„Immungoldfärbung“ – Versionsunterschied

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Die '''Immungoldfärbung''' (engl. ''immunogold staining'') ist eine Immunfärbung, die als Reportersignal kolloidale Gold-Partikel tragen. Sie wird bei der Probenvorbereitung der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) verwen
 
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Die Immungoldfärbung basiert auf der Immunfärbung zur Markierung einzelner [[Antigen]]e, jedoch werden Gold-Partikel mit einem Durchmesser von 5, 10 oder 20 [[Nanometer|nm]] an den [[Sekundärantikörper]] gekoppelt. Mit den unterschiedlichen Durchmessern können verschiedene Antigene parallel markiert werden.<ref>J. Roth, M. Binder: ''Coloidal gold, ferritin and peroxidase as markers for electron microscopic double labeling lectin techniques.'' In: ''The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society.'' Band 26, Nummer 3, März 1978, S.&nbsp;163–169, {{DOI|10.1177/26.3.632554}}, PMID 632554.</ref> Die Goldpartikel besitzen eine vergleichsweise hohe [[Elektronendichte]] und sind dadurch weniger durchlässig für den [[Kathodenstrahl]], wodurch die Partikel im TEM-Bild als dunkle, kontrastreiche Punkte erscheinen.
Die Immungoldfärbung basiert auf der Immunfärbung zur Markierung einzelner [[Antigen]]e, jedoch werden Gold-Partikel mit einem Durchmesser von 5, 10 oder 20 [[Nanometer|nm]] an den [[Sekundärantikörper]] gekoppelt. Mit den unterschiedlichen Durchmessern können verschiedene Antigene parallel markiert werden.<ref>J. Roth, M. Binder: ''Coloidal gold, ferritin and peroxidase as markers for electron microscopic double labeling lectin techniques.'' In: ''The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society.'' Band 26, Nummer 3, März 1978, S.&nbsp;163–169, {{DOI|10.1177/26.3.632554}}, PMID 632554.</ref> Die Goldpartikel besitzen eine vergleichsweise hohe [[Elektronendichte]] und sind dadurch weniger durchlässig für den [[Kathodenstrahl]], wodurch die Partikel im TEM-Bild als dunkle, kontrastreiche Punkte erscheinen.


Als Probenvorbereitung von Geweben werden [[Dünnschnitt]]e mit einem [[Mikrotom]] angefertigt. Um [[Aldehyde]] im Präparat zur reduzieren wird es für 5 Minuten in 0,1 % (m/V) reduziert, gefolgt von mehreren Waschvorgängen mit [[Phosphatgepufferte Salzlösung|PBS-]] oder [[TBS-Puffer]]. Suspensionen von [[Viren]] werden dagegen mit einer [[Ultrazentrifuge|Airfuge]] auf ein [[Polyvinylalkohol|PVA]]-beschichtetes [[Kupfer]]gitter mit 100.000 g sedimentiert. Analog zur Immunfärbung werden anschließend die freien Proteinbindungsstellen im Präparat für 20 Minuten mit einer Blockierungslösung (5 % [[Serumalbumin|Rinderserumalbumin]] in PBS oder TBS) blockiert. Die Bindung des ersten [[Antikörper]]s (Primärantikörper) erfolgt in einer PBS- oder TBS-basierten Lösung mit 1 % Rinderserumalbumin. Nach weiteren Waschschritten in TBS oder PBS mit 0,1 % Rinderserumalbumin folgt die Inkubation mit dem goldmarkierten Sekundärantikörper in PBS oder TBS. Niedrigere Konzentrationen von Antikörpern mit längeren Inkubationszeiten erzeugen eine spezifischere Färbung. Alternativ kann anstatt dem goldmarkierten Sekundärantikörper ein goldmarkiertes [[Protein A]] oder [[Protein G]] verwendet werden.<ref>J. Roth, M. Bendayan, L. Orci: ''Ultrastructural localization of intracellular antigens by the use of protein A-gold complex.'' In: ''The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society.'' Band 26, Nummer 12, Dezember 1978, S.&nbsp;1074–1081, {{DOI|10.1177/26.12.366014}}, PMID 366014.</ref> Eine anschließende [[Silberfärbung]] senkt die [[Nachweisgrenze]] um den Faktor 200.<ref name="Hayat">M. A. Hayat: ''Immunogold-Silver Staining.'' CRC Press, 1995, ISBN 978-0-849-32449-9.</ref> Dadurch kann die Markierung auch per [[Lichtmikroskop]] beobachtet werden.<ref>O. Van Laere, L. De Wael, J. De Mey: ''Immuno gold staining (IGS) and immuno gold silver staining (IGSS) for the identification of the plant pathogenic bacterium Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al.'' In: ''Histochemistry.'' Band 83, Nummer 5, 1985, S.&nbsp;397–399, PMID 2416717.</ref>
Als Probenvorbereitung von Geweben werden [[Dünnschnitt]]e mit einem [[Mikrotom]] angefertigt. Um [[Aldehyde]] im Präparat zur reduzieren wird es für 5 Minuten in 0,1 % (m/V) reduziert, gefolgt von mehreren Waschvorgängen mit [[Phosphatgepufferte Salzlösung|PBS-]] oder [[TBS-Puffer]]. Suspensionen von [[Viren]] werden dagegen mit einer [[Ultrazentrifuge|Airfuge]] auf ein [[Polyvinylalkohol|PVA]]-beschichtetes [[Kupfer]]gitter mit 100.000 g sedimentiert. Analog zur Immunfärbung werden anschließend die freien Proteinbindungsstellen im Präparat für 20 Minuten mit einer Blockierungslösung (5 % [[Serumalbumin|Rinderserumalbumin]] in PBS oder TBS) blockiert. Die Bindung des ersten [[Antikörper]]s (Primärantikörper) erfolgt in einer PBS- oder TBS-basierten Lösung mit 1 % Rinderserumalbumin. Nach weiteren Waschschritten in TBS oder PBS mit 0,1 % Rinderserumalbumin folgt die Inkubation mit dem goldmarkierten Sekundärantikörper in PBS oder TBS. Niedrigere Konzentrationen von Antikörpern mit längeren Inkubationszeiten erzeugen eine spezifischere Färbung. Alternativ kann anstatt dem goldmarkierten Sekundärantikörper ein goldmarkiertes [[Protein A]] oder [[Protein G]] verwendet werden.<ref>J. Roth, M. Bendayan, L. Orci: ''Ultrastructural localization of intracellular antigens by the use of protein A-gold complex.'' In: ''The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society.'' Band 26, Nummer 12, Dezember 1978, S.&nbsp;1074–1081, {{DOI|10.1177/26.12.366014}}, PMID 366014.</ref> Eine anschließende [[Silberfärbung]] senkt die [[Nachweisgrenze]] um den Faktor 200.<ref name="Hayat">M. A. Hayat: ''Immunogold-Silver Staining.'' CRC Press, 1995, ISBN 978-0-849-32449-9.</ref> Dadurch kann die Markierung auch per [[Lichtmikroskop]] beobachtet werden.<ref>O. Van Laere, L. De Wael, J. De Mey: ''Immuno gold staining (IGS) and immuno gold silver staining (IGSS) for the identification of the plant pathogenic bacterium Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al.'' In: ''Histochemistry.'' Band 83, Nummer 5, 1985, S.&nbsp;397–399, PMID 2416717.</ref><ref>C. Oliver: ''Use of immunogold with silver enhancement.'' In: ''Methods in molecular biology.'' Band 115, 1999, S.&nbsp;241–245, {{DOI|10.1385/1-59259-213-9:241}}, PMID 10098186.</ref>


Die Immunogoldfärbung wird auch für die [[Rastertunnelmikroskopie]] verwendet.<ref>R. Hermann, P. Walther, M. Müller: ''Immunogold labeling in scanning electron microscopy.'' In: ''Histochemistry and cell biology.'' Band 106, Nummer 1, Juli 1996, S.&nbsp;31–39, PMID 8858365.</ref>
Die Immunogoldfärbung wird auch für die [[Rastertunnelmikroskopie]] verwendet.<ref>R. Hermann, P. Walther, M. Müller: ''Immunogold labeling in scanning electron microscopy.'' In: ''Histochemistry and cell biology.'' Band 106, Nummer 1, Juli 1996, S.&nbsp;31–39, PMID 8858365.</ref>

Version vom 1. November 2017, 02:00 Uhr

Immungoldfärbung des Virus PMMoV

Die Immungoldfärbung (engl. immunogold staining) ist eine Immunfärbung, die als Reportersignal kolloidale Gold-Partikel tragen. Sie wird bei der Probenvorbereitung der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) verwendet.

Prinzip

Die Immungoldfärbung basiert auf der Immunfärbung zur Markierung einzelner Antigene, jedoch werden Gold-Partikel mit einem Durchmesser von 5, 10 oder 20 nm an den Sekundärantikörper gekoppelt. Mit den unterschiedlichen Durchmessern können verschiedene Antigene parallel markiert werden.[1] Die Goldpartikel besitzen eine vergleichsweise hohe Elektronendichte und sind dadurch weniger durchlässig für den Kathodenstrahl, wodurch die Partikel im TEM-Bild als dunkle, kontrastreiche Punkte erscheinen.

Als Probenvorbereitung von Geweben werden Dünnschnitte mit einem Mikrotom angefertigt. Um Aldehyde im Präparat zur reduzieren wird es für 5 Minuten in 0,1 % (m/V) reduziert, gefolgt von mehreren Waschvorgängen mit PBS- oder TBS-Puffer. Suspensionen von Viren werden dagegen mit einer Airfuge auf ein PVA-beschichtetes Kupfergitter mit 100.000 g sedimentiert. Analog zur Immunfärbung werden anschließend die freien Proteinbindungsstellen im Präparat für 20 Minuten mit einer Blockierungslösung (5 % Rinderserumalbumin in PBS oder TBS) blockiert. Die Bindung des ersten Antikörpers (Primärantikörper) erfolgt in einer PBS- oder TBS-basierten Lösung mit 1 % Rinderserumalbumin. Nach weiteren Waschschritten in TBS oder PBS mit 0,1 % Rinderserumalbumin folgt die Inkubation mit dem goldmarkierten Sekundärantikörper in PBS oder TBS. Niedrigere Konzentrationen von Antikörpern mit längeren Inkubationszeiten erzeugen eine spezifischere Färbung. Alternativ kann anstatt dem goldmarkierten Sekundärantikörper ein goldmarkiertes Protein A oder Protein G verwendet werden.[2] Eine anschließende Silberfärbung senkt die Nachweisgrenze um den Faktor 200.[3] Dadurch kann die Markierung auch per Lichtmikroskop beobachtet werden.[4][5]

Die Immunogoldfärbung wird auch für die Rastertunnelmikroskopie verwendet.[6]

Geschichte

Die Immunogoldfärbung wurde 1971 von W. P. Faulk und G. M. Taylor veröffentlicht.[7]

Literatur

  • J. Roth: The silver anniversary of gold: 25 years of the colloidal gold marker system for immunocytochemistry and histochemistry. In: Histochemistry and cell biology. Band 106, Nummer 1, Juli 1996, S. 1–8, PMID 8858362.

Einzelnachweise

  1. ↑ J. Roth, M. Binder: Coloidal gold, ferritin and peroxidase as markers for electron microscopic double labeling lectin techniques. In: The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. Band 26, Nummer 3, März 1978, S. 163–169, doi:10.1177/26.3.632554, PMID 632554.
  2. ↑ J. Roth, M. Bendayan, L. Orci: Ultrastructural localization of intracellular antigens by the use of protein A-gold complex. In: The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. Band 26, Nummer 12, Dezember 1978, S. 1074–1081, doi:10.1177/26.12.366014, PMID 366014.
  3. ↑ M. A. Hayat: Immunogold-Silver Staining. CRC Press, 1995, ISBN 978-0-849-32449-9.
  4. ↑ O. Van Laere, L. De Wael, J. De Mey: Immuno gold staining (IGS) and immuno gold silver staining (IGSS) for the identification of the plant pathogenic bacterium Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al. In: Histochemistry. Band 83, Nummer 5, 1985, S. 397–399, PMID 2416717.
  5. ↑ C. Oliver: Use of immunogold with silver enhancement. In: Methods in molecular biology. Band 115, 1999, S. 241–245, doi:10.1385/1-59259-213-9:241, PMID 10098186.
  6. ↑ R. Hermann, P. Walther, M. Müller: Immunogold labeling in scanning electron microscopy. In: Histochemistry and cell biology. Band 106, Nummer 1, Juli 1996, S. 31–39, PMID 8858365.
  7. ↑ W. P. Faulk, G. M. Taylor: An immunocolloid method for the electron microscope. In: Immunochemistry. Band 8, Nummer 11, November 1971, S. 1081–1083, PMID 4110101.
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