Feld-Fluss-Fraktionierung

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Die Feld-Fluss-Fraktionierung (englisch field-flow fractionation; abgekürzt: FFF) ist eine Technik der analytischen Chemie. Die Feld-Fluss-Fraktionierung zeigt Parallelen zur Flüssigchromatographie und Gel-Permeations-Chromatographie. Die Trennung findet hier jedoch nicht in Säulen, sondern in der Regel in Flusskanälen statt.

Eigenschaften[Bearbeiten]

Typische Anwendungen sind die Analyse von Nanopartikeln, Makromolekülen wie synthetischen Polymeren, Biopolymeren (z. B. Polysaccharide) und Proteinen. Ein Vorteil aller FFF-Systeme ist das über die Software frei einstellbare Trennfeld. Somit können verschiedene Proben hintereinander ohne Säulenwechsel vermessen werden. In den FFF-Systemen treten kaum Wechselwirkungen oder Scherkräfte auf; somit sind die Systeme für schwierigste Proben geeignet, durch ein Hochtemperatur-FFF-System wird z. B. Polyethylen analysiert. Eine weitere Form der Feldflussfraktionierung ist die Hohlfaser-FFF (HF5).[1]

Geschichte[Bearbeiten]

Die Technik wurde im Jahr 1966 von John Calvin Giddings (* 1930, † 1996) an der University of Utah in Salt Lake City, USA erfunden und patentiert.[2]

Giddings forschte unter anderem im Bereich der Chromatographie. Bekannt wurde er jedoch für seine Arbeiten auf dem Gebiet der Feld-Fluss-Fraktionierung. Er war Gründer des „Field-Flow Fractionation Research Center“ (FFFresearch Center) an der University of Utah. Dort entwickelte und beschrieb er zusammen mit seinen Mitarbeitern und Kollegen in mehreren Publikationen die „Theory der Field-Flow Fractionation“ und auch die meisten der bislang bekannten Varianten der Field-Flow Fractionation. Giddings und sein Team entwickelten dort zunächst die Thermal Field-Flow Fractionation (thermische Feld-Fluss-Fraktionierung) im Jahr 1969,[3] gefolgt von der Sedimentation Field-Flow Fractionation (Sedimentations-Feld-Fluss-Fraktionierung) im Jahr 1974,[4] der Flow Field-Flow Fractionation (Fluss-Feld-Fluss-Fraktionierung)[5] 1976 und schließlich der Split Flow Thin Cell Fractionation (SPLITT) 1985.[6] Die von Giddings 1986 gegründete Firma zur Kommerzialisierung der FFF-Technik FFFractionation wurde 2001 mit dem Unternehmen Postnova fusioniert.[7]

Prinzip[Bearbeiten]

Die Field-Flow Fractionation ist eine Trennmethode mit unterschiedlichen Varianten. Diese FFF-Varianten verwenden alle das gleiche generelle Trennprinzip, jedoch unter Anwendung unterschiedlicher Trennfelder bzw. -kräfte. Je nach eingesetztem Trennfeld, spricht man daher von Flow Field-Flow Fractionation, Sedimentation Field-Flow Fractionation, Thermal Field-Flow Fractionation oder Gravimetric Field-Flow Fractionation. Es gibt auch eine präparative Variante, welche Split Flow Thin Cell Fractionation (auch SPLITT Field-Flow Fractionation) genannt wird. Insgesamt bietet die FFF-Methode eine schnelle, schonende und hochauflösende Trennung von partikulären Substanzen in flüssigen Medien im Größenbereich von 1 nm bis 100 µm und 1 kDa bis in den Megadalton-Bereich. Dabei läuft die Trennung ohne Säule in einem offenen, flachen und laminar durchströmten Trennkanal ab, der keinerlei stationäre Phase mehr enthält. Aufgrund des parabolischen Strömungsgeschwindigkeitsprofils innerhalb des Kanals nimmt die absolute Fließgeschwindigkeit von der Kanalober- bzw. Kanalunterseite her zum Kanalmittelpunkt hin zu, wobei im Zentrum des Kanals die höchste Strömungsgeschwindigkeit herrscht.

Je nach eingesetzter Variante der Feld-Fluss-Fraktionierung werden unterschiedliche Trennfelder eingesetzt, wie z. B. ein zweiter Flüssigkeitsstrom (Flow FFF), Zentrifugalkräfte (Sedimentation FFF), Temperaturgradienten (Thermal FFF) oder auch nur die Gravitation der Erde (Gravitational FFF). Diese Trennfelder werden dabei üblicherweise im rechten Winkel zur laminaren Kanalströmung angelegt. Unter dem Einfluss dieser Trennfelder und der entgegengerichteten Diffusion der zu trennenden Teilchen stellt sich ein dynamisches Gleichgewicht der Kräfte ein. Für kleinere Teilchen mit stärkerer Eigendiffusion liegt diese Gleichgewichtslage räumlich höher im Strömungskanal als für größere Teilchen mit geringerer Diffusion. Aufgrund der im Kanal vorherrschenden parabolischen Strömung befinden sich die kleineren Teilchen im zeitlichen Mittel in schnelleren Strömungslinien und werden zeitlich vor den größeren Teilchen aus dem Kanal eluiert. Koppelt man die FFF-Trennung mit Chromatographie-Detektoren, wie z. B. Massenspektrometern, Lichtstreuungs- und Absorptionsphotometern, Brechungsindexmessung oder Fluoreszenzspektroskopie, werden sogenannte Fraktogramme erhalten, welche ähnlich einem Chromatogramm zu bewerten sind. Die Besonderheit bei einem Fraktogramm ist jedoch, dass die Peaks mit zunehmender Retentionszeit eine zunehmende Partikelgröße bzw. eine zunehmende molare Masse repräsentieren, da die Trennung in der Field-Flow Fractionation größenbasiert abläuft und nicht auf der Wechselwirkung zwischen einer mobilen und einer stationären Phase beruht, wie es bei der Chromatographie der Fall ist.

Aufbau eines FFF-Systems[Bearbeiten]

Die wesentlichen Bestandteile eines FFF-Systems sind ein bis vier Pumpen, Injektionssystem, Trennkanal und verschiedene Detektoren. Die Pumpe saugt das Laufmittel an und erzeugt einen konstanten Fluss durch den Trennkanal, während ein Trennfeld herrscht. Häufig wird das Laufmittel durch einen sogenannten Inline-Degasser gesaugt, der gelöste Gase entfernt. Nach der Pumpe steht das Injektionssystem, entweder manuell oder ein Autosampler. Hier findet die Probe ihren Weg in das System. Im darauf folgenden Trennkanal wird die Probe je nach Trennfeld gemäß ihren Eigenschaften (hydrodynamischer Radius, Molmasse) aufgetrennt. Die verschiedenen Detektoren liefern dann je nach Art bestimmte Aussagen. Bei einer analytische Trennung landet der gesamte Fluss (inklusive Probe) in einem Abfallgefäß. Der Fluss kann aber bei einer präparativen Trennung auch in einzelnen Gefäßen aufgefangen werden.

Die einfachen Systeme, die nur eine Pumpe verwenden, sind weniger bedienerfreundlich, störanfälliger und wartungsintensiver als solche, bei denen mehrere Pumpen zum Einsatz kommen. Bei der fortgeschrittenen 3-Pumpen-Technik werden alle benötigten Flüsse nicht durch die Aufteilung eines einzigen Pumpenflusses generiert. 3-Pumpen-Systeme setzen FFF-optimierte Pumpen mit sehr konstanten und fein regelbaren Flussraten ein. Zudem können nur Systeme ohne Massenflussreglern, also solche, die drei Pumpen verwenden, echte Metallfreiheit generieren, da die Probe zu keiner Zeit mit Metall in Berührung kommt. Moderne 3-Pumpen-Systeme verwenden einen eigenen Focus-Port im Kanal für die Fokussierung der Probe. Dieser ist unabhängig vom Auslass-Port um eine Umkehr der Flussströme im Kanal nach dem Fokussieren zu verhindern. Stattdessen wird der Fokus-Fluss langsam und stetig gesenkt und im gleichen Maß der laminare Fluss aufgebaut. Die Druckverhältnisse im Kanal bleiben dabei immer konstant. Ein „Schwapp-Effekt“ und damit eine Verwirbelung der Probe, die eine Verschlechterung des Trennresultates bewirken würde, wird so verhindert. Zudem werden keine Ventile im Flusspfad zu den Detektoren benötigt, welche wiederum durch die Probe verstopfen könnten.

Trennsysteme[Bearbeiten]

Grundsätzlich wird zwischen fünf Systemen unterschieden.

  1. Fluss-Feldflussfraktionierung (F4)
    1. Symmetrischer-Fluss-Feldflussfraktionierung (SF4), bei ihr besteht die Ober- und die Unterseite des Kanals aus durchlässigen Fritten durch welche der Querfluss geleitet wird
    2. Asymmetrischer-Fluss-Feldflussfraktionierung (AF4), bei ihr verwendet man üblicherweise einen Kanal der als obere Begrenzung eine feste undurchlässige Wand besitzt. Wie bei der Symmetrischer-Fluss-Feldflussfraktionierung auch, besteht die untere Kanalbegrenzung aus einer porösen Fritte mit einer darauf befindlichen Membran
    3. Hohlfaser-Fluss-Feldflussfraktionierung (HF5, hollow-fiber flow field-flow fractionation): Hohlfaser aus semipermeablem Material ersetzt den Trennkanal. Hohe Sensitivität[1] bei niedrigen Flussraten und Volumina, daher auch gut mit Massenspektrometrie als Detektionsmethode kombinierbar.
  2. Sedimentations-Feldflussfraktionierung (SF3), welche einen rotierenden Ringkanal verwendet, wobei das Trennfeld durch die Zentrifugalkraft erzeugt wird, auch Zentrifugal FFF genannt
  3. thermische Feldflussfraktionierung (ThFFF), welche die thermische Diffusion zur Erzeugung einer Retention verwendet

Die AF4 ist die derzeit am häufigsten angewandte Form der Feldflussfraktionierung, während SF4, SF3 und ThFFF in immer mehr Applikationen Anwendung findet.

Detektoren[Bearbeiten]

Als Detektoren finden Brechungsindex-(auch RI-Detektor von engl. refractive index), Ultraviolett- (UV-) und Infrarot-Detektoren (IR) sowie Viskosimeter und Lichtstreudetektoren Einsatz. Generell unterscheidet man bei den Detektoren die so genannten Konzentrationsdetektoren, deren Signal proportional zur Konzentration ist (RI, UV und IR) von den molekülmassensensitiven Detektoren (Viskosität, Lichtstreuung). Zur Ermittlung von Molmasse und Gyrationsradius eignen sich statische Lichtstreudetektoren, die auch als SLS oder MALS bezeichnet werden. Für die Ermittlung des hydrodynamischen Radius eignet sich die online Kopplung mit Detektoren, die nach dem Prinzip der dynamischen Lichtstreuung z. B. bei Mikro- oder Nanopartikeln die Partikelgröße bestimmen können. Seit einiger Zeit wird auch die Kopplung mit der Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-MS) zur Ermittlung der partikelgrößenabhängigen Verteilung der elementaren Zusammensetzungen eingesetzt.

Kalibrierung[Bearbeiten]

Konventionelle Kalibrierung unter Verwendung eines Konzentrationsdetektors: Zur Kalibrierung werden Polymerstandards mit niedrigen Polydispersitäten eingesetzt. Als Ergebnis erhält man relative molare Massen.

Bei Verwendung eines Konzentrationsdetektors in Verbindung mit einem Viskositätsdetektor: Zur Kalibrierung werden Polymerstandards mit niedrigen Polydispersitäten eingesetzt und eine Kalibrationskurve Log (molare Masse × intrinsische Viskosität) aufgestellt. Da das Produkt von (molarer Masse × intrinsische Viskosität) proportional zum hydrodynamischen Radius ist, lassen sich so die relativen bzw. absoluten molaren Massen berechnen.

Lichtstreudetektion[Bearbeiten]

Durch Einsatz eines Lichtstreudetektors entfällt das Aufstellen einer Kalibrationskurve. Der Lichtstreudetektor misst direkt die absoluten molaren Massen. Zur Auswertung ist zusätzlich ein Konzentrationsdetektor notwendig. Die Rayleigh-Gleichung beschreibt die Rayleigh-Streuung bzw. den Zusammenhang zwischen der gestreuten Lichtintensität, die durch das so genannte Rayleigh-Verhältnis R(θ) ausgedrückt wird, der Polymerkonzentration c und der gewichtsgemittelten Molekülmasse Mw. Dabei ist K eine optische Konstante und A2 der zweite Virialkoeffizient. Bei der Mehrwinkel-Lichtstreuung wird die Intensität des gestreuten Lichts aus mehreren Winkeln simultan gemessen und anhand der Daten mittels linearer Regression die Molmasse bestimmt. Dadurch wird klar, dass der Messbereich umso größer und die ermittelten Werte umso exakter sind, je mehr Messpunkte, also Winkel, für die Bestimmung herangezogen werden. Dabei ist es wichtig zu erwähnen, dass die Bestimmung der Molmassen absolut erfolgt, d. h. ohne Kalibrierung oder Bezug zu Standards. Die leistungsfähigsten Geräte arbeiten daher mit bis zu 18 Winkeln.[8][9] Aber nicht nur die Zahl der eingesetzten Winkel ist wichtig. Entscheidend für die Qualität der Messung ist ebenso das Signal-Rausch-Verhältnis des Systems. So kann man auch mit 3-Winkel-Geräten sehr präzise Messergebnisse erzielen, wenn es sich um kleine Molmassen handelt.

\frac{Kc}{R(\Theta)}= \frac{1}{M_w P(\Theta)}+2A_2c

Weiterführende Literatur[Bearbeiten]

Weblinks[Bearbeiten]

Einzelnachweise[Bearbeiten]

  1. a b  Christoph Johann, Stephan Elsenberg, Ulrich Roesch, Diana C. Rambaldi, Andrea Zattoni, Pierluigi Reschiglian: A novel approach to improve operation and performance in flow field-flow fractionation. In: Journal of Chromatography A. 1218, Nr. 27, 2011, S. 4126–4131, doi:10.1016/j.chroma.2010.12.077, PMID 21227436.
  2.  J. Calvin Giddings: A New Separation Concept Based on a Coupling of Concentration and Flow Nonuniformities. In: Separation Science. 1, Nr. 1, 1966, S. 123–125, doi:10.1080/01496396608049439.
  3.  G. H. Thompson, M. N. Myers, J. C. Giddings: Thermal field-flow fractionation of polystyrene samples. In: Analytical Chemistry. 41, Nr. 10, 1969, S. 1219–1222, doi:10.1021/ac60279a001.
  4.  J. Calvin Giddings, Frank J. F. Yang, Marcus N. Myers: Sedimentation field-flow fractionation. In: Analytical Chemistry. 46, Nr. 13, 1974, S. 1917–1924, doi:10.1021/ac60349a046.
  5.  J. C. Giddings, F. J. Yang, M. N. Myers: Flow-field-flow fractionation: a versatile new separation method. In: Science. 193, Nr. 4259, 1976, S. 1244–1245, doi:10.1126/science.959835.
  6.  J. Calvin Giddings: A System Based on Split-Flow Lateral-Transport Thin (SPLITT) Separation Cells for Rapid and Continuous Particle Fractionation. In: Separation Science and Technology. 20, Nr. 9–10, 1985, S. 749–768, doi:10.1080/01496398508060702.
  7. General Theory about Field-Flow Fractionation
  8. Absolute Molar Mass Characterisation. Abgerufen am 6. Mai 2011.
  9. Christoph Johann, Thomas Jocks: Die Hohlfaser-Feldfluss-Fraktionierung (Hf5): Verbesserte Leistungsfähigkeit bei der Auftrennung und Charakterisierung komplexer Proteingemische. In: LC/GC AdS. 6, Nr. 1, 2011, S. 12–16.