„CRISPR/Cas-Methode“ – Versionsunterschied

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== Eigenschaften ==
== Eigenschaften ==
Das CRISPR/Cas-System entstammt einem adaptiven antiviralen Abwehrmechanismus aus Bakterien, dem [[CRISPR]].<ref>R. Sorek, V. Kunin, P. Hugenholtz: ''CRISPR–a widespread system that provides acquired resistance against phages in bacteria and archaea.'' In: ''Nature reviews. Microbiology.'' Band 6, Nummer 3, März 2008, S.&nbsp;181–186, {{ISSN|1740-1534}}. {{DOI|10.1038/nrmicro1793}}. PMID 18157154.</ref> Die [[Endonuklease]] ''Cas9'' (von {{enS}} ''CRISPR-associated'', veraltet auch ''Cas5, Csn1'' oder ''Csx12'') kann eine bestimmte RNA-Sequenz (''crRNA repeat'', Teilsequenz GUUUUAGAGCU(A/G)UG(C/U)UGUUUUG)<ref>G. Gasiunas, R. Barrangou, P. Horvath, V. Siksnys: ''Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria.'' In: ''Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.'' Band 109, Nummer 39, September 2012, S.&nbsp;E2579–E2586, {{ISSN|1091-6490}}. {{DOI|10.1073/pnas.1208507109}}. PMID 22949671. {{PMC|3465414}}.</ref> binden. Wird an diese RNA-Sequenz eine weitere zu einer DNA-Zielsequenz komplementäre RNA-Sequenz angefügt und zu einer zur DNA-Sequenz analogen RNA (''tracrRNA'', von engl. ''trans-acting CRISPR RNA'') hinzugegeben, schneidet ''Cas9'' die DNA nahe der Zielsequenz. Die beiden RNA-Sequenzen können auch in einem einzelnen, [[Hybridisierung (Molekularbiologie)|selbsthybridisierenden]] RNA-Strang untergebracht werden.<ref>M. Jinek, K. Chylinski, I. Fonfara, M. Hauer, J. A. Doudna, E. Charpentier: ''A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.'' In: ''Science (New York, N.Y.).'' Band 337, Nummer 6096, August 2012, S.&nbsp;816–821, {{ISSN|1095-9203}}. {{DOI|10.1126/science.1225829}}. PMID 22745249.</ref> Durch das ''Cas9'' mit den entsprechenden RNA-Sequenzen kann sequenzspezifisch doppelsträngige, teilweise komplementäre DNA geschnitten werden, wodurch gezielte [[Deletion]]en erzeugt werden können. Durch [[Transformation (Genetik)|Transformation]] oder [[Transfektion]] von einem [[Vektor (Gentechnik)|Vektor]] können Lebewesen mit dem CRISPR/Cas-System ergänzt werden, die es natürlich nicht besitzen, z. B. manche Bakterienstämme,<ref name="pmid23360965">W. Jiang, D. Bikard, D. Cox, F. Zhang, L. A. Marraffini: ''RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems.'' In: ''Nature biotechnology.'' Band 31, Nummer 3, März 2013, S.&nbsp;233–239, {{ISSN|1546-1696}}. {{DOI|10.1038/nbt.2508}}. PMID 23360965. {{PMC|3748948}}.</ref> [[Bäckerhefe]],<ref name="pmid23460208">J. E. DiCarlo, J. E. Norville, P. Mali, X. Rios, J. Aach, G. M. Church: ''Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems.'' In: ''Nucleic acids research.'' Band 41, Nummer 7, April 2013, S.&nbsp;4336–4343, {{ISSN|1362-4962}}. {{DOI|10.1093/nar/gkt135}}. PMID 23460208. {{PMC|3627607}}.</ref> [[Taufliege]]n,<ref name="pmid2408874">G. W. Thickbroom, F. L. Mastaglia: ''Cerebral events preceding self-paced and visually triggered saccades. A study of presaccadic potentials.'' In: ''Electroencephalography and clinical neurophysiology.'' Band 62, Nummer 4, Juli 1985, S.&nbsp;277–289, {{ISSN|0013-4694}}. PMID 2408874.</ref> [[Zebrabärbling]],<ref name="pmid23360964">W. Y. Hwang, Y. Fu, D. Reyon, M. L. Maeder, S. Q. Tsai, J. D. Sander, R. T. Peterson, J. R. Yeh, J. K. Joung: ''Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system.'' In: ''Nature biotechnology.'' Band 31, Nummer 3, März 2013, S.&nbsp;227–229, {{ISSN|1546-1696}}. {{DOI|10.1038/nbt.2501}}. PMID 23360964. {{PMC|3686313}}.</ref> [[Mäuse]]n,<ref name="pmid23643243">H. Wang, H. Yang, C. S. Shivalila, M. M. Dawlaty, A. W. Cheng, F. Zhang, R. Jaenisch: ''One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.'' In: ''Cell.'' Band 153, Nummer 4, Mai 2013, S.&nbsp;910–918, {{ISSN|1097-4172}}. {{DOI|10.1016/j.cell.2013.04.025}}. PMID 23643243. {{PMC|3969854}}.</ref> und [[Mensch]]en.<ref name="pmid23287722">P. Mali, L. Yang, K. M. Esvelt, J. Aach, M. Guell, J. E. DiCarlo, J. E. Norville, G. M. Church: ''RNA-guided human genome engineering via Cas9.'' In: ''Science (New York, N.Y.).'' Band 339, Nummer 6121, Februar 2013, S.&nbsp;823–826, {{ISSN|1095-9203}}. {{DOI|10.1126/science.1232033}}. PMID 23287722. {{PMC|3712628}}.</ref>
Das CRISPR/Cas-System entstammt einem adaptiven antiviralen Abwehrmechanismus aus Bakterien, dem [[CRISPR]].<ref>R. Sorek, V. Kunin, P. Hugenholtz: ''CRISPR–a widespread system that provides acquired resistance against phages in bacteria and archaea.'' In: ''Nature reviews. Microbiology.'' Band 6, Nummer 3, März 2008, S.&nbsp;181–186, {{ISSN|1740-1534}}. {{DOI|10.1038/nrmicro1793}}. PMID 18157154.</ref> Es existieren mehr als 40 verschiedene ''Cas''-Proteinfamilien.<ref>D. H. Haft, J. Selengut, E. F. Mongodin, K. E. Nelson: ''A guild of 45 CRISPR-associated (Cas) protein families and multiple CRISPR/Cas subtypes exist in prokaryotic genomes.'' In: ''PLoS computational biology.'' Band 1, Nummer 6, November 2005, S.&nbsp;e60, {{ISSN|1553-7358}}. {{DOI|10.1371/journal.pcbi.0010060}}. 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Band 41, Nummer 7, April 2013, S.&nbsp;4336–4343, {{ISSN|1362-4962}}. {{DOI|10.1093/nar/gkt135}}. PMID 23460208. {{PMC|3627607}}.</ref> [[Taufliege]]n,<ref name="pmid2408874">G. W. Thickbroom, F. L. Mastaglia: ''Cerebral events preceding self-paced and visually triggered saccades. A study of presaccadic potentials.'' In: ''Electroencephalography and clinical neurophysiology.'' Band 62, Nummer 4, Juli 1985, S.&nbsp;277–289, {{ISSN|0013-4694}}. PMID 2408874.</ref> [[Zebrabärbling]],<ref name="pmid23360964">W. Y. Hwang, Y. Fu, D. Reyon, M. L. Maeder, S. Q. Tsai, J. D. Sander, R. T. Peterson, J. R. Yeh, J. K. Joung: ''Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system.'' In: ''Nature biotechnology.'' Band 31, Nummer 3, März 2013, S.&nbsp;227–229, {{ISSN|1546-1696}}. {{DOI|10.1038/nbt.2501}}. PMID 23360964. {{PMC|3686313}}.</ref> [[Mäuse]]n,<ref name="pmid23643243">H. Wang, H. Yang, C. S. Shivalila, M. M. Dawlaty, A. W. Cheng, F. Zhang, R. Jaenisch: ''One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.'' In: ''Cell.'' Band 153, Nummer 4, Mai 2013, S.&nbsp;910–918, {{ISSN|1097-4172}}. {{DOI|10.1016/j.cell.2013.04.025}}. PMID 23643243. {{PMC|3969854}}.</ref> und [[Mensch]]en.<ref name="pmid23287722">P. Mali, L. Yang, K. M. Esvelt, J. Aach, M. Guell, J. E. DiCarlo, J. E. Norville, G. M. Church: ''RNA-guided human genome engineering via Cas9.'' In: ''Science (New York, N.Y.).'' Band 339, Nummer 6121, Februar 2013, S.&nbsp;823–826, {{ISSN|1095-9203}}. {{DOI|10.1126/science.1232033}}. PMID 23287722. {{PMC|3712628}}.</ref>


== Anwendungen ==
== Anwendungen ==

Version vom 20. Juni 2014, 09:58 Uhr

Das CRISPR/Cas-System ist eine biochemische Methode zur Erzeugung von gentechnisch veränderten Organismen.

Eigenschaften

Das CRISPR/Cas-System entstammt einem adaptiven antiviralen Abwehrmechanismus aus Bakterien, dem CRISPR.[1] Es existieren mehr als 40 verschiedene Cas-Proteinfamilien.[2] Die Endonuklease Cas9 (von englisch CRISPR-associated, veraltet auch Cas5, Csn1 oder Csx12) kann eine bestimmte RNA-Sequenz (crRNA repeat, Sequenz GUUUUAGAGCU(A/G)UG(C/U)UGUUUUG)[3] binden. Die crRNA repeat-Sequenz bildet eine RNA-Sekundärstrukur.[4] Als zweiten Teil besitzt die crRNA eine Sequenz, welche komplementär zur Ziel-DNA ist und an die Ziel-DNA bindet (crRNA spacer). Wird an eine crRNA repeat-Sequenz anstatt der natürlich vorkommenden crRNA spacer-Sequenz eine andere, zu einer DNA-Zielsequenz komplementäre RNA-Sequenz angefügt und zu einer zur DNA-Sequenz analogen RNA (tracrRNA, von engl. trans-acting CRISPR RNA) hinzugegeben, schneidet Cas9 die DNA nahe der Zielsequenz. Die beiden RNA-Sequenzen können auch in einem einzelnen, selbsthybridisierenden RNA-Strang untergebracht werden.[5] Durch das Cas9 mit den entsprechenden RNA-Sequenzen kann sequenzspezifisch doppelsträngige, teilweise komplementäre DNA geschnitten werden, wodurch gezielte Deletionen erzeugt werden können. Durch Transformation oder Transfektion von einem Vektor können Lebewesen mit dem CRISPR/Cas-System ergänzt werden, die es natürlich nicht besitzen, z. B. manche Bakterienstämme,[6] Bäckerhefe,[7] Taufliegen,[8] Zebrabärbling,[9] Mäusen,[10] und Menschen.[11]

Anwendungen

Blockade der Genexpression durch eine Cas9-Mutante (CRISPRi).

Das CRISPR/Cas-System kann unter anderem zum Genome Editing und damit auch zur Gentherapie verwendet werden.[12][13] Durch Doppelstrangbrüche kann die Häufigkeit einer homologen Rekombination deutlich erhöht werden,[14] wodurch ein sequenzspezifischer Schnitt durch Cas9 auch zum Einfügen von DNA-Sequenzen (z. B. im Zuge der Gentherapie) verwendet werden kann, sofern die anschließend einzufügende DNA an beiden Enden jeweils eine zur jeweiligen Zielsequenz überlappende Sequenz aufweist.[15] Die Änderung mehrerer DNA-Zielsequenzen wird als Multiplex Genome Editing bezeichnet.

Mit dem CRISPR/Cas-System wurden Bakteriophagen-resistente Bakterienstämme erzeugt, durch eine adaptive Resistenz bei Hinzufügen entsprechender RNA bei industriell wichtigen Bakterien, z. B. in der Milch- oder Weinindustrie. Durch ein mutiertes Cas ohne funktionsfähige Endonuklease kann ein DNA-bindendes Protein erzeugt werden, welches analog zur RNAi zu einem Knockdown von endogenen Genen führt, z. B. durch Transformation mit einem Plasmid, aus dem Cas9 und eine CRISPR-RNA transkribiert wird (CRISPRi).[16] Anhand charakteristischer CRISPR-Sequenzen können CRISPR/Cas enthaltende Bakterienstämme identifiziert werden (spoligotyping). Ein grün fluoreszierendes Protein kann mit einer Cas-Mutante als Fusionsprotein zur Markierung von DNA-Sequenzen (auch repetitiver Sequenzen wie Telomere) verwendet werden.[17] Durch das CRISPR/Cas-System konnte die Herstellungzeit von transgenen Tieren wie transgenen Mäusen von bis zu zwei Jahren auf wenige Wochen verkürzt werden.[10]

Einzelnachweise

  1. ↑ R. Sorek, V. Kunin, P. Hugenholtz: CRISPR–a widespread system that provides acquired resistance against phages in bacteria and archaea. In: Nature reviews. Microbiology. Band 6, Nummer 3, März 2008, S. 181–186, ISSN 1740-1534. doi:10.1038/nrmicro1793. PMID 18157154.
  2. ↑ D. H. Haft, J. Selengut, E. F. Mongodin, K. E. Nelson: A guild of 45 CRISPR-associated (Cas) protein families and multiple CRISPR/Cas subtypes exist in prokaryotic genomes. In: PLoS computational biology. Band 1, Nummer 6, November 2005, S. e60, ISSN 1553-7358. doi:10.1371/journal.pcbi.0010060. PMID 16292354. PMC 1282333 (freier Volltext).
  3. ↑ G. Gasiunas, R. Barrangou, P. Horvath, V. Siksnys: Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. In: Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. Band 109, Nummer 39, September 2012, S. E2579–E2586, ISSN 1091-6490. doi:10.1073/pnas.1208507109. PMID 22949671. PMC 3465414 (freier Volltext).
  4. ↑ V. Kunin, R. Sorek, P. Hugenholtz: Evolutionary conservation of sequence and secondary structures in CRISPR repeats. In: Genome biology. Band 8, Nummer 4, 2007, S. R61, ISSN 1465-6914. doi:10.1186/gb-2007-8-4-r61. PMID 17442114. PMC 1896005 (freier Volltext).
  5. ↑ M. Jinek, K. Chylinski, I. Fonfara, M. Hauer, J. A. Doudna, E. Charpentier: A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. In: Science (New York, N.Y.). Band 337, Nummer 6096, August 2012, S. 816–821, ISSN 1095-9203. doi:10.1126/science.1225829. PMID 22745249.
  6. ↑ W. Jiang, D. Bikard, D. Cox, F. Zhang, L. A. Marraffini: RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. In: Nature biotechnology. Band 31, Nummer 3, März 2013, S. 233–239, ISSN 1546-1696. doi:10.1038/nbt.2508. PMID 23360965. PMC 3748948 (freier Volltext).
  7. ↑ J. E. DiCarlo, J. E. Norville, P. Mali, X. Rios, J. Aach, G. M. Church: Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. In: Nucleic acids research. Band 41, Nummer 7, April 2013, S. 4336–4343, ISSN 1362-4962. doi:10.1093/nar/gkt135. PMID 23460208. PMC 3627607 (freier Volltext).
  8. ↑ G. W. Thickbroom, F. L. Mastaglia: Cerebral events preceding self-paced and visually triggered saccades. A study of presaccadic potentials. In: Electroencephalography and clinical neurophysiology. Band 62, Nummer 4, Juli 1985, S. 277–289, ISSN 0013-4694. PMID 2408874.
  9. ↑ W. Y. Hwang, Y. Fu, D. Reyon, M. L. Maeder, S. Q. Tsai, J. D. Sander, R. T. Peterson, J. R. Yeh, J. K. Joung: Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. In: Nature biotechnology. Band 31, Nummer 3, März 2013, S. 227–229, ISSN 1546-1696. doi:10.1038/nbt.2501. PMID 23360964. PMC 3686313 (freier Volltext).
  10. ↑ a b H. Wang, H. Yang, C. S. Shivalila, M. M. Dawlaty, A. W. Cheng, F. Zhang, R. Jaenisch: One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. In: Cell. Band 153, Nummer 4, Mai 2013, S. 910–918, ISSN 1097-4172. doi:10.1016/j.cell.2013.04.025. PMID 23643243. PMC 3969854 (freier Volltext).
  11. ↑ P. Mali, L. Yang, K. M. Esvelt, J. Aach, M. Guell, J. E. DiCarlo, J. E. Norville, G. M. Church: RNA-guided human genome engineering via Cas9. In: Science (New York, N.Y.). Band 339, Nummer 6121, Februar 2013, S. 823–826, ISSN 1095-9203. doi:10.1126/science.1232033. PMID 23287722. PMC 3712628 (freier Volltext).
  12. ↑ Y. Wang, Z. Li, J. Xu, B. Zeng, L. Ling, L. You, Y. Chen, Y. Huang, A. Tan: The CRISPR/Cas System mediates efficient genome engineering in Bombyx mori. In: Cell research. Band 23, Nummer 12, Dezember 2013, S. 1414–1416, ISSN 1748-7838. doi:10.1038/cr.2013.146. PMID 24165890. PMC 3847576 (freier Volltext).
  13. ↑ T. R. Sampson, D. S. Weiss: Exploiting CRISPR/Cas systems for biotechnology. In: BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. Band 36, Nummer 1, Januar 2014, S. 34–38, ISSN 1521-1878. doi:10.1002/bies.201300135. PMID 24323919.
  14. ↑ N. Rudin, E. Sugarman, J. E. Haber: Genetic and physical analysis of double-strand break repair and recombination in Saccharomyces cerevisiae. In: Genetics. Band 122, Nummer 3, Juli 1989, S. 519–534, ISSN 0016-6731. PMID 2668114. PMC 1203726 (freier Volltext).
  15. ↑ P. D. Hsu, E. S. Lander, F. Zhang: Development and Applications of CRISPR-Cas9 for Genome Engineering. In: Cell. Band 157, Nummer 6, Juni 2014, S. 1262–1278, ISSN 1097-4172. doi:10.1016/j.cell.2014.05.010. PMID 24906146. PDF.
  16. ↑ M. H. Larson, L. A. Gilbert, X. Wang, W. A. Lim, J. S. Weissman, L. S. Qi: CRISPR interference (CRISPRi) for sequence-specific control of gene expression. In: Nature protocols. Band 8, Nummer 11, November 2013, S. 2180–2196, ISSN 1750-2799. doi:10.1038/nprot.2013.132. PMID 24136345. PMC 3922765 (freier Volltext).
  17. ↑ B. Chen, L. A. Gilbert, B. A. Cimini, J. Schnitzbauer, W. Zhang, G. W. Li, J. Park, E. H. Blackburn, J. S. Weissman, L. S. Qi, B. Huang: Dynamic Imaging of Genomic Loci in Living Human Cells by an Optimized CRISPR/Cas System. In: Cell. Band 155, Nummer 7, Dezember 2013, S. 1479–1491, ISSN 1097-4172. doi:10.1016/j.cell.2013.12.001. PMID 24360272.
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