Hellfeldmikroskopie

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Hellfeld-mikroskopische Aufnahme eines gefärbten Querschnitts durch einen Pflanzenstängel (Zea).

Als Hellfeldmikroskopie werden Mikroskopierverfahren bezeichnet, bei denen sich das zu beobachtende Objekt in einem hellen Feld befindet und dieses helle Feld das mikroskopische Bild ausleuchtet. Farbige und dunkle Strukturen im Präparat absorbieren das Licht, so dass ein entsprechendes Abbild des Präparats entsteht. Hellfeldmikroskopie ist das älteste mikroskopische Verfahren. Der Begriff wurde geprägt in Abgrenzung zu der im 19. Jahrhundert aufkommenden Dunkelfeldmikroskopie. Aus der Lichtmikroskopie kommend findet die Bezeichnung auch in der Transmissionselektronenmikroskopie Anwendung.

In der Lichtmikroskopie kann das helle Feld erzeugt werden, indem das Licht, meist durch einen Kondensor gebündelt, durch das Präparat hindurch in das Objektiv fällt. Diese Durchlicht-Hellfeldmikroskopie wird unter anderem für farbige biologisch-medizinische Präparate verwendet. Sie ist das mit Abstand am weitesten verbreitete Mikroskopierverfahren. Einfache Mikroskope wie Schülermikroskope arbeiten generell nach diesem Prinzip.

Alternativ kann die Beleuchtung aus der Richtung des Objektivs auf das Präparat fallen, durch das Objektiv selbst oder seitlich an diesem vorbei. Diese Auflicht-Hellfeldmikroskopie ist in den Materialwissenschaften verbreitet, wo lichtundurchlässige Präparate untersucht werden.

Beleuchtung bei Durchlicht-Hellfeldmikroskopen[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

Um das Gesichtsfeld hell auszuleuchten gibt es zwei verbreitete Beleuchtunsverfahren. Die kritische Beleuchtung ist die historisch ältere. Sie wird heute noch in manchen sehr einfachen Mikroskopen verwendet. Die von August Köhler entwickelte Köhler'sche Beleuchtung erlaubt eine gleichmäßigere Beleuchtung des Präparats. Sie ist heute Standard in Routine- und Forschungsmikroskopen. Durchlicht-Hellfeldmikroskopie mit Köhlerscher Beleuchtung ist der Ausgangspunkt für die Anwendung von speziellen lichtmikroskopischen Kontrastverfahren wie Phasenkontrast und Differentialinterferenzkontrast.

Kritische Beleuchtung[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

Bei der kritischen Beleuchtung wird ein verkleinertes Abbild der Lichtquelle in der Präparateebene erzeugt. Wenn als Lichtquelle eine Glühbirne verwendet wird, wird also der Glühwendel mit Hilfe des Kondensors in der Schärfeebene abgebildet. Dadurch ist sichergestellt, dass das Präparat mit der maximal möglichen Helligkeit beleuchtet wird. Die Brennweite eines Mikroskopkondensors ist meist ziemlich kurz. Um ein Bild der Lichtquelle in der Schärfeebene des Mikroskops erzeugen zu können muss erstens der Kondensor dicht am Präparat positioniert sein. Zweitens muss die Lichtquelle vergleichsweise weit vom Kondensor entfernt sein, so dass sie deutlich vor seinem vorderen Brennebene liegt. Um zu verhindern, dass das Bild des Glühwendels die Erkennung von Präparatstrukturen erschwert, wird ein Mattglas-Filter in den Beleuchtungstrahlengang gelegt, unterhalb des Kondensors. Sollte dies nicht ausreichend sein kann der Kondensor etwas abgesenkt werden, so dass das Bild des Glühwendels unscharf wird.[1]

Schema der kritischen Beleuchtung mit einer Glühlampe als Lichtquelle. Von links nach rechts sind dargestellt die Lampe, der Kondensor, das Präparat, das Objektiv, das Okular und das Auge eines Beobachters. Um mehr Licht der Lampe zu nutzen kann kurz nach ihr noch ein Kollekotor (eine Sammellinse) eingebaut sein[2].

Wenn zur Beleuchtung keine Lampe, sondern ein Spiegel für Tageslicht eingesetzt wird, ist dieser meist auf einer Seite plan und auf der anderen Seite hohl. Der Hohlspiegel kann für Objektive mit geringer Vergrößerung eingesetzt werden, wenn der Kondensor entfernt wurde. Bei höheren Vergrößerungen muss die Beleuchtung auf einen kleineren Bereich des Präparats kondensiert werden. Dies geschieht mit dem Kondensor unter Verwendung des Planspiegels. Mit Tageslichtbeleuchtung kann es bei kritischer Beleuchtung zur Abbildung von Strukturen aus der Umgebung wie Fensterrahmen kommen. Auch hier hilft ein Mattglas-Filter unter dem Kondensor oder eine Kondensor-Absenkung.[1]

Köhlersche Beleuchtung[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

August Köhler beschäftigte sich Ende des 19. Jahrhunderts mit der Mikrofotografie, also der Fotografie mit Hilfe eines Mikroskops. Bei direkter Beobachtung durch das Okular war die ungleichmäßige Helligkeit des Gesichtsfeldes bei kritischer Beleuchtung vergleichsweise wenig störend, da das Präparat je nach Bedarf hin und her verschoben werden konnte. Bei der Mikrofotografie führte eine ungleichmäßige Ausleuchtung jedoch zu einer schlechten Bildqualität. Er entwickelte daher ein Verfahren, das eine gleichmäßige Helligkeit bei gleich hoher Gesamthelligkeit erlaubte. Er veröffentlichte dieses Verfahren, das heute nach ihm benannt ist, 1893[3]. Der Vorgang des Einstellens der Köhlerschen Beleuchtung wird als köhlern bezeichnet.[1][2]

Köhlersche Beleuchtung hat neben einer gleichmäßigen Gesichtsfeldausleuchtung noch einen weiteren Vorteil: Nur der Bereich des Präparats, der tatsächlich beobachtet wird, wird beleuchtet. Dadurch wird störendes Streulicht, das in benachbarten Bereichen entstehen würde, vermieden. Bei dieser Beleuchtungsart wird ein Bild der Lichtquelle nicht in der Präparateebene erzeugt, sondern in der Ebene der Blende unterhalb des Kondensors bezeichnet. Diese wird als Kondensorblene oder Aperturblende bezeichnet. In der Präparateebene wird dagegen ein Bild der Leuchtfeldblende scharf abgebildet. Diese Blende befindet sich in der Nähe der Lichtquelle, in der Regel ist sie im Mikroskopfuß fest eingebaut. Das Bild in der Präparateebene wird scharfgestellt, indem der Kondensor auf oder ab bewegt wird. Köhlersche Beleuchtung ist nur mit einer künstlichen Lichtquelle möglich.[1][2]

Verschränkte Strahlengänge bei der Köhlerschen Beleuchtung.

Ein geköhlertes Mikroskop hat zwei miteinander in Beziehung stehende Strahlengänge und jeder der beiden hat mehrere 'konjugierte Ebenen', das heißt was in einer der Ebenen scharf abgebildet ist, ist auch in den anderen konjugierten Ebenen scharf.

Der Abbildungsstrahlengang hat folgende konjugierte Ebenen: Leuchtfeldblende, Präparatebene, Zwischenbild, Retina des Beobachters. Um dies zu erreichen wird beim Vorgang des Köhlerns das Mikroskop zunächst auf zu beobachtende Strukturen im Präparat scharf gestellt, so dass diese im Zwischenbild und auf der Retina scharf sind. Dann wird die Leuchtfeldblende, die wie die Kondensorblende als Irisblende ausgeführt ist, zunächst zugezogen und der Kondensor wird in der Höhe so verstellt, dass der Leuchfeldblendenrand ebenfalls scharf abgebildet wird. Falls nötig kann der Kondensor anschließend zentriert werden, so dass das Bild der Öffnung der Leuchtfeldblende genau in der Mitte des Gesichtsfeldes liegt. Anschließend wird die Leuchtfeldblende gerade so weit geöffnet, dass ihr Rand eben nicht mehr sichtbar ist.
Die konjugierten Ebenen des Beleuchtungsstrahlengangs sind: Lichtquelle, Kondensorblende, hintere Brennebene des Objektivs, Pupille des Beobachters. [1][2]

Literatur[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

  • Dieter Gerlach: Das Lichtmikroskop. Eine Einführung in Funktion, Handhabung und Spezialverfahren für Mediziner und Biologen. 2. Auflage. Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1985, ISBN 3-13-530302-0.
  • Michael Volger (Hrsg.: Irene K. Lichtscheidl): Lichtmikroskopie online. Abgerufen im 22. Juli 2013 (Theoretische Einführung und Anleitung zur praktischen Anwendung an der Uni Wien. Auch als pdf-Datei verfügbar.).

Einzelnachweise[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

  1. a b c d e Dieter Gerlach: Das Lichtmikroskop. Eine Einführung in Funktion, Handhabung und Spezialverfahren für Mediziner und Biologen. Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1976, ISBN 3-13-530301-2, S. 64–71.
  2. a b c d Jörg Haus: Optische Mikroskopie Funktionsweise und Kontrastierverfahren. John Wiley & Sons, 2014, ISBN 978-3-527-41286-0, S. 17–21 (eingeschränkte Vorschau in der Google-Buchsuche).
  3. [[August Köhler (Optiker)|]]: Ein neues Beleuchtungsverfahren für mikrophotographische Zwecke. In: Zeitschrift für wissenschaftliche Mikroskopie. Band X., Nr. 4, 1893, S. 433–440 (online bei archive.org).