Lichtmikroskop

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„Großes Mikroskop“ von Carl Zeiss von 1879 mit Optiken berechnet von Ernst Abbe.

Lichtmikroskope (griechisch: μικρόν (micron) = klein+ σκοπεῖν (skopein) = etwas ansehen) sind Geräte, die stark vergrößerte Bilder von kleinen (oft für das Auge nicht sichtbaren) Strukturen oder Objekten durch die Ausnutzung optischer Effekte erzeugen.

Neben der konventionellen Lichtmikroskopie gibt es eine Vielzahl von lichtmikroskopischen Spezialverfahren, wie Phasenkontrast-, Interferenzkontrast-, Fluoreszenz-, Polarisations- und Konfokalmikroskopie.

Geschichte[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

Die älteste überlieferte Zeichnung, die mit Hilfe eines Mikroskops angefertigt wurde: Bienen. Francesco Stelluti, 1630.
Das zusammengesetzte Mikroskop von Robert Hooke, das er für die Arbeiten an seiner Micrographia (1665) benutzte und mit dem er die Zellen entdeckte, ist ein Auflichtmikroskop. Links die Beleuchtungseinrichtung, die auf das Objekt strahlt.

Das Prinzip der Vergrößerung durch mit Wasser gefüllte Glasschalen wurde bereits von den Römern beschrieben (Seneca) und Vergrößerungslinsen waren schon im 16. Jahrhundert bekannt.

Der niederländische Brillenschleifer Hans Janssen und sein Sohn Zacharias Janssen werden oft als die Erfinder des ersten zusammengesetzten Mikroskops im Jahr 1590 angesehen. Dies basiert jedoch auf einer Erklärung von Zacharias Janssen selbst aus der Mitte des 17. Jahrhunderts. Das Datum ist dabei fragwürdig, da Zacharias Janssen selbst erst 1590 geboren wurde. Galileo Galilei entwickelte 1609 das Occhiolino, ein zusammengesetztes Mikroskop mit einer konvexen und einer konkaven Linse. Allerdings hatte Zacharias Janssen ein Gerät mit dem gleichen Funktionsprinzip bereits ein Jahr zuvor auf der Frankfurter Messe vorgeführt. Galileis Mikroskop wurde von der „Akademie der Luchse“ in Rom gefeiert, die im Jahr 1603 von Federico Cesi gegründet worden war. Eine Zeichnung des Akademiemitglieds Francesco Stelluti von 1630 gilt als älteste Zeichnung, die mit Hilfe eines Mikroskops angefertigt wurde. Auf ihr sind drei Ansichten von Bienen (von oben, unten und von der Seite) sowie Detailvergrößerungen zu sehen. Die Biene kam im Wappen der Familie Barberini vor, zu der Papst Urban VIII. gehörte. Stelluti schrieb in ein Banner oberhalb der Abbildung: „Für Urban VIII. Pontifex Optimus Maximus […] von der Akademie der Luchse, und in ewiger Verehrung widmen wir Euch dieses Symbol“.[1]

Christiaan Huygens (1629–1695), ebenfalls Niederländer, entwickelte im späten 17. Jahrhundert ein einfaches Zwei-Linsen-Okularsystem. Es war achromatisch korrigiert, hatte also weniger Farbfehler und war deshalb ein großer Fortschritt bei der Verbesserung der Optik im Mikroskop. Okulare nach Huygens werden bis heute produziert, sind jedoch im Vergleich zu modernen Weitfeldokularen optisch deutlich unterlegen.

Auch Robert Hooke benutzte für die Zeichnungen seiner 1665 publizierten Micrographia ein zusammengesetztes Mikroskop (siehe Abbildung). Die stärksten Vergrößerungen, die er in seinem Buch darstellte, waren 50-fach. Stärkere Vergrößerungen waren nicht möglich, da sich die Abbildungsfehler, die in der Frontlinse (Objektiv) und im Okular entstanden, vervielfachten, so dass keine feineren Details zu erkennen waren.

Einlinsiges Mikroskop, genannt Wilsons Schraubrohrmikroskop. Um 1760. Ausführlichere Legende verfügbar.

Antoni van Leeuwenhoek (1632–1723) verfolgte daher einen anderen Ansatz. Die Vergrößerung einer Linse ist umso stärker, je stärker sie gewölbt ist. Kleine, annähernd kugelförmige Linsen haben daher die stärkste Vergrößerung. Leeuwenhoek war brillant im exakten Schleifen kleinster Linsen, einer Technik, die zuvor nur unzureichend beherrscht worden war. Seine einfachen Mikroskope mit nur einer Linse waren zwar unhandlich zu benutzen, doch da er nur mit einer Linse mikroskopierte, entfiel die Multiplikation der Abbildungsfehler. Seine Mikroskope hatten eine bis zu 270-fache Vergrößerung.[2] So entdeckte Leeuwenhoek die von ihm so genannten „Animalkulen“, einzellige Bakterien und Protozoen.

Im Jahre 1768 beschrieb der Michel Ferdinand d’Albert d’Ailly, Duc de Chaulnes (1714–1769) das erste eigens für Messzwecke konzipierte Messmikroskop.

Robert Brown benutzte noch 1830 ein einfaches Mikroskop und entdeckte damit den Zellkern und die Brownsche Molekularbewegung. Es dauerte 160 Jahre, bevor zusammengesetzte Mikroskope dieselbe Abbildungsqualität erzeugten wie Leeuwenhoeks einfaches Mikroskop.

Bis weit ins 19. Jahrhundert hinein wurden gute zusammengesetzte Mikroskope durch Ausprobieren und anhand von Erfahrungswerten hergestellt. Ernst Abbe erarbeitete um 1873 die zum Bau besserer Mikroskope erforderlichen, noch heute gültigen physikalischen Grundlagen. Als Folge gelang es zum ersten Mal, ein Objektiv herzustellen, dessen Auflösungsgrenze nicht mehr durch die Materialgüte, sondern durch die physikalischen Beugungsgesetze limitiert wurde. Diese physikalische Auflösungsgrenze wird als das Abbe-Limit bezeichnet. Produziert wurden die entsprechenden Mikroskope zusammen mit Carl Zeiss in dessen optischen Werkstätten. Dabei profitierten sie von den von Otto Schott entwickelten optischen Gläsern und dem von August Köhler entwickelten Beleuchtungsapparat zur Köhlerschen Beleuchtung.

Lichtmikroskop-Typen[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

Unterteilung nach Bauweise beziehungsweise Anwendung – Übersicht[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

  • Beim Auflichtmikroskop wird das Licht von der gleichen Seite eingestrahlt, von der auch beobachtet wird. Verwendung findet es bei undurchsichtigen Präparaten und in der Fluoreszenzmikroskopie. In Abgrenzung wird die üblichere Anordnung, bei der das Präparat durchstrahlt wird, als Durchlichtmikroskop bezeichnet.
  • Ein Stereomikroskop hat für beide Augen getrennte Strahlengänge, die das Präparat aus verschiedenen Winkeln zeigen, so dass ein dreidimensionaler Eindruck entsteht.
  • Ein Strichmikroskop ist eine Ablesevorrichtung an einem Theodolit, einem Winkelmessgerät in der Vermessungskunde.
  • Ein Operationsmikroskop wird von Ärzten im Operationssaal eingesetzt.
  • Ein Trichinoskop wird bei der Fleischbeschau zum Nachweis von Trichinen (Fadenwürmer) eingesetzt.
  • Ein Vibrationsmikroskop dient zur Untersuchung der Schwingung von Saiten bei Saiteninstrumenten.
  • Ein Messmikroskop hat eine Zusatzeinrichtung, die eine Vermessung des Präparats erlaubt.
  • Ein Computer-Mikroskop lässt sich zum Beispiel per USB-Kabel an einen Computer anschließen, der zur Anzeige der Abbildung benutzt wird.[3]

Einfache und zusammengesetzte Mikroskope[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

Als einfache Mikroskope werden optische Linsen bezeichnet, die eine starke Vergrößerung ermöglichen. Der Übergang zu einer im Prinzip genauso funktionierenden, aber schwächer vergrößernden Lupe ist dabei fließend. Die heute üblichen Mikroskope sind dagegen zusammengesetzte Mikroskope, die so heißen, weil sie aus zwei Linsensystemen zusammengesetzt sind: Das vorderste optische Element, das Objektiv (siehe auch Abbildung), erzeugt ein Zwischenbild, das vom Okular erneut vergrößert wird.

Durchlicht- oder Auflichtmikroskopie[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

Je nach angewendeter Beleuchtungstechnik kann ein Mikroskop für Durchlicht- oder Auflichtmikroskopie verwendet werden. Bei der Durchlichtmikroskopie wird das Licht durch das Präparat hindurchgeleitet, bevor es vom Objektiv des Mikroskops aufgefangen wird. Daher sind durchsichtige oder dünn geschnittene Präparate erforderlich. Bei der Auflichtmikroskopie wird das Licht entweder vom Mikroskop kommend durch das Objektiv auf das Präparat geleitet oder von der Seite eingestrahlt (schräge Beleuchtung). Das am Präparat reflektierte Licht wird wiederum vom Objektiv aufgefangen. Bei der Auflichtmikroskopie werden in der Regel undurchsichtige Präparate verwendet. Solche Präparate sind etwa in den Materialwissenschaften häufig, wo Probestücke eines Materials geschliffene und polierte oder auch angeätzte Oberflächen erhalten, die dann mikroskopisch untersucht werden.

Aufbau eines Durchlicht-Mikroskops[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

Bestandteile eines zusammengesetzten Durchlichtmikroskops einfacher Bauart: A) Okular, B) Objektiv, C) Objektträger, D) Kondensor, E) Objekttisch, F) Beleuchtungsspiegel

Die Baugruppen eines typischen Durchlicht-Mikroskops wirken wie folgt zusammen: Die dem Auge zugewandte Augenlinse (Okular, A) vergrößert ein Bild des Objekts (1. Vergrößerungsstufe, (z. B. 10-fach)). Das vom Okular vergrößerte Bild wird von der dem Objekt zugewandten Feldlinse, dem Objektiv, erzeugt (B). Das Objektiv bildet die 2. Vergrößerungsstufe. Moderne Mikroskope sind meist mit mehreren Objektiven ausgestattet, zwischen denen mit einem Revolver-Mechanismus gewechselt werden kann. Die Objektive haben typischerweise Vergrößerungen zwischen 2- und 12-fach. Die Gesamt-Vergrößerung des Mikroskops errechnet sich durch Multiplikation der Vergrößerungen der 1. und der 2. Vergrößerungsstufe.

Das Objekt ist bei Durchlicht-Mikroskopen üblicherweise auf dem gläsernen Objektträger (C) aufgebracht. Damit das Licht der unterhalb des Objektträgers angebrachten Lichtquelle (F) das Objekt optimal ausleuchtet, haben Durchlicht-Mikroskope ein gesondertes Linsensystem (D), den sogenannten Kondensor (siehe auch Köhler-Beleuchtung). Der Objektträger ist am Objekttisch (E) befestigt. Kondensor und Objekttisch können gemeinsam zum Scharfstellen des Objekts in senkrechter Richtung verschoben werden. Als Lichtquelle alter und sehr einfacher neuer Mikroskope dient ein Spiegel (F). Sonst wird eine elektrische Lichtquelle eingesetzt.

Unendlichoptiken[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

Die Objektive von älteren oder kleineren Mikroskopen sind angepasst an eine definierte Tubuslänge und erzeugen in einem genau definierten Abstand ein reelles Zwischenbild, das dann durch die Okularoptik vergrößert wird. Die Hersteller einigten sich auf eine Tubuslänge von 160mm, bei älteren Mikroskopen kann diese Tubuslänge abweichen. So fertigte die Firma Leitz/Wetzlar nach einem hauseigenen Standard von 170mm. Diese definierte Tubuslänge bringt allerdings einige Nachteile mit sich. So können optische Elemente und Baugruppen nicht einfach in den Strahlgang eingefügt werden, da z. B. einfach der Platz hierfür nicht ausreichte. Neuere Mikroskope sind daher mit einer sogenannten "Unendlichoptik" ausgestattet. In diesem Fall erzeugt das Objektiv kein reelles Zwischenbild, sondern das Licht verlässt das Objektiv als unendliche parallele Strahlen, was einen „unendlich“ langen Tubus ermöglicht. Somit können in den Strahlgang beliebig viele Zwischenelemente wie Filter, Strahlteiler etc. eingefügt werden. Da aus den parallel verlaufenden Lichtstrahlen kein Bild entstehen kann, befindet sich am Ende von unendlich-Tuben eine Tubuslinse. Diese erzeugt aus den parallelen Lichtstrahlen ein reelles Zwischenbild das dann wieder durch die Okularoptik vergrößert werden kann. Unendlich Optik-Objektive erkennt man in der Regel an dem aufgebrachten ∞ (Unendlichzeichen).

Aufrechte, umgekehrte oder inverse Mikroskope[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

Ein inverses Mikroskop lässt zwischen Kondensor und Tisch viel Raum für das Präparat

Aufrechtes Mikroskop ist eine allgemeine Bezeichnung für Mikroskope, bei denen das Objektiv von oben auf das Präparat schaut (wie in der Abbildung). Im Gegensatz dazu ist bei einem umgekehrten oder inversen Mikroskop das Objektiv unter dem Tisch angebracht, der vergrößerte Raum zwischen Beleuchtungseinheit und Tisch erlaubt das Mikroskopieren von Präparaten mit größerer Dicke (bis zu über 10 Zentimeter) sowie durch die Wände von Laborgefäßen hindurch. Mikroskope mit dieser Bauform sind ein unerlässliches Instrument für Untersuchungen an lebenden Zellen in Kulturgefäßen (Zellkultur), z. B. in der Patch-Clamp-Technik sowie bei Einsatz von Mikromanipulatoren, die von oben an das Präparat herangeführt werden.

Leistungsfähigkeit[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

Bei optimaler Gerätebeschaffenheit und der Verwendung von Öl-Immersion lassen sich mit klassischer Lichtmikroskopie, wie sie im Wesentlichen im 19. Jahrhundert entwickelt wurde, bestenfalls Objekte voneinander unterscheiden, die 0,2 bis 0,3 µm oder weiter voneinander entfernt sind.[4] Die erzielbare Auflösung ist dabei nicht durch die verfügbare Qualität der Geräte, sondern durch physikalische Gesetze bestimmt. Sie hängt unter anderem von der Wellenlänge des verwendeten Lichts ab.

Verfahren, die seit den 1990er Jahren entwickelt wurden und auf nicht-linearen Farbstoffeigenschaften beruhen, erlauben auch eine Auflösung unter diesem so genannten Abbe-Limit.

Physikalische Prinzipien der Lichtmikroskopie – Übersicht[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

Die folgenden neueren lichtmikroskopischen Entwicklungen erlauben eine Auflösung jenseits des klassischen Abbe-Limits

Durchlichtmikroskop[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

Vereinfachter Strahlengang im Mikroskop

Das grundlegende Ziel eines Lichtmikroskopes ist die Erhöhung der Vergrößerung bzw. der Auflösung von Details die mit dem bloßen Auge nicht wahrgenommen werden können. Der Grund hierfür sind physiologische Begrenzungen des menschlichen Sehapparates, welcher nur über einen begrenzten Brechkraft-Bereich verfügt und deshalb nicht in beliebig kleinen Abständen zum Objekt scharf abbilden kann. Weitere Beschränkung sind die unterschiedlichen Aberrationen, die das kleinste abbildbare Volumen begrenzen. Im Prinzip wird das Objekt vergrößert abgebildet (Bildvergrößerung) und dieses dann mit einer Lupe betrachtet, um dieses aus einer größeren „Nähe“ als es mit dem Auge möglich wäre betrachten zu können. Im letzten Schritt werden die Winkel vergrößert (Winkelvergrößerung). Lichtmikroskope werden häufig nur mit den Abkürzungsbuchstaben „LM“ angegeben.

Prinzip des zusammengesetzten Mikroskops[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

Das vom Objekt kommende Licht wird durch eine Kombination von mindestens zwei Linsensystemen, dem Objektiv (3) und dem Okular (1), optisch abgebildet. Dabei wird vom Objekt durch das Objektiv ein reelles Zwischenbild erzeugt, welches durch das Okular analog zur Lupe vergrößert betrachtet wird. Die Vergrößerung des Mikroskops ist das Produkt aus Objektivvergrößerung und Okularvergrößerung. Die Objektive sind in der Regel wechselbar, so dass die Vergrößerung der jeweiligen Aufgabenstellung angepasst wird. Der Objektivrevolver (2) ermöglicht den schnellen Objektivwechsel durch Drehen des jeweils gewünschten Objektivs in den Strahlengang. Die Fokussierung erfolgt durch Höhenverstellung des Tubus oder des Objekttischs. Dieser ist häufig auch mit einem verschiebbaren Objekthalter ausgestattet, um das beobachtete Objekt vor dem Objektiv zu positionieren.

Man unterscheidet die Durchlichtmikroskopie, bei der das Objekt transparent oder sehr dünn ist und von der dem Objektiv abgewandten Seite beleuchtet wird, und die Auflichtmikroskopie. Bei dieser wird durch Beleuchtung von der dem Objektiv zugewandten Seite die Oberfläche des Objekts untersucht. Bei der Auf- und Durchlichtmikroskopie unterscheidet man außer der normalen Hellfeldmikroskopie die Dunkelfeldmikroskopie und die Phasenkontrastmikroskopie.

Beleuchtungsoptik[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

Die Köhlersche Beleuchtung ist die übliche Methode einer Durchlichtanordnung. Sie besteht aus folgenden Elementen:

Zum Erreichen der optimalen Leistungsfähigkeit eines Mikroskops ist eine korrekte Abstimmung der Blendenabbildung und der Objektabbildung mit einem verketteten Strahlengang nötig. Das Einstellen dieser Abstimmung wird auch als Köhlern bezeichnet. Bei der Köhlerschen Beleuchtung bildet der Kollektor die Lichtquelle in die Aperturblende ab und gleichzeitig der Kondensor die Leuchtfeldblende in das Objekt.

Auflösung[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

Hauptartikel: Auflösung (Mikroskopie)

Zur Vergrößerung des Mikroskops siehe: Vergrößerung (Optik)

Mikroskopobjektiv: Achromat mit Numerischer Apertur 0,8 und 60-facher Vergrößerung
Mikroskopobjektiv im Querschnitt: Achromat mit Numerischer Apertur 0,65 und 40-facher Vergrößerung

Entscheidend für die Fähigkeit eines Mikroskops, Strukturen kleiner Objekte unterscheidbar abzubilden, ist (neben dem Kontrast) nicht die Vergrößerung, sondern die Auflösung. Dieser Zusammenhang ist nicht allein durch strahlenoptische Überlegung zu verstehen, sondern ergibt sich aus der Wellennatur des Lichts. Ernst Abbe erkannte als erster den entscheidenden Einfluss der Numerischen Apertur auf die Auflösung. Er gab als förderliche Vergrößerung

an. Dies bedeutet, dass die kleinsten vom Objektiv aufgelösten Strukturen nach der Abbildung durch das Okular im Auge noch aufgelöst werden können, also etwa unter einem Winkel von 2′ (Bogenminuten) erscheinen. Wird die Vergrößerung höher gewählt (z. B. durch ein Okular mit hoher Vergrößerung), wird das Bild des Objekts zwar noch größer dargestellt, aber es sind keine weiteren Objektdetails erkennbar. Objektive und Okulare müssen also aufeinander abgestimmt sein.

Nach den Gesetzen der Wellenoptik ist die Auflösung des Lichtmikroskops durch die Größe der Wellenlänge der Beleuchtung beschränkt, siehe Numerische Apertur.

Auflösungen jenseits des Abbe-Limits[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

Vergleich des Auflösungsvermögens von konfokaler Laser-Scanning Mikroskopie (oben) und 3D-SIM-Mikroskopie (unten). Zellkernporen (anti-NPC, rot), Zellkernhülle (anti-Lamin B, grün), sowie Chromatin (DAPI, blau) wurden in einer Mauszelle simultan angefärbt. Der Maßstabsbalken entspricht 1 µm.

1971 veröffentlichten Thomas Cremer und Christoph Cremer theoretische Berechnungen über die Erzeugung eines idealen Hologramms zur Überwindung der Beugungsgrenze, das ein Interferenzfeld in allen Raumrichtungen festhält, ein sogenanntes Hologramm.[5][6]

Seit den 1990er Jahren wurden einige Methoden entwickelt, die eine optische Auflösung jenseits des Abbe-Limits ermöglichen. Sie basieren alle auf Fluoreszenzmikroskopie und sind daher in diesem Artikel im Abschnitt Verfahren mit erhöhter Auflösung erwähnt.

Siehe auch[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

 Wikibooks: Lichtmikroskopie – Lern- und Lehrmaterialien

Weblinks[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

Zur Funktionsweise von Lichtmikroskopen:

Sammlungen historischer Lichtmikroskope:

  • Museum optischer Instrumente: Historische Mikroskope: Entwicklung des wissenschaftlichen Mikroskopbaus in Deutschland mit Geschichten zu ihren Herstellern und Anwendern, illustriert mit über 3000 Fotos
  • Mikroskop-Museum: Die Geschichte des Lichtmikroskops von Anfang an bis heute in Wort und Bild. In der Galerie werden weit über 100 Mikroskope verschiedener Hersteller vorgestellt.

Einzelnachweise[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

  1. Stephen Jay Gould: Die Lügensteine von Marrakesch: Vorletzte Erkundungen der Naturgeschichte. S. Fischer, Frankfurt 2003, ISBN 3-10-027813-5, S. 52–53.
  2. Hugo Freund, Alexander Berg: Geschichte der Mikroskopie. Leben und Werk großer Forscher. Band I: Biologie. Umschau Verlag, Frankfurt am Main 1963, S. 4–5.
  3. Computermikroskop: Die bessere Webcam, test.de, 23. Januar 2003 (online abgerufen am 26. Februar 2013).
  4. Ernst Abbe: Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der Mikroskopischen Wahrnehmung. In: Archiv für Mikroskopische Anatomie 9, 1873, S. 413–468.
  5. Deutsche Patentschrift DE 2116521.
  6. Konstruktionsplan 1978: Konfokales Laser Scanning Fluoreszenzmikroskop mit hoher Auflösung und Schärfentiefe/4Pi Point Hologram (PDF; 83 kB).