„Lichtscheibenmikroskopie“ – Versionsunterschied
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Version vom 13. August 2011, 23:02 Uhr
Bei der Single Plane Illumination Microscopy oder Selective Plane Illumination Microscopy (kurz: SPIM) handelt es sich um ein modernes fluoreszenz-mikroskopisches Verfahren mittlerer Auflösung. Dabei wird nur eine Ebene in der Probe (typischerweise einige Mikrometer dick) mit Anregungslicht beleuchtet, sodass negative Effekte durch Bleichen oder licht-induzierten Stress in biologischen Proben vermindert werden.
Aufbau eines SPI-Mikroskops
Bei dieser Art der Mikroskopie[1] wird senkrecht zur Beobachtungsrichtung Anregungslicht eingestrahlt (typischer-weise durch einen Laser, der auf die Absorptionsbanden des gewählten Fluoreszenzfarbstoffes abgestimmt ist). Der Laserstrahl wird zunächst mit Hilfe einer Blende auf ein rechteckiges Profil gebracht, das dann mit Hilfe einer Zylinderlinse nur in einer Richtung fokussiert wird. So ergibt sich ein "Lichtblatt", das nur eine dünne Schicht innerhalb der Probe ausleuchtet. Fluoreszenzfarbstoffmoleküle in dieser Schicht werden zur Fluoreszenz angeregt, welche dann senkrecht dazu mit Hilfe eines Standard-Mirkioskopobjektivs beobachtet wird.
Auflösungsvermögen
Die Beobachtung erfolgt bei SPIM über Mikroskopobjektiv, welches in eine wassergefüllte Probenkammer eintaucht und die Probe direkt abbildet. Damit ist die laterale Auflösung vollständig durch dieses Objektiv gegeben und erreicht maximal etwa eine halbe bis eine Wellenlängen (also z.B. bei grüner Fluoreszenz etwa 250-500nm)[1]. Die longitudinale Auflösung ist deutlich schlechter (typischerweise mehr als einen Faktor 4). Sie kann aber etwas verbessert werden, indem das Lichtblatt dünner gemacht wird, sodass nur in einem Teil des Beobachtungsfokus Fluoreszenz angeregt wird. Idealerweise wird so die longitudinale Auflösung gleich der lateralen.
Anwendung
SPIM Mikroskopie wird oft in der Entwicklungsbiologie eingesetzt, wo sie z.B. die Langzeitbeobachtung der embryonalen Entwicklung ermöglicht.[2][3]. Sie kann aber auch mit Techniken, wie Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie kombiniert werden, um ortsaufgelöste Mobilitätsmessungen in (biologischen) Proben zu ermöglichen.[4]
Einzelnachweise
- ↑ a b K. Greger, J. Swoger, E. H. Stelzer: Basic building units and properties of a fluorescence single plane illumination microscope. In: The Review of scientific instruments Band 78, Nummer 2, Februar 2007, S. 023705, ISSN 0034-6748. PMID 17578115.
- ↑ P. J. Verveer, J. Swoger, F. Pampaloni, K. Greger, M. Marcello, E. H. Stelzer: High-resolution three-dimensional imaging of large specimens with light sheet-based microscopy. In: Nature methods Band 4, Nummer 4, April 2007, S. 311–313, ISSN 1548-7091. doi:10.1038/nmeth1017. PMID 17339847.
- ↑ J. Huisken, J. Swoger, F. Del Bene, J. Wittbrodt, E. H. Stelzer: Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. In: Science (New York, N.Y.) Band 305, Nummer 5686, August 2004, S. 1007–1009, ISSN 1095-9203. doi:10.1126/science.1100035. PMID 15310904.
- ↑ T. Wohland, X. Shi, J. Sankaran, E. H. Stelzer: Single plane illumination fluorescence correlation spectroscopy (SPIM-FCS) probes inhomogeneous three-dimensional environments. In: Optics express Band 18, Nummer 10, Mai 2010, S. 10627–10641, ISSN 1094-4087. PMID 20588915.