„ICAT“ – Versionsunterschied
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Die zu untersuchenden Proben bestehen üblicherweise aus drei fundamentalen Elementen: eine funktionelle Gruppe, die imstande ist, eine spezifische Seitenkette einer [[Aminosäure]] zu markieren (z.B. [[Iodacetamid]] zur Markierung von [[Cystein]]resten), einen von Isotopen umringten [[Vernetzung (Chemie)|Vernetzer]] und einen Tag (z.B. [[Biotin]]) für die auf [[Affinität (Biochemie)|Affinität]] basierende Trennung von markierten Proteinen bzw. [[Peptid]]en. Um zwei [[Proteom]]e quantitativ zu vergleichen, ist eine Substanz mit der Probe der leichten Version des Isotops markiert und die andere mit der Schweren.<ref>[[Friedrich Lottspeich]], J. Kellermann: ''ICPL labeling strategies for proteome research.'' In: ''J. Methods Mol Biol.'' (2011), Band 753, S. 55-64. {{doi|10.1007/978-1-61779-148-2_4}}. PMID 21604115.</ref> Um Fehler zu minimieren, verdaut man die zu untersuchenden Substanzen mit [[Protease]] (meist [[Trypsin]]) und unterzieht sie einer Avidin-[[Affinitätschromatographie]], um die mit Isotopen ummantelte Peptidezu isolieren. Diese Peptide werden dann per LC-MS analysiert. Das Verhältniss der Signalstärken der verschiedenen Peptide, welche mit unterschiedlich schweren Isotopen markiert wurden, dient der relativen Mengenbestimmung. Ursprünglich wurde ICAT mit [[Deuterium]] entwickelt, aufgrund von Interaktionen mit der [[Stationäre Phase|stationären Phase]] wurde später auf <sup>13</sup>C umgestellt.<ref>{{cite journal|last=Yi|first=E.C|coauthors=et al.|title=Increased quantitative proteome coverage with (13)C/(12)C-based, acid-cleavable isotope-coded affinity tag reagent and modified data acquisition scheme|journal=Proteomics|year=2005|volume=5|pages=380–7|doi=10.1002/pmic.200400970|pmid=15648049|issue=2}}</ref> |
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Version vom 4. November 2013, 16:37 Uhr
ICAT (von englisch Isotope-coded affinity tag ‚Isotopen-codierte Affinitätsmarkierung‘) ist eine biochemische Methode für quantitative Proteinanalysen, welche sich auf eine massenspektrometrische Analyse eines Proteins anhand seiner Markierung mit einem Protein-Tag stützt, welches zuvor mit unterschiedlichen Isotopen gekoppelt wurden.[1][2]
Eigenschaften
Die zu untersuchenden Proben bestehen üblicherweise aus drei fundamentalen Elementen: eine funktionelle Gruppe, die imstande ist, eine spezifische Seitenkette einer Aminosäure zu markieren (z.B. Iodacetamid zur Markierung von Cysteinresten), einen von Isotopen umringten Vernetzer und einen Tag (z.B. Biotin) für die auf Affinität basierende Trennung von markierten Proteinen bzw. Peptiden. Um zwei Proteome quantitativ zu vergleichen, ist eine Substanz mit der Probe der leichten Version des Isotops markiert und die andere mit der Schweren.[3] Um Fehler zu minimieren, verdaut man die zu untersuchenden Substanzen mit Protease (meist Trypsin) und unterzieht sie einer Avidin-Affinitätschromatographie, um die mit Isotopen ummantelte Peptidezu isolieren. Diese Peptide werden dann per LC-MS analysiert. Das Verhältniss der Signalstärken der verschiedenen Peptide, welche mit unterschiedlich schweren Isotopen markiert wurden, dient der relativen Mengenbestimmung. Ursprünglich wurde ICAT mit Deuterium entwickelt, aufgrund von Interaktionen mit der stationären Phase wurde später auf 13C umgestellt.[4]
Einzelnachweise
- ↑ S. P. Gygi, B. Rist, S. A. Gerber, F. Turecek, M. H. Gelb, Rudolf Hans Aebersold: Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. In: Nature Biotechnology. 17. Jahrgang, Nr. 10, Oktober 1999, S. 994–9, doi:10.1038/13690, PMID 10504701.
- ↑ US-Patent 6670194: "Rapid quantitative analysis of proteins or protein function in complex mixtures," Rudolf Hans Aebersold et al.
- ↑ Friedrich Lottspeich, J. Kellermann: ICPL labeling strategies for proteome research. In: J. Methods Mol Biol. (2011), Band 753, S. 55-64. doi:10.1007/978-1-61779-148-2_4. PMID 21604115.
- ↑ E.C Yi, et al.: Increased quantitative proteome coverage with (13)C/(12)C-based, acid-cleavable isotope-coded affinity tag reagent and modified data acquisition scheme. In: Proteomics. 5. Jahrgang, Nr. 2, 2005, S. 380–7, doi:10.1002/pmic.200400970, PMID 15648049.