Spannungsabhängiger Farbstoff

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Ein spannungsabhängiger Farbstoff (auch potentiometrischer Farbstoff, spannungssensitiver Farbstoff) ist ein Farbstoff, der bei Anlegen einer Spannung seine Farbe ändert.[1]

Eigenschaften[Bearbeiten]

Spannungsabhängige Farbstoffe werden unter anderem in der Elektrophysiologie und Neurobiologie verwendet, um Änderungen im Membranpotential wie Aktionspotentiale mikroskopisch verfolgen zu können,[2] z. B. in Neuronen und Myozyten.[3] Dabei zeigt sich der Ursprung, die Richtung und die Ausbreitungsgeschwindigkeit des Aktionspotentials. Die Änderung der Farbe zeigt sich bei einer Spannungsänderung durch eine Änderung des Extinktionskoeffizienten oder durch eine Verschiebung des Maximums im Absorptionsspektrum bzw. bei Fluoreszenzfarbstoffen durch eine Verschiebung des Maximums im Emissionsspektrum. Der genaue Mechanismus der Farbänderung bzw. -zunahme der verschiedenen Farbstofftypen ist noch unbekannt.[4] Bei spannungsabhängigen Merocyaninfarbstoffen erfolgt keine Verschiebung der Wellenlänge, sondern nur eine Fluoreszenzzunahme.[4] Daher wurden verschiedene Mechanismen diskutiert, z. B. die Dislokation des Farbstoffs zwischen Membran und wässriger Umgebung, eine Änderung der Dielektrizität der umgebenden Biomembran oder Dimerisierungen und deren Dissoziation.[4] Dagegen erfolgt bei ANEP-Farbstoffen eine Verschiebung der spektralen Maxima.[5][6]

Der Farbumschlag kann durch eine Abnahme des Extinktionskoeffizienten bei der ursprünglichen Wellenlänge oder durch Zunahme des Extinktionskoeffizienten bei der Wellenlänge der veränderten Farbe verfolgt werden. Da spannungsabhängige Farbstoffe im Vergleich zu Elektroden weniger präzise in der Bestimmung der Spannungsänderung sind, werden sie meist dort eingesetzt, wo keine Elektroden eingeführt werden können, z. B. in Mitochondrien. Alternativ werden spannungsabhängige Reporterproteine verwendet, z. B. VSFP[7][8] oder PROPS.[9]

Im Vergleich zu Elektroden können viele Neuronen parallel beobachtet werden, einschließlich Richtung und Geschwindigkeit der Potentiale.[2] Der Vorgang ist teilweise reversibel, die Zellen können nach der Beobachtung mit Kulturmedium gespült werden, um den Farbstoff zu entfernen.[2] Die Reproduzierbarkeit, das Signal-Rausch-Verhältnis und die Sensitivität sind vergleichsweise geringer.[2] Die Diffusion durch Bindegewebe ist geringer als durch andere Gewebe.[2] Farbstoffe können unerwünschte pharmakologische Wirkungen haben, z. B. eine Steigerung der Photosensibilität.[2] Serumbestandteile im Kulturmedium können die Fluoreszenz mindern, weshalb meistens in einem isotonischen Puffer gefärbt wird.

Typen[Bearbeiten]

Slow-response probes (zu deutsch ‚langsamreagierende Sonden‘) ändern ihren Verteilungskoeffizienten nach Spannungsänderung und lagern sich dann erst in die Zellmembran ein, z. B. manche kationischen Cyanine (z. B. Merocyanin 540),[10] Rhodamine, und ionischen Oxonole (z. B. DiBAC4).

Fast-response probes (zu deutsch ‚schnellreagierende Sonden‘) sind meist amphiphile Farbstoffe mit aliphatischen Seitenketten, die sich in die Zellmembran einlagern und einem hydrophilen Rest mit dem Fluorophor, z. B. ANNINE-6,[11] ANNINE-6plus.[12][13] Spannungsabhängige Farbstoffe sind oftmals Aminonaphthylethenylpyridinfarbstoffe, z. B. di-4-ANEPPS (1-(3-Sulfonatopropyl)-4-[β-[2-(di-n-butylamino)-6-naphthyl]vinyl]pyridiniumbetain), di-8-ANEPPS und RH237.[14][15]

Geschichte[Bearbeiten]

Der spannungsabhängige Farbstoff Merocyanin 540 wurde erstmals 1976 von Guy Salama und Martin Morad veröffentlicht.[10] Die ANEP-Farbstoffe wurden ab 1985 von der Arbeitsgruppe um Leslie Loew beschrieben.[16]

Literatur[Bearbeiten]

  • Leslie M. Loew: Potentiometric dyes: Imaging electrical activity of cell membranes. In: Pure Appl. Chem. (1996), Band 68, Nr. 7, S. 1405–1409.

Einzelnachweise[Bearbeiten]

  1. L. D. Liao, V. Tsytsarev, I. Delgado-Martínez, M. L. Li, R. Erzurumlu, A. Vipin, J. Orellana, Y. R. Lin, H. Y. Lai, Y. Y. Chen, N. V. Thakor: Neurovascular coupling: in vivo optical techniques for functional brain imaging. In: Biomedical engineering online. Band 12, 2013, S. 38, ISSN 1475-925X. doi:10.1186/1475-925X-12-38. PMID 23631798. PMC 3655834 (freier Volltext).
  2. a b c d e f Baker BJ, Kosmidis EK, Vucinic D, et al.: Imaging brain activity with voltage- and calcium-sensitive dyes. In: Cell. Mol. Neurobiol.. 25, Nr. 2, March 2005, S. 245–82. doi:10.1007/s10571-005-3059-6. PMID 16050036.
  3. Cohen, Lawrence B and Salzberg, Brian M, Optical Measurement of Membrane Potential. In: Reviews of Physiology, Biochemistry and Pharmacology, vol. 83, pp. 35-88, 1978; doi:10.1007/3-540-08907-1_2
  4. a b c G. Salama, B. R. Choi: Images of Action Potential Propagation in Heart. In: News in physiological sciences: an international journal of physiology produced jointly by the International Union of Physiological Sciences and the American Physiological Society. Band 15, Februar 2000, S. 33–41, ISSN 0886-1714. PMID 11390873. PDF.
  5. David Robinson, Besley, Nicholas A.; O’Shea, Paul; Hirst, Jonathan D.: Di-8-ANEPPS Emission Spectra in Phospholipid/Cholesterol Membranes: A Theoretical Study. In: The Journal of Physical Chemistry B. 115, Nr. 14, 14. April 2011, S. 4160–4167. doi:10.1021/jp1111372.
  6. W. Y. Kao, C. E. Davis, Y. I. Kim, J. M. Beach: Fluorescence emission spectral shift measurements of membrane potential in single cells. In: Biophysical journal. Band 81, Nummer 2, August 2001, S. 1163–1170, ISSN 0006-3495. doi:10.1016/S0006-3495(01)75773-6. PMID 11463657. PMC 1301585 (freier Volltext).
  7. H. Mutoh, A. Perron, W. Akemann, Y. Iwamoto, T. Knöpfel: Optogenetic monitoring of membrane potentials. In: Experimental Physiology. Band 96, Nummer 1, Januar 2011, S. 13–18, ISSN 1469-445X. doi:10.1113/expphysiol.2010.053942. PMID 20851856. PDF.
  8. H. Mutoh, W. Akemann, T. Knöpfel: Genetically engineered fluorescent voltage reporters. In: ACS Chemical Neuroscience. Band 3, Nummer 8, August 2012, S. 585–592, ISSN 1948-7193. doi:10.1021/cn300041b. PMID 22896802. PMC 3419450 (freier Volltext).
  9. J. M. Kralj, D. R. Hochbaum, A. D. Douglass, A. E. Cohen: Electrical spiking in Escherichia coli probed with a fluorescent voltage-indicating protein. In: Science (New York, N.Y.). Band 333, Nummer 6040, Juli 2011, S. 345–348, ISSN 1095-9203. doi:10.1126/science.1204763. PMID 21764748.
  10. a b G. Salama, M. Morad: Merocyanine 540 as an optical probe of transmembrane electrical activity in the heart. In: Science (New York, N.Y.). Band 191, Nummer 4226, Februar 1976, S. 485–487, ISSN 0036-8075. PMID 1082169.
  11. B. Kuhn, P. Fromherz, W. Denk: High sensitivity of Stark-shift voltage-sensing dyes by one- or two-photon excitation near the red spectral edge. In: Biophysical journal. Band 87, Nummer 1, Juli 2004, S. 631–639, ISSN 0006-3495. doi:10.1529/biophysj.104.040477. PMID 15240496. PMC 1304385 (freier Volltext).
  12. P. Fromherz, G. Hübener, B. Kuhn, M. J. Hinner: ANNINE-6plus, a voltage-sensitive dye with good solubility, strong membrane binding and high sensitivity. In: European biophysics journal : EBJ. Band 37, Nummer 4, April 2008, S. 509–514, ISSN 0175-7571. doi:10.1007/s00249-007-0210-y. PMID 17687549. PMC 2755735 (freier Volltext).
  13. Bu G., et al: Uniform action potential repolarization within the sarcolemma of in situ ventricular cardiomyocytes.. In: Biophysical Journal. 96, Nr. 6, March 2009, S. 2532–2546. Bibcode: 2009BpJ....96.2532B. doi:10.1016/j.bpj.2008.12.3896. PMID 19289075. PMC: 2907679 (freier Volltext).
  14. E. Fluhler, V. G. Burnham, L. M. Loew: Spectra, membrane binding, and potentiometric responses of new charge shift probes. In: Biochemistry. Band 24, Nummer 21, Oktober 1985, S. 5749–5755, ISSN 0006-2960. PMID 4084490.
  15. A. Bullen, P. Saggau: High-speed, random-access fluorescence microscopy: II. Fast quantitative measurements with voltage-sensitive dyes. In: Biophysical journal. Band 76, Nummer 4, April 1999, S. 2272–2287, ISSN 0006-3495. doi:10.1016/S0006-3495(99)77383-2. PMID 10096922. PMC 1300200 (freier Volltext).
  16. Fluhler E, Burnham VG, Loew LM: Spectra, membrane binding, and potentiometric responses of new charge shift probes. In: Biochemistry. 24, Nr. 21, October 1985, S. 5749–55. doi:10.1021/bi00342a010. PMID 4084490.