Diskussion:Fixierung (Präparationsmethode)

Walter Thiel (Mediziner)

Mag jemand die Thiel-Fixierung hier einarbeiten? Ich bin leider kein Fachmann auf dem Gebiet. Gruß, Aspiriniks 10:52, 11. Feb. 2012 (CET)

Die Quellenangabe der Quelle [1] ist fehlerhaft. 12:30, 26.07.2018 (CET).

Zum Begriff Denaturierung

Im Hauptartikel wird behauptet, daß Formaldehyd als Denaturierungsmittel wirkt. Das heißt, daß Formaldehyd auch die DNA und RNA denaturiert. Unter Denaturierung der Nucleinsäuren versteht man eine Zerstörung der Wasserstoffbrücken zwischen Basenpaaren, dabei entstehen Einzelstränge. Woher kommt die Behauptung , daß Formaldehyd ein Denaturierungsmittel ist? Sie entsteht von unklaren Aussagen einigen Wissenschaftlern. In einer sehr interessanter Publikation (D.C.Darling, P.M.Brickell; Nucleinsäure Blotting; Spektrum,1996) auf der Seite 101 steht: "Das Formamid bricht die Wasserstoffbrückenbindungen auf und ermöglicht so dem Formaldehyd, mit Basen zu reagieren". Diese Aussage ist korrekt. Auf der Seite 99 Punkt 4.4.2."Formaldehyd denaturiert RNA, indem es kovalent mit Aminogruppen von Adenin,Guanin und Cytosin reagiert. Es verhindert so die Bildung von C-C und A-T-Basenpaaren". In dieser Aussage ist das einzige Wort (denaturiert)falsch. Formaldehyd kann die Wasserstoffbrücken nicht zerstören, es verhindert nur die Renaturierung, indem es mit Basen reagiert. Denaturator ist Formamid --Meta-kaercher (Diskussion) 17:47, 21. Feb. 2015 (CET)Meta-Kaercher

Hallo, m.E. ist die obige Definition der Zerstörung der Wasserstoffbrücken zu eng gefasst, denn die Denaturierung umfasst alle Vorgänge, die die native Form und Funktion eines Proteins beeinträchtigen. Dazu gehört auch eine Ausbildung Schiffscher Basen einer Aminogruppe einer Aminosäure mit Aldehyden wie Formaldehyd oder Glutaraldehyd. Formamid denaturiert auch, aber anders. Grüße, --Ghilt (Diskussion) 17:38, 21. Feb. 2015 (CET)

Die Schlussfolgerung ist falsch. Die Aussage, Formaldehyd denaturiert, bedeutet nicht, dass es alles, also auch Nukleinsäuren, denaturiert. -- Brudersohn (Diskussion) 23:20, 22. Feb. 2015 (CET)

Hallo Ghilt, ich freue mich, daß Sie an der Diskussion teilnehmen. Sie haben Recht,Aldehyde reagieren mit Aminogruppen einer Aminosäure. Aber bevor die Aldehyden reagieren, müßen die Aminogruppen frei sein und nicht mit anderen Gruppen verbunden. Gut ist "die Wirkungsweise" einer Aldehydfixierung von Nucleinsäuren im Buch:Handbuch der Histochemie: Walther Graumann, Karlheinz Neumann; Band 1; Allgemeine Methodik : Teil 3, S.180 beschrieben. Wörtlich:"Zuerst wird die DNS denaturiert, d.h. die Wasserstffbrücken werden gelöst und die Basen dadurch zugänglicht gemacht. Hierfür soll eine höhere Aldehydkonzentration />10 %/ erforderlich sein, wenn die Reaktion bei Zimmertemperatur stattfindet. Aber wer fixiert mit 10% Formaldehyd? --Meta-kaercher (Diskussion) 12:18, 5. Jun. 2015 (CEST)

Die Definition der Denaturierung entspricht in der Literatur ungefähr meinem obigen Geschreibsel,[1][2] jedoch erwähnen diese beiden Bücher nicht die Denaturierung durch Aldehyde. Eine weitere Quelle erwähnt zumindest Schwermetallsalze, die auch nicht über die Aufhebung intramolekularer Wasserstoffbrücken wirken, sondern durch Komplexierung (zu unlöslichen Komplexen). Richter, Holtzhauer und Lehrach erwähnen die Denaturierung von RNA durch Formaldehyd.[3][4][PMID 2937672] Amine an der Moleküloberfläche sind per se zugänglich, das gilt auch für solche in Bindungsflächen oder in aktiven Zentren, deren Modifikation zu Funktionsverlusten führen. Grüße, --Ghilt (Diskussion) 15:58, 23. Feb. 2015 (CET) PS: Signieren geht ganz einfach per Eingabe von --~~~~

Zwei Zitate aus G.Richter: S.83 "Geeignete denaturierende Verbindungen sind Formaldehyd und Dimethylsulfoxid/Glyoxal. Ersterer bindet an Aminogruppen von Adenin, Guanin und Cytosin (Bildung Schiffscher Basen), wodurch deren Fähigkeit zur Knüpfung von Wasserstoffbindungen ausgeschaltet wird. Formaldehyd ist Bestandteil des Gels (1,1%) und oder des Elektrophoresepuffers; zudem werden die in 3-Morpholino-1-propansulfonsäure/Acetat (MOPS-Puffer) gelösten RNAs vor dem Auftragen mit Formaldehyd und Formamid behandelt" In diesem Zitat ist es unklar , was für eine Rolle spielt Formamid. Wenn Formaldehydf fähig ist die Wasserstoffbindungen zerstören, wozu braucht man dann Formamid?

S.144: "Durch Erhitzen oder Einwirkung von Alkali, Formamid oder Salzen werden die Wasserstoffbindungen in DNA-Doppelstrang gelöst,wodurch er in die Einzelstränge zerfällt". Welche Zitate ist korrekt und welche nicht?.

M.Holtzhauer (S.50) , beschreibt nicht -denaturierende Nucleinsäure-Elektrophorese und denaturierende. Das Formamid ist ein Bestandteil der denaturirenden Lösung. Für nicht-denaturierende braucht man kein Formamid.

Lehrach et al benutzt 2,2M Formaldehyd. 2,2M Formaldehyd entspricht 6,6 % Formaldehyd.--Meta-kaercher (Diskussion) 12:20, 5. Jun. 2015 (CEST)

Beide, Formamid ist ein Chaotrop, Formaldehyd bildet bei der Fixierung kovalente Verbindugen aus, beide sind denaturierend, Grüße, --Ghilt (Diskussion) 13:24, 5. Jun. 2015 (CEST)

Eigenschaften des Alkohols als Fixierungsmittel.

Hans Luppa: Grundlagen der Histochemie, Teil 1, 1979, S.51. " Da Äthanol und Azeton  an aktiven Gruppen keine irreversiblen Veränderungen     hervorrufen, sind beide Flüßigkeiten besonders für Verwendung in der Proteinstruktur geeignet". L.Bubendorf, G.E Feichter u.a. in: G Klöppel; Pathologie, 2011, S 609 "Äthylalkohol >96% Äthanol ist ein chemisch weitgehend intaktes Fixierungsmittel,daß die Zusammensetzung der Eiweißkörper und damit die Immunaktivität kaum beeinflußt. Wegen seiner hydroskopischen Wirkung beruht die fixierende Wirkung  in erster Linie auf Wasserentzug." Woher kommt die Bechauptung, daß Äthanol ein chemisch intaktes Fixierungsmittel ist? "Die Fixation mit Alkohol ist nach Gedangengängen von Pischinger(1926), Nayer (1926) und Drawet (1937) von Gesichtspunkt aus vorgenommen worden, daß die elektrische Ladung der Eiweißkörper unverändert erhalten  bleibt und lediglich eine Dehydratation derselben bewirkt wird" (S.Strugger, P. Hilbrich; Deutsche Tierärztliche Wochenschrift; 50,1942, S. 122) Ist der Wasserentzug so harmlos? Dora Boerner-Patzelt; Protoplasma,1950, 39, S 648 "Eine Fixierung mit 100% Alkohol bewirkt eine starke Dehydratisierung und vollständige Stabilisierung der Eiweißsubstanzen. Dementsprechend verhielten sich die Kerne lebenden Zellen, wie zu .erwarten war, genau wie Kerne schon vor der Behandlung abgestorbenen Zellen. Beide zeigten Rotfluoreszenz."  Auch B.G.Eliseew (Osnowi histologii und Histologitscheskoi techniki; Moskau,1967, S.129 ) nimmt an, daß Alkohol mit minimalen chemischen Veränderungen fixiert, aber bie Ihm findet man schon, daß Alkohol die Lipide und Hämoglobin löst. Das Äthanol Lipide und Hämoglobin löst, findet man auch bei B.Romeis:Mikroskopisce Technik, 17 Auflage von P. Böck; München,1989, S.81. Aber was geschiet, wenn Lipide gelöst werden? L.S.Goldin; Osnowi histologitscheskoi techniki elektronnoi mikroskopii, Moskau,1963,S.90: "Alle chemische Stoffe, die Lipoide nicht stabilisieren, zerstören die submikroskopische Struktur des Protoplasmas". Warum? Lipide sind Strukturbestandteile der Plasmamembranen. Wenn die Lipide aus der Membran ausgelöst werden, ändert die Membran ihre Leitfähigkeit nicht nur für kleine Ionen wie NA und K, auch für große Ionen der Farbstoffe. H.Kölbel; Zeitsch. für Naturwissensch, 1947, 2b S.385 untersuchte den Einfluß des Alkohols auf die Höhe der Farbstoffspeicherung der Bäckerhefe. Die unbehandelte Hefe nahm 4% Farbstoff auf; die mit 96% Alkohol behandelte- 7,99, fast das Zweifache.

Ich frage mich:"Ist die Struktur der Eiweißmoleküle und der Nucleinsäuren nur von den Ionenkräften, oder anders gesagt von elektrischen Ladung abhängig? Die Antwort auf diese Frage findet man bei E.Hofmann(Eiweiße und Nucleinsäure; Braunschweig 1970,S.94,98) "Die hydrophoben Bindungen sind wichtige, sogar die wichtigsten strukturstabilisierende Kräfte in einem Eiweißmolekül. Auf die Sprängung hydrophoben Bindungen, die sich zwischen hydrophoben Aminosäuren ausbilden, läst sich die denaturierende Wirkung der organischen Lösungsmittel , wie Aceton und Alkohol, aber auch die durch Oberflächenkräfte hervorgerufene Denaturirung zuruckzuführen." Fassen wir die Eigenschaften des Alkohols als Fixierungsmittel zusammen:a)Alkohol dehydratisiert; b)löst Lipide und Hämoglobin; c)sprengt die hydrophoben Bindungen. Gibt es eine Alternative? Schon 1937 schreibt K.Zeiger; Z. wiss. Mikroskopie;1937 54, S 86: "Formalin erzeugt wenigstens im Bereich mikroskopischen Dimensionen auffallend homogene Gelatinierungen, die sicherlich einen wenn auch nur relativ schwächeren Eingriff in das molekulare Gefüge der Strukturelemente darstellen, als die massiven tiefgreifenden Fällungswirkungen des absoluten Alkohols, die sich schon im mikroskopischen Bild weitgehend und unangenehm bemerkbar machen." Die Fluoreszenzmikroskopie hat versagt, nur weil man die Wirkung des Alkohols unterschätzt hat. In erster Linie leidet unter Alkoholfixierung das Zytoplasma; da es einen hohen Wassergehalt zeigt (70-80)% . Genau den Effekt des Zytoplasmas nutzten L.von Bertalanffy in der Krebsforschung.--Meta-kaercher (Diskussion) 10:57, 8. Jun. 2015 (CEST)-- 15:50, 6. Jun. 2015 (CEST)