (Scanning, Rastern) des Fokus über das Präparat wird punktweise ein Abbild der gefärbten Bereiche erstellt. Die Größe des Fokus bestimmt die maximale Feinheit der Details, die in dem Präparat gerade noch aufgelöst (getrennt wahrgenommen) werden können. Aufgrund der Beugung kann der Fokus nicht beliebig klein gewählt werden. Ein Laserstrahl lässt sich nicht auf einen Fleck kleiner als circa seine halbe Wellenlänge fokussieren.

Funktionsprinzip des STED-Mikroskops[Bearbeiten]

Anregungsfokus (links), ringförmiger Ausschaltefokus (mitte) und verbleibender fluoreszierender Bereich (rechts).
Querschnitt durch die Intensitätsprofile: Oben: Anregung, Mitte: Ausschaltelicht, Unten: Verbleibende Fluoreszenz

Mit einem STED-Mikroskop ist eine bessere Auflösung als in einem herkömmlichen Laser-Raster-Mikroskop möglich: Der Bereich, aus dem Fluoreszenz emittiert wird, wird dabei bedeutend kleiner gemacht als der Bereich, der von dem Laserstrahl beleuchtet wird. Das wird durch gezieltes Ausschalten der Farbstoffmoleküle im Außenbereich des Fokus erreicht. Dazu wird das Präparat nicht nur mit dem fokussierten Anregungsstrahl beleuchtet (linkes Bild), sondern gleichzeitig mit einem zweiten Laserstrahl, dem „Ausschaltestrahl“. Diesem Ausschaltestrahl gibt man ein ringförmiges Profil im Fokus (mittleres Bild). In der Mitte, also dort wo der Anregungsstrahl seine maximale Helligkeit hat, ist der Ausschaltestrahl vollkommen dunkel. Der Ausschaltestrahl beeinflusst also die Fluoreszenzfarbstoffe in der Mitte nicht. Er schaltet aber die Fluoreszenzfarbstoffe im Außenbereich des Anregungsfokus durch stimulierte Emission (siehe oben) aus; die Farbstoffmoleküle im Außenbereich bleiben dunkel, obwohl sie von dem Anregungslaser beleuchtet werden. Es leuchten deshalb nur die Farbstoffmoleküle genau aus dem Zentrum (rechtes Bild). Der minimale Durchmesser des Anregungsstrahls ist zwar genauso beugungsbegrenzt wie das zentrale Dunkelfeld des Ausschaltestrahls. Allerdings genügen wenige Photonen des Ausschaltestrahls zur Stimulation der Emission einer größeren Zahl von angeregten Zuständen; außerdem kann die Intensität des Ausschaltestrahls höher als die des Anregungsstrahls gewählt werden. Dadurch ist der nicht ausgeschaltete zentrale Bereich sehr viel kleiner als der mit dem Anregungslaser beleuchtete Bereich (siehe Linienprofile rechts). Beim Scannen des Präparates erfasst man somit jeweils einen leuchtenden Fleck, der viel kleiner ist als in einem normalen Laser-Raster-Mikroskop. Deshalb kann man feinere Details auflösen. Um ein vollständiges Bild zu erhalten, wird das Präparat Punkt für Punkt abgerastert.

Die Größe des resultierenden Lichtflecks sinkt mit steigender Intensität des Ausschaltestrahls immer mehr ab. Das bedeutet, die Auflösung steigt umso weiter an, je heller der Ausschaltestrahl ist; das erreichbare Auflösungsvermögen ist prinzipiell nicht begrenzt.[9] Vor der Erfindung der STED-Mikroskopie bestand das Problem, dass der Anregungsstrahl aufgrund der Abbeschen Beugungsgrenze nicht beliebig klein fokussiert werden kann. Man regt also immer alle Moleküle, die sich gerade im Fokus befinden, an und kann daher nicht entscheiden, von welchem Molekül die Fluoreszenz gerade kommt. Daher konnten Strukturen, die kleiner sind als die Ausdehnung des Laserfokus, nicht unterschieden werden.

Anwendungen[Bearbeiten]

Ein bedeutendes Problem gleich welcher lichtmikroskopischen Technik ist der mangelnde Kontrast von Zellbestandteilen. Schon lange benutzt man deshalb fluoreszente Moleküle, die z. B. mit gentechnischen Methoden oder mittels Antikörpern selektiv an bestimmte Moleküle einer Zelle geheftet werden können. Man kann zum Beispiel Farbstoffe nur an Mitochondrien anbauen. Beleuchtet man nun eine Stelle der so präparierten Zelle mit einem fokussierten Laserstrahl und erhält von dort Fluoreszenz, so waren an genau dieser Stelle Farbstoffmoleküle und damit auch Mitochondrien. Um ein vollständiges Bild zu erhalten, wird das Präparat Punkt für Punkt abgerastert. In einem STED-Mikroskop lassen sich alle Präparate untersuchen, die mit Fluoreszenzfarbstoffen markierbar sind. Anders als bei Elektronenmikroskopen sind kein Vakuum und keine dünnen Schnitte erforderlich. Deshalb lassen sich auch lebende Zellen beobachten [10].

Im Gegensatz zur Rastersondenmikroskopie ist die STED-Mikroskopie eine Fernfeld-Technik. Sie ist also nicht auf die Untersuchung von Oberflächen beschränkt. Man kann beispielsweise auch das Innere von Zellen untersuchen. Auch die Beobachtung von schnellen dynamischen Prozessen ist möglich [11], mit bis zu 200 Bildern pro Sekunde [12].

Literatur[Bearbeiten]

  •  Marcus Dyba, Stefan W. Hell: Focal spots of size lambda/23 open up far-field florescence microscopy at 33 nm axial resolution. In: Physical Review Letters. Vol. 88, Nr. 16, 2002, S. 163901, doi:10.1103/PhysRevLett.88.163901.
  •  Katrin I. Willig, Silvio O. Rizzoli, Volker Westphal, Reinhard Jahn, Stefan W. Hell: STED-microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. In: Nature. Vol. 440, 2005, S. 935-939, doi:10.1038/nature04592.
  •  Stefan W. Hell: Microscopy and its focal switch. In: Nature Methods. Vol. 6, Nr. 1, 2009, S. 24–32, doi:10.1038/nmeth.1291.
  •  Stefan W. Hell: Far-Field Optical Nanoscopy. In: Science. Vol. 316, 2007, S. 1153-1158, doi:10.1126/science.1137395.

Weblinks[Bearbeiten]

Einzelnachweise[Bearbeiten]

  1.  Stefan W. Hell and Jan Wichmann: Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. In: Optics Letters. 19, Nr. 11, 1994, S. 780–782, doi:10.1364/OL.19.000780.
  2.  Thomas A. Klar, Stefan W. Hell: Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. In: Optics Letters. Vol. 24, Nr. 14, 1999, S. 954–956, doi:10.1364/OL.24.000954.
  3. Seit 2007 ist das TCS STED auf dem Markt und liefert eine Auflösung unter 100 nm. Seit 2009 gibt es das TCS STED CW mit einer Auflösung unter 80 nm.
  4. The Nobel Prize in Chemistry 2014
  5. SPIEGEL-Online vom 9. Oktober 2014: 'Messerscharfer Blick ins Innerste des Lebens'; abgerufen am 9. Oktober 2014
  6. WELT-Online vom 8. Oktober 2014: 'Nobelpreis für die Entwickler des Supermikroskops'; abgerufen am 9. Oktober 2014
  7. Pressemitteilung des MPI Göttingen vom 8. Oktober 2014; abgerufen am 9. Oktober 2014
  8.  D. Wildanger, B. R. Patton, H. Schill, L. Marseglia, J. P. Hadden, S. Knauer, A. Schönle, J. G. Rarity, J. L. O’Brien, S. W. Hell, J. M. Smith:: Solid Immersion Facilitates Fluorescence Microscopy with Nanometer Resolution and Sub-Ångström Emitter Localization.. In: Advanced Materials. 2012, doi:10.1002/adma.201203033.
  9.  Stefan W. Hell: Far-Field Optical Nanoscopy. In: Science. Vol. 316, 2007, S. 1153-1158, doi:10.1126/science.1137395.
  10.  Volker Westphal, Silvio O. Rizzoli, Marcel A. Lauterbach, Dirk Kamin, Reinhard Jahn, Stefan W. Hell: Video-Rate Far-FieldOptical Nanoscopy Dissects Synaptic Vesicle Movement. In: Science. Vol. 320, 2008, ISSN 0036-8075, S. 246-249, doi:10.1126/science.1154228.
  11.  Volker Westphal, Marcel A. Lauterbach, Angelo Di Nicola, Stefan W. Hell: Dynamic far-field fluorescence nanoscopy. In: New Journal of Physics. 9, 2007, S. 435ff., doi:10.1088/1367-2630/9/12/435.
  12.  Marcel A. Lauterbach, Chaitanya K. Ullal, Volker Westphal, and Stefan W. Hell: Dynamic Imaging of Colloidal-Crystal Nanostructures at 200 Frames per Second. In: Langmuir. 26, 2010, S. 14400-14404., doi:10.1021/la102474p.