„Ubiquitin-7-amino-4-methylcumarin“ – Versionsunterschied

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[[Datei:Ub AMC.jpeg|mini|Struktur von Ub-AMC]]
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'''Ubiquitin-AMC''' oder '''Ub-AMC''' ist ein kommerziell erhältliches modifiziertes [[Protein]], mit dem die [[Enzymaktivität|Aktivität]] von verschiedenen desubiquitinierenden Enzymen (DAB) bestimmt wird. Während [[Ubiquitin-Protein-Ligasen|ubiquitinierende Enzyme]] die Verbindung von [[Ubiquitin]] mit anderen Proteinen [[Katalyse|katalysieren]], bewirken die desubiquitinierenden Enzyme, dass diese Verbindung wieder getrennt wird.
'''Ubiquitin-7-amino-4-methylcumarin''' oder '''Ub-AMC''' ist ein [[Fluoreszenzmarkierung|fluoreszent markiertes]] [[Protein]], das in der [[Biochemie|biochemischen]] Forschung zur Messung der [[Enzymaktivität|Aktivität]] von bestimmten [[Enzym]]en aus der Gruppe der desubiquitinierenden Enzyme (DUB) verwendet wird.<ref name="PMID9485312">L. C. Dang, F. D. Melandri, R. L. Stein: ''Kinetic and mechanistic studies on the hydrolysis of ubiquitin C-terminal 7-amido-4-methylcoumarin by deubiquitinating enzymes.'' In: ''Biochemistry.'' Band 37, Nummer 7, Februar 1998, S.&nbsp;1868–1879, {{DOI|10.1021/bi9723360}}, PMID 9485312.</ref>


== Eigenschaften ==
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Ub-AMC besteht aus Ubiquitin, das am [[C-Terminus]] mit dem [[Fluoreszenzfarbstoff]] [[7-Amino-4-methylcumarin]] (AMC)<ref>{{Substanzinfo|Name=7-Amino-4-methylcumarin |CAS=26093-31-2 |EG-Nummer=247-454-8 |ECHA-ID=100.043.125 |PubChem=92249 |ChemSpider=83285 |DrugBank=DB08168 |Wikidata=Q27097396}}</ref> [[Derivat (Chemie)|derivatisiert]] wird. Dabei wird die freie [[Carboxygruppe]] des Proteins mit der [[Aminogruppe]] des Farbstoffs zu einem [[Carbonsäureamid]] umgesetzt. Durch die desubiquitinierenden Enzyme wird der Farbstoff abgespalten und beginnt zu fluoreszieren. Der Anstieg der Fluoreszenz (Anregung 345 nm, Emission 445 nm) kann gemessen werden und die Enzymaktivität lässt sich somit kontinuierlich verfolgen.<ref>[https://www.rndsystems.com/products/recombinant-human-ubiquitin-amc-protein-cf_u-550 Biotechne Produktkatalog]</ref><ref>[https://www.enzolifesciences.com/BML-SE211/ubiquitin-amc/ Enzo Life Science Produktkatalog]</ref><ref>{{Literatur |Autor=Gerbrand J. van der Heden van Noort, Huib Ovaa |Titel=Activity-Based Protein Profiling |Verlag=Springer International Publishing |Ort=Cham |Datum=2019 |ISBN=978-3-03011143-4 |Kapitel=How to Target Viral and Bacterial Effector Proteins Interfering with Ubiquitin Signaling |Seiten=111–130 |DOI=10.1007/82_2018_134 |PMID=30178261}}</ref>
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Ub-AMC besteht aus Ubiquitin, das am [[C-Terminus|''C''-Terminus]] mit dem [[Fluoreszenzfarbstoff]] [[7-Amino-4-methylcumarin]] (AMC)<ref>{{Substanzinfo|Name=7-Amino-4-methylcumarin |CAS=26093-31-2 |EG-Nummer=247-454-8 |ECHA-ID=100.043.125 |PubChem=92249 |ChemSpider=83285 |DrugBank=DB08168 |Wikidata=Q27097396}}</ref> [[Derivat (Chemie)|derivatisiert]] wird. Dabei wird die freie [[Carboxygruppe]] des Proteins mit der [[Aminogruppe]] des Farbstoffs zu einem [[Carbonsäureamid]] umgesetzt. Durch die desubiquitinierenden Enzyme wird der Farbstoff vom [[Substrat (Biochemie)|Enzymsubstrat]] abgespalten und beginnt stärker zu fluoreszieren. Der Anstieg der Fluoreszenz (Anregung 345 nm, Emission 445 nm) kann gemessen werden und die Enzymaktivität lässt sich somit kontinuierlich verfolgen.<ref>{{Literatur |Autor=Gerbrand J. van der Heden van Noort, Huib Ovaa |Titel=Activity-Based Protein Profiling |Verlag=Springer International Publishing |Ort=Cham |Datum=2019 |ISBN=978-3-03011143-4 |Kapitel=How to Target Viral and Bacterial Effector Proteins Interfering with Ubiquitin Signaling |Seiten=111–130 |DOI=10.1007/82_2018_134 |PMID=30178261}}</ref>
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[[Datei:Ub AMC.jpeg|mini|Struktur von Ub-AMC]]

Alternativ kann teilweise Z-LRGG-AMC verwendet werden, das AMC-gekoppelte Ubiquitin-[[Sequenzmotiv]].<ref name="PMID32953009">W. Rut, M. Zmudzinski, S. J. Snipas, M. Bekes, T. T. Huang, M. Drag: ''Engineered unnatural ubiquitin for optimal detection of deubiquitinating enzymes.'' In: ''Chemical science.'' Band 11, Nummer 23, Juni 2020, S.&nbsp;6058–6069, {{DOI|10.1039/d0sc01347a}}, PMID 32953009, {{PMC|7477763}}.</ref> Zur Bestimmung der [[Dissoziationskonstante]] von Desubiquitinasen kann ein [[Enzymhemmung|kompetitiver]] Assay verwendet werden.<ref name="PMID30242703">M. T. Morgan, C. Wolberger: ''Competition Assay for Measuring Deubiquitinating Enzyme Substrate Affinity.'' In: ''Methods in molecular biology.'' Band 1844, 2018, S.&nbsp;59–70, {{DOI|10.1007/978-1-4939-8706-1_5}}, PMID 30242703, {{PMC|6917206}}.</ref> Ub-AMC wird auch zur Messung der Aktivität der [[Protease]] OTU des [[Krim-Kongo-Hämorrhagisches-Fieber-Virus]] verwendet.<ref name="PMID26156848">F. Kocabas, G. S. Aslan: ''Fluorometric CCHFV OTU protease assay with potent inhibitors.'' In: ''Virus genes.'' Band 51, Nummer 2, Oktober 2015, S.&nbsp;190–197, {{DOI|10.1007/s11262-015-1226-5}}, PMID 26156848.</ref>


== Einzelnachweise ==
== Einzelnachweise ==

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Struktur von Ub-AMC

Ubiquitin-7-amino-4-methylcumarin oder Ub-AMC ist ein fluoreszent markiertes Protein, das in der biochemischen Forschung zur Messung der Aktivität von bestimmten Enzymen aus der Gruppe der desubiquitinierenden Enzyme (DUB) verwendet wird.[1]

Eigenschaften

Ubiquitin wird in Zellen an Proteine angehängt, die im Proteasom abgebaut werden sollen. Während ubiquitinierende Enzyme die Verbindung von Ubiquitin mit anderen Proteinen katalysieren, bewirken die desubiquitinierenden Enzyme, dass diese Verbindung wieder getrennt wird. Ub-AMC wird durch Desubiquitinasen in Ubiquitin und den Fluoreszenzfarbstoff AMC.

Ub-AMC besteht aus Ubiquitin, das am C-Terminus mit dem Fluoreszenzfarbstoff 7-Amino-4-methylcumarin (AMC)[2] derivatisiert wird. Dabei wird die freie Carboxygruppe des Proteins mit der Aminogruppe des Farbstoffs zu einem Carbonsäureamid umgesetzt. Durch die desubiquitinierenden Enzyme wird der Farbstoff vom Enzymsubstrat abgespalten und beginnt stärker zu fluoreszieren. Der Anstieg der Fluoreszenz (Anregung 345 nm, Emission 445 nm) kann gemessen werden und die Enzymaktivität lässt sich somit kontinuierlich verfolgen.[3]

Alternativ kann teilweise Z-LRGG-AMC verwendet werden, das AMC-gekoppelte Ubiquitin-Sequenzmotiv.[4] Zur Bestimmung der Dissoziationskonstante von Desubiquitinasen kann ein kompetitiver Assay verwendet werden.[5] Ub-AMC wird auch zur Messung der Aktivität der Protease OTU des Krim-Kongo-Hämorrhagisches-Fieber-Virus verwendet.[6]

Einzelnachweise

  1. ↑ L. C. Dang, F. D. Melandri, R. L. Stein: Kinetic and mechanistic studies on the hydrolysis of ubiquitin C-terminal 7-amido-4-methylcoumarin by deubiquitinating enzymes. In: Biochemistry. Band 37, Nummer 7, Februar 1998, S. 1868–1879, doi:10.1021/bi9723360, PMID 9485312.
  2. ↑ Externe Identifikatoren von bzw. Datenbank-Links zu 7-Amino-4-methylcumarin: CAS-Nummer: 26093-31-2, EG-Nummer: 247-454-8, ECHA-InfoCard: 100.043.125, PubChem: 92249, ChemSpider: 83285, DrugBank: DB08168, Wikidata: Q27097396.
  3. ↑ Gerbrand J. van der Heden van Noort, Huib Ovaa: Activity-Based Protein Profiling. Springer International Publishing, Cham 2019, ISBN 978-3-03011143-4, How to Target Viral and Bacterial Effector Proteins Interfering with Ubiquitin Signaling, S. 111–130, doi:10.1007/82_2018_134, PMID 30178261.
  4. ↑ W. Rut, M. Zmudzinski, S. J. Snipas, M. Bekes, T. T. Huang, M. Drag: Engineered unnatural ubiquitin for optimal detection of deubiquitinating enzymes. In: Chemical science. Band 11, Nummer 23, Juni 2020, S. 6058–6069, doi:10.1039/d0sc01347a, PMID 32953009, PMC 7477763 (freier Volltext).
  5. ↑ M. T. Morgan, C. Wolberger: Competition Assay for Measuring Deubiquitinating Enzyme Substrate Affinity. In: Methods in molecular biology. Band 1844, 2018, S. 59–70, doi:10.1007/978-1-4939-8706-1_5, PMID 30242703, PMC 6917206 (freier Volltext).
  6. ↑ F. Kocabas, G. S. Aslan: Fluorometric CCHFV OTU protease assay with potent inhibitors. In: Virus genes. Band 51, Nummer 2, Oktober 2015, S. 190–197, doi:10.1007/s11262-015-1226-5, PMID 26156848.
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