Electrophoretic Mobility Shift Assay

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Spur 1 enthält als Negativkontrolle nur DNA, Spur 2 enthält DNA und ein nicht bindendes Protein, Spur 3 enthält DNA und ein bindendes Protein. Bei unvollständiger Bindung kann eine zusätzliche Bande ungebundener DNA auftreten.

Der Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) oder Band Shift Assay ist eine Affinitätselektrophorese und dient zum Nachweis von DNA- oder RNA-bindenden Proteinen, beispielsweise Transkriptionsfaktoren.[1][2]

Eigenschaften[Bearbeiten]

Zur Bestimmung von Protein-DNA-Interaktionen per EMSA werden Proteine mit einem DNA-Fragment bekannter Sequenz inkubiert, bei Protein-RNA-Interaktionen entsprechend mit einem RNA-Fragment. Bei der DNA-Sequenz handelt es sich meist um einen regulatorischen Bereich eines Gens (beispielsweise eines Promotors oder Enhancers). Die Probe wird auf ein Agarose- oder Polyacrylamid-Gel aufgetragen und mittels eines elektrischen Feldes werden die Komplexe aus Protein, DNA und eventuell ein Antikörper entsprechend ihrer Größe aufgetrennt.[3] Im Vergleich zur reinen Protein- oder DNA-Bande tritt bei der Gelelektrophorese eine Laufweitenverschiebung (engl. band shift) auf, abhängig von Ladung, Konformation und Größe des Proteinligandenkomplexes. DNA-Protein-Antikörper-Komplexe wandern langsamer als DNA-Protein-Komplexe, welche langsamer als ungebundene DNA wandern, ungebundene Proteine wandern am schnellsten. Durch Verdünnungsreihen lassen sich Affinitäten ermitteln.[4] Die Komplexe dissoziieren nicht in der Elektrophorese durch einen Käfig-Effekt der Poren im Gel.[5]

Durch Markierung der DNA können die Banden im Gel sichtbar gemacht werden, beispielsweise durch Molekülmarkierung mit einem Radionuklid, per Digoxygenin-Markierung, per Biotinylierung oder mittels einer Fluoreszenzmarkierung. Je weniger ein Komplex im Gel gewandert ist, desto größer ist seine molare Masse. Hierbei dient zur Spezifizierung der Banden nicht nur die DNA und der Antikörper, sondern es kann auch nicht-markierte DNA in unterschiedlicher Menge zum Blockieren aber auch mutierte DNA zum Herausfiltern eines spezifischen Signals eingesetzt werden.

Enthält die Affinitäselektrophorese neben der DNA und einem interagierenden Protein noch einen Antikörper gegen das Protein, wird der Assay als Supershift Assay bezeichnet.

Literatur[Bearbeiten]

  • Tom Moss (Herausgeber): DNA'Protein Interactions: Principles and Protocols (Methods in Molecular Biology), Humana, 2. Auflage 2001, ISBN 978-0896036710.

Weblinks[Bearbeiten]

Einzelnachweise[Bearbeiten]

  1. Garner MM, Revzin A: A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. In: Nucleic Acids Res.. 9, Nr. 13, July 1981, S. 3047–60. doi:10.1093/nar/9.13.3047. PMID 6269071. PMC: 327330 (freier Volltext).
  2. Fried M, Crothers DM: Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. In: Nucleic Acids Res.. 9, Nr. 23, December 1981, S. 6505–25. doi:10.1093/nar/9.23.6505. PMID 6275366. PMC: 327619 (freier Volltext).
  3. Ausubel, Frederick M.: Current Protocols in molecular biology. John Wiley & Sons, Chichester 1994, ISBN 0-471-50337-1, S. 12.2.1–11.
  4. Fried MG (1989) "Measurement of protein-DNA interaction parameters by electrophoresis mobility shift assay".Electrophoresis 10, 366-376. PMID 2670548.
  5. Fried MG, Liu G. (1994). "Molecular sequestration stabilizes CAP- DNA complexes during polyacrylamide gel electrophoresis". Nucleic Acids Research 22(23): 5054-5059. doi: 10.1093/nar/22.23.5054. PMID 7800499.