„Expressionsvektor“ – Versionsunterschied

aus Wikipedia, der freien Enzyklopädie
Zur Navigation springen Zur Suche springen
Versionsgeschichte interaktiv durchsuchen
[gesichtete Version][gesichtete Version]
← Zum vorherigen VersionsunterschiedZum nächsten Versionsunterschied →
Inhalt gelöscht Inhalt hinzugefügt
VisuellWikitext
Zeile 8: Zeile 8:
== Bakterielle Expressionsvektoren ==
== Bakterielle Expressionsvektoren ==
[[Datei:PGEX-3X cloning vector.png|mini|Ein bakterieller Expressionsvektor]]
[[Datei:PGEX-3X cloning vector.png|mini|Ein bakterieller Expressionsvektor]]
Die kostengünstigste Form der Proteinexpression erfolgt in [[Einzeller]]n. Allerdings können nicht alle Proteine von [[Eukaryoten]] im [[Nativer Zustand|nativen Zustand]], wodurch die [[biologische Aktivität]] herabgesetzt wird oder unerwünschte [[Einschlusskörperchen]] entstehen können, die sich negativ auf die Ausbeute bei der Proteinreinigung auswirken. Als Wirte werden meisten ''[[Escherichia coli]]'', ''[[Bacillus subtilis]]'' oder seltener auch ''[[Ralstonia eutropha]]''<ref>S. Gruber, D. Schwendenwein, Z. Magomedova, E. Thaler, J. Hagen, H. Schwab, P. Heidinger: ''Design of inducible expression vectors for improved protein production in Ralstonia eutropha H16 derived host strains.'' In: ''Journal of biotechnology.'' Band 235, Oktober 2016, S.&nbsp;92–99, {{DOI|10.1016/j.jbiotec.2016.04.026}}, PMID 27085887.</ref> eingesetzt.
Die kostengünstigste Form der Proteinexpression erfolgt in [[Einzeller]]n. Allerdings können nicht alle Proteine von [[Eukaryoten]] im [[Nativer Zustand|nativen Zustand]], wodurch die [[biologische Aktivität]] herabgesetzt wird oder unerwünschte [[Einschlusskörperchen]] entstehen können, die sich negativ auf die Ausbeute bei der Proteinreinigung auswirken. Als Wirte werden meisten ''[[Escherichia coli]]'',<ref>G. J. Gopal, A. Kumar: ''Strategies for the production of recombinant protein in Escherichia coli.'' In: ''The protein journal.'' Band 32, Nummer 6, August 2013, S.&nbsp;419–425, {{DOI|10.1007/s10930-013-9502-5}}, PMID 23897421.</ref> ''[[Bacillus subtilis]]'' oder seltener auch ''[[Ralstonia eutropha]]''<ref>S. Gruber, D. Schwendenwein, Z. Magomedova, E. Thaler, J. Hagen, H. Schwab, P. Heidinger: ''Design of inducible expression vectors for improved protein production in Ralstonia eutropha H16 derived host strains.'' In: ''Journal of biotechnology.'' Band 235, Oktober 2016, S.&nbsp;92–99, {{DOI|10.1016/j.jbiotec.2016.04.026}}, PMID 27085887.</ref> eingesetzt.


Bakterielle Expressionsvektoren besitzen oftmals einen [[Promotor (Genetik)|Promotor]], der aus dem [[Lac-Operon|''lac''-Operon]] (meist die lacUV5-[[Mutation|Mutante]] ohne [[Katabolitrepression]]) oder aus dem [[Bakteriophage T7|Bakteriophagen T7]] (z. B. der ''pET''-Vektor) stammen.<ref>J. W. Dubendorff, F. W. Studier: ''Controlling basal expression in an inducible T7 expression system by blocking the target T7 promoter with lac repressor.'' In: ''Journal of molecular biology.'' Band 219, Nummer 1, Mai 1991, S.&nbsp;45–59, PMID 1902522.</ref> Plasmide des Typs pQE verwenden eine T5-Promotor mit einer geringeren [[Basaltranskription|Basalexpression]], die sich besser für wirtstoxische Proteine eignen.<ref>J. Konczal, C. H. Gray: ''Streamlining workflow and automation to accelerate laboratory scale protein production.'' In: ''Protein expression and purification.'' Band 133, Mai 2017, S.&nbsp;160–169, {{DOI|10.1016/j.pep.2017.03.016}}, PMID 28330825.</ref> Weiterhin werden Teile des [[Arabinose]]-sensitiven Promotors ''araBAD'' oder des [[Rhamnose]]-sensitiven Promotors ''rhaBAD'' zur Steuerung der [[Induktion (Genetik)|Induktion]] der [[Genexpression]] verwendet.<ref>L. Marschall, P. Sagmeister, C. Herwig: ''Tunable recombinant protein expression in E. coli: promoter systems and genetic constraints.'' In: ''[[Applied Microbiology and Biotechnology]].'' Band 101, Nummer 2, Januar 2017, S.&nbsp;501–512, {{DOI|10.1007/s00253-016-8045-z}}, PMID 27999902, {{PMC|5566544}}.</ref> Ebenso werden aus verschiedenen Ursprüngen zusammengesetzte Promotoren verwendet, wie der ''Tac''-Promotor aus dem [[Tryptophan|''trp'']]- und dem ''lac''-Promotor,<ref>H. A. de Boer, L. J. Comstock, M. Vasser: ''The tac promoter: a functional hybrid derived from the trp and lac promoters.'' In: ''[[Proceedings of the National Academy of Sciences]].'' Band 80, Nummer 1, Januar 1983, S.&nbsp;21–25, PMID 6337371, {{PMC|393301}}.</ref> beispielsweise beim ''pGex''-Vektor.
Bakterielle Expressionsvektoren besitzen oftmals einen [[Promotor (Genetik)|Promotor]], der aus dem [[Lac-Operon|''lac''-Operon]] (meist die lacUV5-[[Mutation|Mutante]] ohne [[Katabolitrepression]]) oder aus dem [[Bakteriophage T7|Bakteriophagen T7]] (z. B. der ''pET''-Vektor) stammen.<ref>J. W. Dubendorff, F. W. Studier: ''Controlling basal expression in an inducible T7 expression system by blocking the target T7 promoter with lac repressor.'' In: ''Journal of molecular biology.'' Band 219, Nummer 1, Mai 1991, S.&nbsp;45–59, PMID 1902522.</ref> Plasmide des Typs pQE verwenden eine T5-Promotor mit einer geringeren [[Basaltranskription|Basalexpression]], die sich besser für wirtstoxische Proteine eignen.<ref>J. Konczal, C. H. Gray: ''Streamlining workflow and automation to accelerate laboratory scale protein production.'' In: ''Protein expression and purification.'' Band 133, Mai 2017, S.&nbsp;160–169, {{DOI|10.1016/j.pep.2017.03.016}}, PMID 28330825.</ref> Weiterhin werden Teile des [[Arabinose]]-sensitiven Promotors ''araBAD'' oder des [[Rhamnose]]-sensitiven Promotors ''rhaBAD'' zur Steuerung der [[Induktion (Genetik)|Induktion]] der [[Genexpression]] verwendet.<ref>L. Marschall, P. Sagmeister, C. Herwig: ''Tunable recombinant protein expression in E. coli: promoter systems and genetic constraints.'' In: ''[[Applied Microbiology and Biotechnology]].'' Band 101, Nummer 2, Januar 2017, S.&nbsp;501–512, {{DOI|10.1007/s00253-016-8045-z}}, PMID 27999902, {{PMC|5566544}}.</ref> Ebenso werden aus verschiedenen Ursprüngen zusammengesetzte Promotoren verwendet, wie der ''Tac''-Promotor aus dem [[Tryptophan|''trp'']]- und dem ''lac''-Promotor,<ref>H. A. de Boer, L. J. Comstock, M. Vasser: ''The tac promoter: a functional hybrid derived from the trp and lac promoters.'' In: ''[[Proceedings of the National Academy of Sciences]].'' Band 80, Nummer 1, Januar 1983, S.&nbsp;21–25, PMID 6337371, {{PMC|393301}}.</ref> beispielsweise beim ''pGex''-Vektor.

Version vom 28. April 2018, 00:46 Uhr

Ein Expressionsvektor ist eine DNA, die zur Herstellung rekombinanter Proteine durch Überexpression verwendet wird.

Eigenschaften

Expressionsvektoren gehören zu den Vektoren. Sie besitzen ein Operon, damit in einem geeigneten Wirt oder durch eine zellfreie Genexpression eine mRNA mit einer proteincodierenden Sequenz, einen Replikationsursprung für die Replikation der DNA, eine Sequenz zur Selektion des Expressionsvektors (z. B. eine Antibiotikumresistenz oder eine Auxotrophie) und einen Polylinker, in die die proteincodierende Sequenz des gewünschten Proteins (das Insert) eingefügt wird.[1] Meistens wird die DNA in Form eines Plasmids verwendet. Oftmals wird zusätzlich eine codierende Sequenz für ein Protein-Tag an die proteincodierende Sequenz angefügt, wodurch ein Fusionsprotein entsteht, das sich leichter reinigen lässt.

Im Gegensatz zu Expressionsvektoren sind Klonierungsvektoren nicht für die Expression von Proteinen geeignet, sondern nur zur Klonierung. Es können in einem Wirt auch mehrere Proteine parallel erzeugt werden, sofern Plasmide mit unterschiedlichen Selektionsmechanismen verwendet werden, da bei gleichem Selektionsmechanismus nur eines notwendig ist und oftmals auch nur ein Typ vom Wirt behalten wird. Ebenso werden Vektoren mit zwei Promotoren eingesetzt.[2] Bei Eukaryoten können mit einer IRES zwischen zwei proteincodierenden Sequenzen zwei verschiedene Proteine parallel erzeugt werden, wobei die Ausbeute des Proteins mit der proteincodierenden Sequenz nach der IRES meist geringer ist.

Bakterielle Expressionsvektoren

Ein bakterieller Expressionsvektor

Die kostengünstigste Form der Proteinexpression erfolgt in Einzellern. Allerdings können nicht alle Proteine von Eukaryoten im nativen Zustand, wodurch die biologische Aktivität herabgesetzt wird oder unerwünschte Einschlusskörperchen entstehen können, die sich negativ auf die Ausbeute bei der Proteinreinigung auswirken. Als Wirte werden meisten Escherichia coli,[3] Bacillus subtilis oder seltener auch Ralstonia eutropha[4] eingesetzt.

Bakterielle Expressionsvektoren besitzen oftmals einen Promotor, der aus dem lac-Operon (meist die lacUV5-Mutante ohne Katabolitrepression) oder aus dem Bakteriophagen T7 (z. B. der pET-Vektor) stammen.[5] Plasmide des Typs pQE verwenden eine T5-Promotor mit einer geringeren Basalexpression, die sich besser für wirtstoxische Proteine eignen.[6] Weiterhin werden Teile des Arabinose-sensitiven Promotors araBAD oder des Rhamnose-sensitiven Promotors rhaBAD zur Steuerung der Induktion der Genexpression verwendet.[7] Ebenso werden aus verschiedenen Ursprüngen zusammengesetzte Promotoren verwendet, wie der Tac-Promotor aus dem trp- und dem lac-Promotor,[8] beispielsweise beim pGex-Vektor.

Eukaryotische Expressionsvektoren

Die kostengünstigste Expression in Eukaryoten wird in Hefen durchgeführt wie Saccharomyces cerevisiae oder Komagataella phaffii[9] (früher als Pichia pastoris bezeichnet, als Vektor z. B. pIC), die eine Glykosylierung der Proteine durchführen können. Sofern menschliche Glykosylierungsmuster erforderlich sind, wird eine Überexpression in Insektenzellkultur mit Baculovirus-Vektoren[10] oder in Säuger-Zellkulturen durchgeführt. In Säugerzellen wird oftmals ein CMV-immediate/early-Promotor oder ein SV40-Promotor verwendet und einen Poly-A-Schwanz. Als Vektoren werden Plasmide,[11] Yeast Artificial Chromosomes (in Hefen), Mammalian Artificial Chromosomes (in Säugerzellen)[12] oder virale Vektoren verwendet.[13]

In Pflanzen wird oftmals das Ti-Plasmid verwendet,[14] oder ein viraler Vektor basierend auf dem Tabakmosaikvirus (TMV), dem Potato-Virus X oder dem Cowpea-Mosaic-Virus.[15][16]

Literatur

Einzelnachweise

  1. ↑ Mary Campbell: Biochemistry. Cengage Learning, 2007, ISBN 978-0-495-39041-1, S. 378.
  2. ↑ S. Öztürk, B. G. Ergün, P. Çalık: Double promoter expression systems for recombinant protein production by industrial microorganisms. In: Applied Microbiology and Biotechnology. Band 101, Nummer 20, Oktober 2017, S. 7459–7475, doi:10.1007/s00253-017-8487-y, PMID 28900685.
  3. ↑ G. J. Gopal, A. Kumar: Strategies for the production of recombinant protein in Escherichia coli. In: The protein journal. Band 32, Nummer 6, August 2013, S. 419–425, doi:10.1007/s10930-013-9502-5, PMID 23897421.
  4. ↑ S. Gruber, D. Schwendenwein, Z. Magomedova, E. Thaler, J. Hagen, H. Schwab, P. Heidinger: Design of inducible expression vectors for improved protein production in Ralstonia eutropha H16 derived host strains. In: Journal of biotechnology. Band 235, Oktober 2016, S. 92–99, doi:10.1016/j.jbiotec.2016.04.026, PMID 27085887.
  5. ↑ J. W. Dubendorff, F. W. Studier: Controlling basal expression in an inducible T7 expression system by blocking the target T7 promoter with lac repressor. In: Journal of molecular biology. Band 219, Nummer 1, Mai 1991, S. 45–59, PMID 1902522.
  6. ↑ J. Konczal, C. H. Gray: Streamlining workflow and automation to accelerate laboratory scale protein production. In: Protein expression and purification. Band 133, Mai 2017, S. 160–169, doi:10.1016/j.pep.2017.03.016, PMID 28330825.
  7. ↑ L. Marschall, P. Sagmeister, C. Herwig: Tunable recombinant protein expression in E. coli: promoter systems and genetic constraints. In: Applied Microbiology and Biotechnology. Band 101, Nummer 2, Januar 2017, S. 501–512, doi:10.1007/s00253-016-8045-z, PMID 27999902, PMC 5566544 (freier Volltext).
  8. ↑ H. A. de Boer, L. J. Comstock, M. Vasser: The tac promoter: a functional hybrid derived from the trp and lac promoters. In: Proceedings of the National Academy of Sciences. Band 80, Nummer 1, Januar 1983, S. 21–25, PMID 6337371, PMC 393301 (freier Volltext).
  9. ↑ J. M. Cregg, J. L. Cereghino, J. Shi, D. R. Higgins: Recombinant protein expression in Pichia pastoris. In: Molecular biotechnology. Band 16, Nummer 1, September 2000, S. 23–52, doi:10.1385/MB:16:1:23, PMID 11098467.
  10. ↑ R. D. Possee, L. A. King: Baculovirus Transfer Vectors. In: Methods in molecular biology. Band 1350, 2016, S. 51–71, doi:10.1007/978-1-4939-3043-2_3, PMID 26820853.
  11. ↑ K. H. Khan: Gene expression in Mammalian cells and its applications. In: Advanced pharmaceutical bulletin. Band 3, Nummer 2, 2013, S. 257–263, doi:10.5681/apb.2013.042, PMID 24312845, PMC 3848218 (freier Volltext).
  12. ↑ A. Martella, S. M. Pollard, J. Dai, Y. Cai: Mammalian Synthetic Biology: Time for Big MACs. In: ACS synthetic biology. Band 5, Nummer 10, 10 2016, S. 1040–1049, doi:10.1021/acssynbio.6b00074, PMID 27076218.
  13. ↑ K. L. Hefferon: Virus expression vectors. In: Pharmaceutical patent analyst. Band 3, Nummer 3, Mai 2014, S. 249–260, doi:10.4155/ppa.14.17, PMID 24998286.
  14. ↑ R. Walden, J. Schell: Techniques in plant molecular biology–progress and problems. In: European journal of biochemistry. Band 192, Nummer 3, September 1990, S. 563–576, PMID 2209611.
  15. ↑ M. C. Cañizares, L. Nicholson, G. P. Lomonossoff: Use of viral vectors for vaccine production in plants. In: Immunology and cell biology. Band 83, Nummer 3, Juni 2005, S. 263–270, doi:10.1111/j.1440-1711.2005.01339.x, PMID 15877604.
  16. ↑ K. Hefferon: Plant Virus Expression Vectors: A Powerhouse for Global Health. In: Biomedicines. Band 5, Nummer 3, Juli 2017, S. , doi:10.3390/biomedicines5030044, PMID 28758953, PMC 5618302 (freier Volltext).
Abgerufen von „https://de.wikipedia.org/w/index.php?title=Expressionsvektor&oldid=176933207“