Proteinreinigung

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Proteinreinigung (auch Proteinaufreinigung) bezeichnet den Vorgang, aus einem komplexen biologischen Gemisch oder einer Lösung, die mehrere Biomoleküle enthält, eines oder mehrere Proteine anzureichern und zu reinigen. Diese Anreicherung kann in mehreren, aufeinanderfolgenden Reinigungsschritten durch Anwendung unterschiedlicher Reinigungsmethoden erfolgen, deren Effektivität (die sinnvolle Aufeinanderfolge) und deren Effizienz (der Reinigungsgrad) mit analytischen Methoden verfolgt und quantifiziert wird.

Eigenschaften der Proteine[Bearbeiten]

Proteine sind meist zwitterionische Biopolymere aus Aminosäuren mit einer molaren Masse zwischen einem und 350 Kilodalton (Proteinkomplexe nicht eingerechnet), wobei die meisten Proteine um die 20 bis 70 Kilodalton liegen. Aufgrund der Proteinfaltung nehmen sie weniger Volumen ein als Nukleinsäuren oder Polysaccharide. Auch können sekretorische Proteine durch Disulfidbrücken intramolekular quervernetzt sein.

Durch die Peptidbindung absorbieren Proteine ultraviolettes Licht bei einer Wellenlänge von etwa 205 nm (190 nm bis 230 nm), daneben absorbieren auch Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan UV-Licht bei Wellenlängen von 280 nm bis 288 nm. Diese Absorption kann zur photometrischen Quantifizierung und zur Bestimmung der Aufreinigungsfaktoren verwendet werden. Im Gegensatz zu Kohlenhydraten und Nukleinsäuren kommen durch die verschiedenen enthaltenen Aminosäuren manche Strukturmotive nur bei Proteinen vor, z. B. Sulfhydryl-enthaltende Cysteine.

Da aufzureinigende Proteine, meistens rekombinante Proteine, bei Zellaufschluss durch Inaktivierung, Denaturierung oder Proteolyse gefährdet sind, wird eine Proteinreinigung oftmals zügig bei 4 °C in Anwesenheit von Proteaseinhibitoren durchgeführt. Einige Proteaseinhibitoren werden nur verwendet, sofern die Funktion des aufzureinigenden Proteins nicht gemindert wird oder ein Erhalt dessen Funktion unerheblich ist, da sie das Protein über eine kovalente Bindung modifizieren können. Zur Vermeidung einer unerwünschten Ausbildung von Disulfidbrücken werden oftmals milde Reduktionsmittel zugesetzt, darunter Sulfhydryle wie Mercaptoethanol, Dithiothreitol oder Dithioerythritol und Phosphane wie Tris(2-carboxyethyl)phosphin. Gelegentlich erfolgt nach dem Zellaufschluß und vor einer Proteinreinigung eine Zellfraktionierung durch differentielle Zentrifugation, um Zellkompartimente wie Zellkerne, Mitochondrien, Mikrosomen und zytosolische Bestandteile voneinander zu trennen.

Trennprinzipien[Bearbeiten]

Um Proteine zu trennen, nutzt man ihre durch die Sequenz und spezifische Struktur bedingten unterschiedlichen Merkmale aus. Bei der Ionenaustauschchromatographie und der isoelektrischen Fokussierung ist dies der isoelektrische Punkt, bei der SDS-PAGE die Molekülmasse und posttranslationale Modifikationen, bei der Größenausschlusschromatographie und bei der Zentrifugation die Molekülmasse und Konformation. Die isopyknische Zentrifugation separiert anhand der Dichte. Die Affinitätschromatographie nutzt die Unterschiede in der Affinität zu einem selektiven Liganden bzw. in den jeweiligen Dissoziationskonstanten. Die hydrophobe, die Umkehrphasen- und die polare Chromatographie trennen nach der Polarität der verschiedenen exponierten polaren Aminosäuren und posttranslationalen Modifikationen. Die Fällung mit kosmotropen Salzen[1] aus der Hofmeister-Reihe, wasserlöslichen organischen Lösungsmitteln oder Temperatur beruht auf den veränderten Löslichkeiten. Die Extraktion mit einem Extraktionsmittel (meistens eine andere Phase) oder Polyethylenglykol[1] basieren auf der Polarität und den unterschiedlichen Löslichkeiten in einem Lösungsmittel oder Detergens, wie z. B. Mischungen von Phenol, Chloroform und Isoamylalkohol (mit oder ohne Chaotrope wie Guanidiniumthiocyanat)[2] oder die Phasentrennung von einprozentigen (m / V) Lösungen von Triton X-114 bei 4 °C.[3][4][5][6]

Meistens werden mehrere Methoden seriell durchgeführt, die Auswahl der Methode richtet sich dabei nach den Eigenschaften des Proteins, den jeweiligen Methoden-abhängigen störenden Begleitsubstanzen für anschließende Verfahren und einer eventuell einhergehenden Denaturierung. Höhere Reinigungsgrade (bzw. Aufreinigungsfaktoren) eines Verfahrens ermöglichen eine geringere Anzahl an Aufreinigungsschritten, z. B. bei der Tandem Affinity Purification.

Trennverfahren[Bearbeiten]

Chromatographie[Bearbeiten]

Elektrophorese[Bearbeiten]

Extraktion & Fällung[Bearbeiten]

Filtration[Bearbeiten]

Sedimentation[Bearbeiten]

Evaporation[Bearbeiten]

Nachweisverfahren[Bearbeiten]

Nach den einzelnen Etappen einer Proteinreinigung erfolgt eine Proteincharakterisierung und Quantifizierung der aufgereinigten Proteine. Die Effizienz der gesamten Aufreinigung wird durch die Bilanz bestimmt, wobei ein Aufreinigungsgrad (als Kehrwert des Massenanteils) aus der Proteinmasse, oder – bei Enzymen – auch ein Aufreinigungsgrad aus den Enzymaktivitäten bestimmt werden kann, z. B. der Quotient aus der Gesamtmasse an aufgereinigtem Protein und der Ausgangsmasse des betrachteten Proteins im Ausgangsmaterial oder der analoge gebildete Quotient mit den Aktivitäten.

Literatur[Bearbeiten]

  • Friedrich Lottspeich, Haralabos Zorbas: Bioanalytik. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg 1998, ISBN 978-3827400413.
  • Hubert Rehm, Thomas Letzel: Der Experimentator: Proteinbiochemie / Proteomics. 6. Auflage, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg 2009, ISBN 978-3827423122.

Weblinks[Bearbeiten]

Einzelnachweise[Bearbeiten]

  1. a b J. Wen, S. Zhao, D. He, Y. Yang, Y. Li, S. Zhu: Preparation and characterization of egg yolk immunoglobulin Y specific to influenza B virus. In: Antiviral Res. (2012) 93(1):154–159, PMID 22127067.
  2. P. Chomczynski, N. Sacchi: Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. In: Anal Biochem. (1987) 162(1):156–159, PMID 2440339.
  3. H. Everberg, N. Gustavasson, F. Tjerned: Enrichment of membrane proteins by partitioning in detergent/polymer aqueous two-phase systems. In: Methods Mol Biol. (2008) 424:403–412, PMID 18369878.
  4. P. O. Magalhães, A. M. Lopes, P. G. Mazzola, C. Rangel-Yagui, T. C. Penna, A. Pessoa Jr.: Methods of endotoxin removal from biological preparations: a review. In: J Pharm Pharm Sci. (2007) 10(3):388–404, PMID 17727802.
  5. M. Wetterhall, G. Shevchenko, K. Artemenko, M. Ö. Sjödin, J. Bergquist: Analysis of membrane and hydrophilic proteins simultaneously derived from the mouse brain using cloud-point extraction. In: Anal Bioanal Chem. (2011) 400(9):2827–2836. PMID 21553125.
  6. R. A. Mathias, Y. S. Chen, E. A. Kapp, D. W. Greening, S. Mathivanan, R. J. Simpson: Triton X-114 phase separation in the isolation and purification of mouse liver microsomal membrane proteins. In: Methods. (2011) 54(4):396–406, PMID 21272644.