Zinkfingernukleasen

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Zinkfingernukleasen (ZFN) sind künstlich hergestellte Restriktionsenzyme. Sie enthalten eine Zinkfingerdomäne, die an DNA bindet, und eine Nukleasedomäne, welche die DNA schneidet[1]. Die Zinkfingerdomäne kann so gebaut werden, dass sie eine bestimmte DNA-Sequenz erkennt. Das bedeutet, dass man mit ZFN ein komplexes Genom an einer ganz bestimmten Stelle schneiden kann und so einen zielgerichteten Einbau von fremder DNA ermöglicht.

Nukleasedomäne[Bearbeiten]

Zinkfingernukleasen enthalten in der Regel die unspezifisch schneidende Nukleasedomäne des Typ-IIS-Restriktionsenzyms FokI[2]. Diese Restriktionsdomäne ist nur aktiv, wenn sie dimerisiert vorliegt[3], weswegen zwei unterschiedlich gebaute ZFN-Monomere benötigt werden, um die DNA-Zielsequenz zu schneiden. Bei Standard-ZFN ist die Restriktionsdomäne über ihr N-terminales Ende an die DNA-bindende Zinkfingerdomäne gebunden. Damit die Nukleasedomänen dimerisieren und schneiden können, müssen die beiden unterschiedlichen ZFN-Monomere an die beiden unterschiedlichen Strängen der DNA binden, wobei ihre C-Termini einen bestimmten Abstand zueinander haben müssen [4].

Mehrere verschiedene Protein-Engineering-Techniken werden eingesetzt, um einerseits die Enzymaktivität und andererseits Affinität und Spezifität der Zinkfingerdomäne zu steigern. So wurde beispielsweise „Gerichtete Evolution“ angewandt, um FokI-Varianten zu erzeugen, die eine erhöhte Nukleaseaktivität aufweisen.[5] Zudem wurde strukturelles Design eingesetzt, um mittels Austausch geladener Aminosäuren im Dimerisierungsinterface der Nukleasedomäne sogenannte "obligat-heterodimere" FokI-Varianten zu erzeugen, die eine deutlich erhöhte Restriktionsspezifität aufweisen.[6][7][8][9]

DNA-Bindedomäne[Bearbeiten]

Die DNA-Bindedomäne enthält typischerweise zwischen drei und sechs unterschiedliche Zinkfingermotive, wobei jedes individuelle Zinkfingermotiv 3 bp erkennt. Binden die Zinkfingerdomänen perfekt an ihre Erkennungssequenz, so reichen drei Zinkfinger pro ZFN-Monomer aus, um einen bestimmten Lokus in einem komplexen Genom spezifisch zu erkennen. Mehrere verschiedene Strategien wurden entwickelt, um Cys2His2 Zinkfinger herzustellen, die an gewünschte Sequenzen binden.[10] Diese Methoden umfassen sowohl das modulare Zusammenbauen (siehe unten) als auch Selektionsstrategien, wie das Phagendisplay, das Yeast-1-Hybrid-Systeme, das Bacterial one-hybrid System, das Bacterial two-hybrid System oder zelluläre Selektionssysteme.

Die einfachste Methode neue Zinkfingerarrays zu erzeugen ist die Kombination von Zinkfingern mit bekannter Spezifität. Der am weitesten verbreitete modulare Zusammenbauprozess ist das Kombinieren von drei unterschiedlichen Zinkfingern, die jeweils 3 bp erkennen, zu einem neuen Zinkfingerarray, der 9 bp erkennt. Der Hauptnachteil dieser Methode ist, dass sich die Spezifität eines Zinkfingers je nach benachbartem Zinkfinger im Array verändern kann, weshalb "kontextabhängige" Selektionsstrategien üblicherweise Zinkfingerarrays mit einer höheren Spezifität erzeugen [11].

Anwendungen[Bearbeiten]

Mittlerweile wurden Zinkfingernukleasen im Zuge eines Genome Editing für die zielgerichtete Veränderung mehrerer Pflanzen- und Tiergenome eingesetzt, einschließlich Arabidopsis[12][13], Tabak[14][15], Soja[16], Mais[17], Fruchtfliege[18], Fadenwurm[19], Seeigel[20], Seidenraupe[21], Zebrafisch[22], Frosch[23], Maus[24], Ratte[25], Kaninchen[26], Schwein[27], Rind[28] und verschiedener Typen von Säugerzellen[29]. Darüber hinaus wurden ZFN in vivo in einem Mausmodell für Hämophilie angewandt[30] sowie in einer laufenden klinischen Studie mit dem Ziel, das CCR5-Gen in autologen CD4-positiven T-Zellen auszuschalten, als möglicher Behandlungsansatz zur Therapie der HIV-Infektion bzw. von AIDS.

Einzelnachweise[Bearbeiten]

  1. T. Cathomen, J. K. Joung: Zinc-finger nucleases: the next generation emerges. In: Mol. Ther.. 16, Nr. 7, Juli 2008, S. 1200–7. doi:10.1038/mt.2008.114. PMID 18545224.
  2. Y. G. Kim, J. Cha, S. Chandrasegaran: Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain. In: Proc Natl Acad Sci USA. 93, Nr. 3, 1996, S. 1156–60. doi:10.1073/pnas.93.3.1156. PMID 8577732. PMC: 40048 (freier Volltext).
  3. J. Bitinaite, D. A. Wah, A. K. Aggarwal, I. Schildkraut: FokI dimerization is required for DNA cleavage. In: Proc Natl Acad Sci USA. 95, Nr. 18, 1998, S. 10570–5. doi:10.1073/pnas.95.18.10570. PMID 9724744. PMC: 27935 (freier Volltext).
  4. DOI:10.1038/mt.2008.233
  5. doi:10.1016/j.jmb.2010.04.060
  6. DOI:10.1038/nbt1317
  7. DOI:10.1038/nbt1319
  8. DOI:10.1038/nmeth.1539
  9. DOI:10.1016/j.jmb.2010.10.043
  10. C. O. Pabo, E. Peisach, R. A. Grant: Design and Selection of Novel Cys2His2 Zinc Finger Proteins. In: Annu. Rev. Biochem.. 70, 2001, S. 313–340. doi:10.1146/annurev.biochem.70.1.313. PMID 11395410.
  11. DOI:10.1038/nmeth0508-374
  12. DOI:10.1073/pnas.0914991107
  13. DOI:10.1073/pnas.1000234107
  14. DOI:10.1007/s11103-008-9449-7
  15. DOI:10.1038/nature07845
  16. DOI:10.1104/pp.111.172981
  17. DOI:10.1038/nature07992
  18. DOI:10.1126/science.1079512
  19. DOI:10.1126/science.1207773
  20. DOI:10.1111/j.1365-2443.2010.01425.x
  21. DOI:10.1016/j.ibmb.2010.07.012
  22. DOI:10.1089/zeb.2008.9988
  23. DOI:10.1073/pnas.1102030108
  24. DOI:10.1016/j.cell.2010.01.003
  25. DOI:10.1126/science.1172447
  26. doi:10.1371/journal.pone.0021045
  27. DOI:10.1073/pnas.1106422108
  28. DOI:10.1038/cr.2011.153
  29. DOI:10.1038/gt.2008.145
  30. DOI:10.1038/nature10177

Weblinks[Bearbeiten]