Golden-Gate-Klonierung
Die Golden-Gate-Klonierung (engl. Golden Gate Assembly) ist eine biochemische Methode zur Klonierung. Sie wurde von Sylvestre Marillonet entwickelt, um Hochdurchsatz-Klonierungen zu erlauben.[1] Mit Hilfe von Typ IIs-Restriktionsenzymen und T4 DNA-Ligase ist der gleichzeitige Zusammenbau mehrerer DNA-Fragmente in vitro in korrekter Orientierung möglich.[2][1] Die bei dieser Methode eingesetzten Typ IIs-Restriktionsenzyme, wie BsaI, BsmBI und BbsI, schneiden außerhalb ihrer Erkennungssequenz und können daher nicht-palindromische, 4 Basenpaar lange Überhänge generieren, die nach einer Ligation keine Schnittstellen mehr aufweisen. Da die Restriktionsschnittstellen nicht Teil des entstandenen Konstruktes sind, können Restriktionsverdau und Ligation simultan durchgeführt werden. Die Methode wird u. a. für die Herstellung von TALEN für das Genome Editing genutzt.[3]
Name
[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]Der Name Golden Gate Assembly soll nach einem Vorschlag von Yuri Gleba[1] einerseits einen Bezug auf die Gateway-Klonierung herstellen, andererseits soll die höhere Präzision durch eine Brücke, die die Straßen von zwei Ufern nahtlos miteinander verbindet, symbolisch dargestellt werden. Eine der bekanntesten Brücken ist die Golden Gate Bridge in San Francisco.
Golden Mutagenesis
[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]Das Golden Gate Klonierungs-Prinzip kann auch für die Mutagenese verwendet werden und wird Golden Mutagenesis genannt. Die Technik ist einfach zu implementieren, da ein Web Tool für das Primerdesign vorhanden ist.[4][5]
Einzelnachweise
[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]- ↑ a b c C. Engler, R. Kandzia, S. Marillonet: A One Pot, One Step, Precision Cloning Method with High Throughput Capability. In: PLOS One Band 3(11), 2008, e3647, doi:10.1371/journal.pone.0003647, PMID 18985154, PMC 2574415 (freier Volltext)
- ↑ E. Weber, C. Engler, R. Gruetzner, S. Werner, S. Marillonnet: A modular cloning system for standardized assembly of multigene constructs. In: PloS one. Band 6, Nummer 2, 2011, S. e16765, doi:10.1371/journal.pone.0016765, PMID 21364738, PMC 3041749 (freier Volltext).
- ↑ N.E. Sanjana, L. Cong, Y. Zhou, M. M. Cunniff, G. Feng, F. Zhang: A Transcription Activator-Like Effector Toolbox for Genome Engineering. In: Nature Protocols Band 7(1), (2012), S. 171–192. PMID 22222791.
- ↑ Leibniz-Institut für Pflanzenbiochemie: Golden Mutagenesis
- ↑ Pascal Püllmann, Chris Ulpinnis, Sylvestre Marillonnet, Ramona Gruetzner, Steffen Neumann: Golden Mutagenesis: An efficient multi-site-saturation mutagenesis approach by Golden Gate cloning with automated primer design. In: Scientific Reports. Band 9, Nr. 1, 29. Juli 2019, ISSN 2045-2322, S. 1–11, doi:10.1038/s41598-019-47376-1 (nature.com [abgerufen am 5. März 2020]).