UV/VIS-Spektroskopie

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Die UV/Vis-Spektroskopie ist eine Spektroskopie, die elektromagnetische Wellen des ultravioletten (UV) und des sichtbaren (englisch visible, VIS) Lichts nutzt. Die Methode ist auch unter UV/VIS-Spektralphotometrie bekannt.

UV-VIS-NIR-Spektrum eines ein Zentimeter dicken Rubin-Kristalls

Prinzip[Bearbeiten]

Moleküle werden mit elektromagnetischen Wellen im Bereich des sichtbaren und ultravioletten Lichts bestrahlt, dabei werden Valenzelektronen (beispielsweise die p- und d-Orbitalen der äußeren Schalen) angeregt, das heißt, in ein höheres Energieniveau angehoben.

Um ein Elektron beispielsweise von einem besetzten (HOMO) auf ein unbesetztes, höheres Orbital (LUMO) anzuheben, muss die Energie des absorbierten Photons genau der Energiedifferenz zwischen den beiden Energieniveaus entsprechen. Über den Zusammenhang

 E = h \cdot f = \frac { h \cdot c } { \lambda }

kann die Wellenlänge des absorbierten Lichts für die aufzuwendende Energie berechnet werden, wobei E die Energie, h das plancksche Wirkungsquantum, c die Lichtgeschwindigkeit, f die Frequenz und \lambda die Wellenlänge der elektromagnetischen Welle sind. Dieser Zusammenhang wird manchmal auch als Einstein-Bohr-Gleichung bezeichnet.[1] Näherungsweise lässt sich dieser Zusammenhang in Form einer zugeschnittenen Größengleichung vereinfacht darstellen:

 E = h \cdot f = \frac { h \cdot c } { \lambda } \approx \frac{1239{,}8\,\mathrm{eV}}{\frac{\lambda}{\mathrm{nm}}}

Aufbau eines Zweistrahl-UV/Vis-Spektrometers[Bearbeiten]

Spektrometer für Messungen zwischen 200 und 1100 nm
Schematischer Aufbau eines Zweistrahl-UV/Vis-Spektrometers

Die Lichtquelle strahlt ultraviolettes, sichtbares und nahinfrarotes Licht im Wellenlängenbereich von etwa 200 nm bis 1100 nm aus. Im Monochromator wird zunächst die zur Messung ausgewählte Wellenlänge selektiert, worauf der Lichtstrahl auf den Sektorspiegel fällt. Der Sektorspiegel lässt das Licht abwechselnd durch die Messlösung und durch die Vergleichslösung fallen. Beide Lösungen befinden sich in sogenannten Küvetten. Die zwei Lichtstrahlen werden im Detektor empfangen und die Intensitäten im Verstärker verglichen. Der Verstärker passt dann die Intensität des Lichtstrahls aus der Vergleichslösung durch Einfahren der Kammblende der Intensität des Lichtstrahls aus der Messlösung an. Diese Bewegung wird auf einen Schreiber übertragen oder die Messwerte an eine Datenverarbeitung weitergegeben.

Zunehmend werden küvettenfreie UV/VIS-Spektrometer zur Konzentrationsbestimmung kleiner Probevolumina (unter 2 Mikroliter) von Proben höherer Konzentrationen eingesetzt.[2][3][4] Sogenannte Nanophotometer arbeiten mit Schichtdicken in Bereichen von 0,04 mm bis 2 mm. Sie benötigen keine Küvetten, keine Verdünnungen und können Proben mit einem Volumen von nur 0,3 µl analysieren (bei kleinster Schichtdicke), besitzen jedoch aufgrund der geringen Schichtdicke eine höhere Nachweisgrenze. Eine bewährte Technik basiert auf einer Kompression der Probe, welche somit unabhängig von der Oberflächenspannung und Verdunstung der Probe ist. Diese Methode findet Verwendung bei der Analyse von Nukleinsäuren (DNA, RNA, Oligonucleotide) und Proteinen (UV-Absorption bei 280 nm). Nach dem Lambert-Beer’schen Gesetz besteht ein Zusammenhang zwischen Absorption und Schichtdicke. Die Absorptionswerte bei den verschiedenen Schichtdicken (0,04 mm bis 2 mm) können somit berechnet werden. Geringe Schichtdicken wirken wie eine virtuelle Verdünnung der Probe, können jedoch nur bei entsprechend höheren Konzentrationen eingesetzt werden. Oftmals kann daher auf eine manuelle Verdünnung der Probe ganz verzichtet werden.

Chemische Beispiele[Bearbeiten]

Nützlich sind die π-zu-π*-Übergänge bei ungesättigten Kohlenwasserstoffen (beispielsweise Alkenen). Sie erfolgen über längerwelliges UV-Licht und sind einfach zu messen. Man erhält Informationen über die absorbierende Wellenlänge des Moleküls, die Struktur und Farbe. Dabei erfolgt die Lichtabsorption im umso längerwelligen Bereich, je größer die Anzahl der konjugierten Doppelbindungen ist.[5] Liegt die Energie der π-zu-π*-Übergänge im Bereich des sichtbaren Lichts, so erscheint das Molekül farbig. Dabei nimmt es immer die Komplementärfarbe des absorbierten Lichts an.

Bei den betrachteten Elektronenübergängen sind stets die folgenden Auswahlregeln zu beachten (u. a. Laporte-Regel):

1. Spinregel: Der Gesamtspin muss erhalten bleiben

Bsp.: Übergänge zwischen verschiedenen Spinmultiplizitäten sind verboten

2. Verbot von Übergängen gleicher Parität, Bsp:

  • verboten ist der Übergang 3s → 4s
  • erlaubt ist der Übergang 3s → 3p/4p
  • verboten ist der Übergang von gerade → gerade (Orbital)

Achtung: Verboten heißt nicht, dass diese Übergänge nicht vorkommen Bsp.: wegen der Vibrationskopplung der Kerne beobachtet

3. Überlappungsregel: nur bei ähnlicher Symmetrie und Größe

Siehe auch[Bearbeiten]

Einzelnachweise[Bearbeiten]

  1.  Christopher G. Morris, Academic Press: Academic Press dictionary of science and technology. Gulf Professional Publishing, 1992, ISBN 0122004000, S. 716 (eingeschränkte Vorschau in der Google-Buchsuche).
  2. H. Stranneheim, J. Lundeberg: Stepping stones in DNA sequencing. In: Biotechnology journal. Band 7, Nummer 9, September 2012, ISSN 1860-7314, S. 1063–1073, doi:10.1002/biot.201200153, PMID 22887891. PMC 3472021 (freier Volltext).
  3. P. O. Michel, C. Degen, M. Hubert, L. Baldi, D. L. Hacker, F. M. Wurm: A NanoDrop-based method for rapid determination of viability decline in suspension cultures of animal cells. In: Analytical biochemistry. Band 430, Nummer 2, November 2012, ISSN 1096-0309, S. 138–140, doi:10.1016/j.ab.2012.08.028, PMID 22960013.
  4. M. T. Kelliher, M. S. Piraino, M. E. Gemoules, C. A. Southern: A comparison of Förster resonance energy transfer analysis approaches for Nanodrop fluorometry. In: Analytical biochemistry. Band 441, Nummer 1, Oktober 2013, ISSN 1096-0309, S. 44–50, doi:10.1016/j.ab.2013.06.009, PMID 23811157.
  5. Joseph B. Lambert, Scott Gronert, Herbert F. Shurvell, David A. Lightner: Spektroskopie – Strukturaufklärung in der Organischen Chemie 2. Auflage, Pearson Deutschland, München 2012, ISBN 978-3-86894-146-3, S. 591–653.