„Expressionsvektor“ – Versionsunterschied
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In Pflanzen wird oftmals das [[Ti-Plasmid]] verwendet,<ref>R. Walden, J. Schell: ''Techniques in plant molecular biology–progress and problems.'' In: ''European journal of biochemistry.'' Band 192, Nummer 3, September 1990, S. 563–576, PMID 2209611.</ref> oder ein viraler Vektor basierend auf dem [[Tabakmosaikvirus]] (TMV), dem [[Potato-Virus X]] oder dem [[Cowpea-Mosaic-Virus]].<ref>M. C. Cañizares, L. Nicholson, G. P. Lomonossoff: ''Use of viral vectors for vaccine production in plants.'' In: ''Immunology and cell biology.'' Band 83, Nummer 3, Juni 2005, S. 263–270, {{DOI|10.1111/j.1440-1711.2005.01339.x}}, PMID 15877604.</ref><ref>K. Hefferon: ''Plant Virus Expression Vectors: A Powerhouse for Global Health.'' In: ''Biomedicines.'' Band 5, Nummer 3, Juli 2017, S. , {{DOI|10.3390/biomedicines5030044}}, PMID 28758953, {{PMC|5618302}}.</ref> |
In Pflanzen wird oftmals das [[Ti-Plasmid]] verwendet,<ref>R. Walden, J. Schell: ''Techniques in plant molecular biology–progress and problems.'' In: ''European journal of biochemistry.'' Band 192, Nummer 3, September 1990, S. 563–576, PMID 2209611.</ref> oder ein viraler Vektor basierend auf dem [[Tabakmosaikvirus]] (TMV), dem [[Potato-Virus X]] oder dem [[Cowpea-Mosaic-Virus]].<ref>M. C. Cañizares, L. Nicholson, G. P. Lomonossoff: ''Use of viral vectors for vaccine production in plants.'' In: ''Immunology and cell biology.'' Band 83, Nummer 3, Juni 2005, S. 263–270, {{DOI|10.1111/j.1440-1711.2005.01339.x}}, PMID 15877604.</ref><ref>K. Hefferon: ''Plant Virus Expression Vectors: A Powerhouse for Global Health.'' In: ''Biomedicines.'' Band 5, Nummer 3, Juli 2017, S. , {{DOI|10.3390/biomedicines5030044}}, PMID 28758953, {{PMC|5618302}}.</ref> |
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* O. Gileadi: ''Recombinant Protein Expression in E. coli : A Historical Perspective.'' In: ''Methods in molecular biology.'' Band 1586, 2017, S. 3–10, {{DOI|10.1007/978-1-4939-6887-9_1}}, PMID 28470595. |
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Version vom 28. April 2018, 00:17 Uhr
Ein Expressionsvektor ist eine DNA, die zur Herstellung von Proteinen durch Überexpression verwendet wird.
Eigenschaften
Expressionsvektoren gehören zu den Vektoren. Sie besitzen ein Operon, damit in einem geeigneten Wirt oder durch eine zellfreie Genexpression eine mRNA mit einer proteincodierenden Sequenz, einen Replikationsursprung für die Replikation der DNA, eine Sequenz zur Selektion des Expressionsvektors (z. B. eine Antibiotikumresistenz oder eine Auxotrophie) und einen Polylinker, in die die proteincodierende Sequenz des gewünschten Proteins (das Insert) eingefügt wird.[1] Meistens wird die DNA in Form eines Plasmids verwendet. Oftmals wird zusätzlich eine codierende Sequenz für ein Protein-Tag an die proteincodierende Sequenz angefügt, wodurch ein Fusionsprotein entsteht, das sich leichter reinigen lässt.
Im Gegensatz zu Expressionsvektoren sind Klonierungsvektoren nicht für die Expression von Proteinen geeignet, sondern nur zur Klonierung. Es können in einem Wirt auch mehrere Proteine parallel erzeugt werden, sofern Plasmide mit unterschiedlichen Selektionsmechanismen verwendet werden, da bei gleichem Selektionsmechanismus nur eines notwendig ist und oftmals auch nur ein Typ vom Wirt behalten wird. Ebenso werden Vektoren mit zwei Promotoren eingesetzt.[2] Bei Eukaryoten können mit einer IRES zwischen zwei proteincodierenden Sequenzen zwei verschiedene Proteine parallel erzeugt werden, wobei die Ausbeute des Proteins mit der proteincodierenden Sequenz nach der IRES meist geringer ist.
Bakterielle Expressionsvektoren
Die kostengünstigste Form der Proteinexpression erfolgt in Einzellern. Allerdings können nicht alle Proteine von Eukaryoten im nativen Zustand, wodurch die biologische Aktivität herabgesetzt wird oder unerwünschte Einschlusskörperchen entstehen können, die sich negativ auf die Ausbeute bei der Proteinreinigung auswirken. Als Wirte werden meisten Escherichia coli oder Bacillus subtilis eingesetzt. Bakterielle Expressionsvektoren besitzen meist einen Promotor, der aus dem lac-Operon (meist die lacUV5-Mutante ohne Katabolitrepression) oder aus dem Bakteriophagen T7 (z. B. der pET-Vektor) stammen.[3] Ebenso werden aus verschiedenen Ursprüngen zusammengesetzte Promotoren verwendet, wie der Tac-Promotor aus dem trp- und dem lac-Promotor,[4] beispielsweise beim pGex-Vektor.
Eukaryotische Expressionsvektoren
Die kostengünstigste Expression in Eukaryoten wird in Hefen durchgeführt wie Saccharomyces cerevisiae oder Komagataella phaffii[5] (früher als Pichia pastoris bezeichnet, als Vektor z. B. pIC), die eine Glykosylierung der Proteine durchführen können. Sofern menschliche Glykosylierungsmuster erforderlich sind, wird eine Überexpression in Säuger-Zellkulturen durchgeführt. In Säugerzellen wird oftmals ein CMV-immediate/early-Promotor oder ein SV40-Promotor verwendet und einen Poly-A-Schwanz. Als Vektoren werden Plasmide, Yeast Arificial Chromosomes oder virale Vektoren verwendet.[6]
In Pflanzen wird oftmals das Ti-Plasmid verwendet,[7] oder ein viraler Vektor basierend auf dem Tabakmosaikvirus (TMV), dem Potato-Virus X oder dem Cowpea-Mosaic-Virus.[8][9]
Literatur
- O. Gileadi: Recombinant Protein Expression in E. coli : A Historical Perspective. In: Methods in molecular biology. Band 1586, 2017, S. 3–10, doi:10.1007/978-1-4939-6887-9_1, PMID 28470595.
Einzelnachweise
- ↑ Mary Campbell: Biochemistry. Cengage Learning, 2007, ISBN 978-0-495-39041-1, S. 378.
- ↑ S. Öztürk, B. G. Ergün, P. Çalık: Double promoter expression systems for recombinant protein production by industrial microorganisms. In: Applied Microbiology and Biotechnology. Band 101, Nummer 20, Oktober 2017, S. 7459–7475, doi:10.1007/s00253-017-8487-y, PMID 28900685.
- ↑ J. W. Dubendorff, F. W. Studier: Controlling basal expression in an inducible T7 expression system by blocking the target T7 promoter with lac repressor. In: Journal of molecular biology. Band 219, Nummer 1, Mai 1991, S. 45–59, PMID 1902522.
- ↑ H. A. de Boer, L. J. Comstock, M. Vasser: The tac promoter: a functional hybrid derived from the trp and lac promoters. In: Proceedings of the National Academy of Sciences. Band 80, Nummer 1, Januar 1983, S. 21–25, PMID 6337371, PMC 393301 (freier Volltext).
- ↑ J. M. Cregg, J. L. Cereghino, J. Shi, D. R. Higgins: Recombinant protein expression in Pichia pastoris. In: Molecular biotechnology. Band 16, Nummer 1, September 2000, S. 23–52, doi:10.1385/MB:16:1:23, PMID 11098467.
- ↑ K. L. Hefferon: Virus expression vectors. In: Pharmaceutical patent analyst. Band 3, Nummer 3, Mai 2014, S. 249–260, doi:10.4155/ppa.14.17, PMID 24998286.
- ↑ R. Walden, J. Schell: Techniques in plant molecular biology–progress and problems. In: European journal of biochemistry. Band 192, Nummer 3, September 1990, S. 563–576, PMID 2209611.
- ↑ M. C. Cañizares, L. Nicholson, G. P. Lomonossoff: Use of viral vectors for vaccine production in plants. In: Immunology and cell biology. Band 83, Nummer 3, Juni 2005, S. 263–270, doi:10.1111/j.1440-1711.2005.01339.x, PMID 15877604.
- ↑ K. Hefferon: Plant Virus Expression Vectors: A Powerhouse for Global Health. In: Biomedicines. Band 5, Nummer 3, Juli 2017, S. , doi:10.3390/biomedicines5030044, PMID 28758953, PMC 5618302 (freier Volltext).