Taq-Polymerase

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Taq-Polymerase I
Taq-Polymerase I
Vorhandene Strukturdaten: s. UniProt
Masse/Länge Primärstruktur 835 Aminosäuren
Bezeichner
Gen-Name(n) polA
Externe IDs
Enzymklassifikation
EC, Kategorie 2.7.7.7Nukleotidyltransferase
Substrat Desoxyribonucleosidtriphosphat + DNAn
Produkte Diphosphat + DNAn+1

Die Taq-Polymerase ist die thermostabile DNA-Polymerase des Bakteriums Thermus aquaticus (Taq). Dieses Bakterium lebt in Geysiren bei etwa 70 °C. Taq-Polymerase ist außerordentlich hitzebeständig und gehört zu den Extremozymen. Die Ursache hierfür liegt im Vorhandensein eines mutierten Kälteschockproteins, welches sich von vergleichbaren Proteinen mesophiler Bakterien durch den Austausch von zwei Aminosäuren unterscheidet. 1969 wurde die Taq-Polymerase erstmals von Thomas D. Brock und Hudson Freeze isoliert.[1]

Eigenschaften[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

Das Enzym wird hauptsächlich zur DNA-Vervielfältigung mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion eingesetzt. DNA-Polymerasen von mesophilen Organismen würden bei Erhitzung während der Polymerase-Kettenreaktion denaturiert und müssten nach jedem Zyklus neu hinzugegeben werden. Bei der DNA-Vervielfältigung mit Taq-Polymerase ist dies nicht notwendig, da das Enzym auch bei hohen Temperaturen noch sehr stabil ist (die Enzym-Halbwertszeit beträgt bei 97,5 °C ca. 9 Minuten[2]). Die DNA-Amplifikation mit Taq ist jedoch fehleranfällig, denn das Enzym besitzt keine 3' → 5'-Exonukleaseaktivität und damit keine proof reading-Funktion. Die Fehlerrate der Taq-Polymerase beträgt 8 · 10−6 Fehler pro Basenpaar.[3] In den amplifizierten DNA-Fragmenten finden sich deshalb häufig Mutationen, die durch ungenaues Kopieren des Matrizenstranges entstehen. Werden sequenzexakte DNA-Amplifikate benötigt, empfiehlt sich daher der Einsatz von Polymerasen mit proof reading-Funktion, etwa von Pfu-, Pwo-Polymerase oder Pfx-Polymerasen (die ursprünglich ebenfalls aus thermophilen Mikroorganismen isoliert wurden), deren Einsatz jedoch kostenintensiver ist.

Bei der Amplifikation eines DNA-Fragments hängt die Taq-Polymerase ein zusätzliches Nukleotid (dATP) an das 3'-Ende des synthetisierten Strangs. Man spricht von einem 3'-A-Überhang (A für Adenin), da sich auf dem Matrizenstrang keine komplementäre Nukleobase (Thymin) befindet. Der 3'-Überhang wird durch das Fehlen der proof reading-Funktion nicht korrigiert und findet Anwendung beim Verfahren der TA-Klonierung. Durch eine Deletion der ersten 289 Aminosäuren wird das Stoffel-Fragment erzeugt.[4]

Die Massenproduktion des Enzyms erfolgt durch Übertragung des Gens auf einen Stamm des Bakteriums Escherichia coli. Aus diesen Kulturen wird das Protein gereinigt und in einem glycerolhaltigen Puffer bei −20 °C aufbewahrt.

Einzelnachweise[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

  1. D. Perl, U. Mueller, U. Heinemann, F. X. Schmid: Two exposed amino acid residues confer thermostability on a cold shock protein. In: Nat. Struct. Biol. Band 7, Nr. 5, Mai 2000, S. 380–383, doi:10.1038/75151, PMID 10802734.
  2. F. C. Lawyer, S. Stoffel, R. K. Saiki u. a.: High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5' to 3' exonuclease activity. In: PCR Methods Appl. Band 2, Nr. 4, Mai 1993, S. 275–287, PMID 8324500.
  3. J. Cline, J. C. Braman, H. H. Hogrefe: PCR fidelity of pfu DNA polymerase and other thermostable DNA polymerases. In: Nucleic Acids Research. (1996), Bd. 24(18), S. 3546–51. PMID 8836181; PMC 146123 (freier Volltext).
  4. S. Dabrowski, J. Kur: Recombinant His-tagged DNA polymerase. II. Cloning and purification of Thermus aquaticus recombinant DNA polymerase (Stoffel fragment). In: Acta biochimica Polonica. Band 45, Nummer 3, 1998, S. 661–667, PMID 9918492.