Tandem Affinity Purification

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Schema der TAP.

Die Tandem Affinity Purification (TAP) beschreibt die Proteinreinigung unter Verwendung zweier verschiedener chromatographischer Aufreinigungsmethoden. Bei einer Verwendung zweier verschiedener Protein-Tags können beispielsweise zwei verschiedene Affinitätschromatographien durchgeführt werden.[1] Im erweiterten Sinne umfasst die Tandem Affinity Purification alle seriellen Aufreinigungsverfahren, die auf der Affinität des aufzureinigenden Materials zur stationären Phase beruhen.[2]

TAP-Tag[Bearbeiten]

Ab dem Jahr 1999 wurden Tandem Affinity Purification Tags für Proteine entwickelt, welches aus zwei verschiedenen, aufeinander folgenden Protein-Tags bestehen.[3][4] Dessen äußeres (N- oder C-terminales) Protein-Tag wird in der ersten Säule nach Entfernung unerwünschter Bestandteile aus dem Zellaufschluss durch die Protease TEV gespalten, wodurch das gewünschte Protein (ohne sein äußeres Protein-Tag), die TEV-Protease und einige restliche Kontaminationen von der Chromatographiesäule eluieren. Die TEV-Protease aus dem Tobacco Etch Virus hat eine längere Erkennungssequenz (Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-(Gly/Ser) bzw. ENLYFQ(G/S)), um das aufzureinigende Protein nicht an anderen Stellen zu zerschneiden. Meistens wird zur Entfernung der TEV-Protease und restlicher Kontaminationen als zweites, innenliegendes Protein-Tag das CaM-Tag oder ein Biotin-basiertes Tag verwendet, da deren Elutionsbedingungen nicht denaturierend sind und die Bestandteile des Elutionspuffers (z. B. EGTA, Biotin) wenig bei einer folgenden Verwendung stören.

Die Wahl des TAP-Tags und das N- oder C-terminale Einfügen wird durch den Erhalt der biologischen Aktivität des Proteins bestimmt, da manche Kombinationen zu einer fehlerhaften Proteinfaltung und somit geminderter Funktion führen können.[5][6] Daher wird der Einfluss der Position des TAP-Tags auf die Funktion des Fusionsproteins experimentell bestimmt.

Nachdem nur wenige Kombinationen hohe Proteinmengen und Ausbeuten der Proteinreinigung erlauben,[7] werden heute vereinzelte Kombinationen eingesetzt, z. B. das SBP-CBP-Tag (InterPlay), das FLAG-HA-Tag, das 3xFLAG-His-Tag, das ProtA-ProtC-Tag, das ProtG-SBP-Tag, das 2xFLAG-ProtA-Tag, das His-2xStrepII-Tag, das SBP-HA-Tag und das SBP-His-Tag.[7]

Anwendungen[Bearbeiten]

Die Tandem Affinity Purification wird unter anderem zur Reduktion der Reinigungsschritte bei der Proteinreinigung eingesetzt. In Kombination mit der Massenspektrometrie oder mit einem Western Blot können Proteine identifiziert und Protein-Protein-Interaktionen längerer Verweildauer nachgewiesen werden.

Literatur[Bearbeiten]

Einzelnachweise[Bearbeiten]

  1. J. T. Kadonaga, R. Tjian: Affinity purification of sequence-specific DNA binding proteins. In: Proc Natl Acad Sci U S A (1986), Band 83(16), S. 5889–5893. PMID 3461465; PMC 386402 (freier Volltext).
  2. M. de Frutos, F. E. Regnier: Tandem chromatographic-immunological analyses. In: Anal Chem. (1993), Band 65(1), S. 17A-25A. PMID 8420386.
  3. G. Rigaut, et al.: A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. In: Nature Biotechnology. 17, Nr. 10, 1999, S. 1030–1032. doi:10.1038/13732. PMID 10504710.
  4. O. Puig, et al.: The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. In: Methods. 24, Nr. 3, 2001, S. 218–229. doi:10.1006/meth.2001.1183. PMID 11403571.
  5. O. Puig, F. Caspary, G. Rigaut, B. Rutz, E. Bouveret, E. Bragado-Nilsson, M. Wilm, B. Séraphin: The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. In: Methods (2001), Band 24(3), S. 218–229, PMID 11403571.
  6. A. C. Gavin, P. Aloy, P. Grandi, R. Krause et al.: Proteome survey reveals modularity of the yeast cell machinery. In: Nature (2006), Band 440, S. 631–636, PMID 16429126.
  7. a b Y. Li: The tandem affinity purification technology: an overview. In: Biotechnol Lett. (2011), Band 33(8), S. 1487–1499, PMID 21424840.