„Expressionsvektor“ – Versionsunterschied

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Expressionsvektoren gehören zu den [[Vektor (Gentechnik)|Vektoren]]. Sie besitzen ein [[Operon]], damit in einem geeigneten [[Wirt (Biologie)|Wirt]] oder durch eine [[zellfreie Genexpression]]<ref>A. K. Brödel, D. A. Wüstenhagen, S. Kubick: ''Cell-free protein synthesis systems derived from cultured mammalian cells.'' In: ''Methods in molecular biology.'' Band 1261, 2015, S.&nbsp;129–140, {{DOI|10.1007/978-1-4939-2230-7_7}}, PMID 25502197.</ref><ref>Dmitriy A. Vinarov, Carrie L. Loushin Newman, Ejan M. Tyler, John L. Markley, Mark N. Shahan: ''Wheat Germ Cell‐Free Expression System for Protein Production.'' In: ''Current Protocols in Protein Science'' (2006). Band 44, Ausgabe 1, S. 5.18.1-5.18.18. [[doi:10.1002/0471140864.ps0518s44]].</ref> eine [[mRNA]] mit einer proteincodierenden Sequenz erzeugt wird. Darüber hinaus besitzen sie einen [[Replikationsursprung]] für die [[Replikation]] der DNA, eine Sequenz zur [[Selektion (Evolution)|Selektion]] des Expressionsvektors (z. B. eine [[Antibiotikaresistenz|Antibiotikumresistenz]] oder eine [[Auxotrophie]]) und einen [[Polylinker]], in die die proteincodierende Sequenz des gewünschten Proteins (das ''Insert'') eingefügt wird.<ref name="Campbell">Mary Campbell: ''Biochemistry.'' Cengage Learning, 2007, ISBN 978-0-495-39041-1, S.&nbsp;378.</ref> Meistens wird die DNA in Form eines [[Plasmid]]s verwendet. Oftmals wird zusätzlich eine codierende Sequenz für ein [[Protein-Tag]] an die proteincodierende Sequenz angefügt, wodurch ein [[Fusionsprotein]] entsteht, das sich leichter [[Proteinreinigung|reinigen]] lässt.
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Im Gegensatz zu Expressionsvektoren sind [[Klonierungsvektor]]en nicht für die Expression von Proteinen geeignet, sondern nur zur [[Klonierung]]. Es können in einem Wirt auch mehrere Proteine parallel erzeugt werden, sofern Plasmide mit unterschiedlichen Selektionsmechanismen verwendet werden, da bei gleichem Selektionsmechanismus nur eines notwendig ist und oftmals auch nur ein Typ vom Wirt behalten wird. Ebenso werden Vektoren mit zwei Promotoren eingesetzt.<ref>S. Öztürk, B. G. Ergün, P. Çalık: ''Double promoter expression systems for recombinant protein production by industrial microorganisms.'' In: ''[[Applied Microbiology and Biotechnology]].'' Band 101, Nummer 20, Oktober 2017, S.&nbsp;7459–7475, {{DOI|10.1007/s00253-017-8487-y}}, PMID 28900685.</ref> Bei Bakterien können auch Konstrukte mit zwei [[Cistron]]s eingesetzt werden.<ref>B. E. Schoner, R. M. Belagaje, R. G. Schoner: ''Translation of a synthetic two-cistron mRNA in Escherichia coli.'' In: ''[[Proceedings of the National Academy of Sciences]].'' Band 83, Nummer 22, November 1986, S.&nbsp;8506–8510, PMID 3534891, {{PMC|386959}}.</ref> Bei Eukaryoten können mit einer [[IRES (Biologie)|IRES]] zwischen zwei proteincodierenden Sequenzen zwei verschiedene Proteine parallel erzeugt werden, wobei die Ausbeute des Proteins mit der proteincodierenden Sequenz nach der IRES meist geringer ist.
Im Gegensatz zu Expressionsvektoren sind [[Klonierungsvektor]]en nicht für die Expression von Proteinen geeignet, sondern nur zur [[Klonierung]]. Es können in einem Wirt auch mehrere Proteine parallel erzeugt werden, sofern Plasmide mit unterschiedlichen Selektionsmechanismen verwendet werden, da bei gleichem Selektionsmechanismus nur eines notwendig ist und oftmals auch nur ein Typ vom Wirt behalten wird. Ebenso werden Vektoren mit zwei Promotoren eingesetzt.<ref>S. Öztürk, B. G. Ergün, P. Çalık: ''Double promoter expression systems for recombinant protein production by industrial microorganisms.'' In: ''[[Applied Microbiology and Biotechnology]].'' Band 101, Nummer 20, Oktober 2017, S.&nbsp;7459–7475, {{DOI|10.1007/s00253-017-8487-y}}, PMID 28900685.</ref> Bei Bakterien können auch Konstrukte mit zwei [[Cistron]]s eingesetzt werden.<ref>B. E. Schoner, R. M. Belagaje, R. G. Schoner: ''Translation of a synthetic two-cistron mRNA in Escherichia coli.'' In: ''[[Proceedings of the National Academy of Sciences]].'' Band 83, Nummer 22, November 1986, S.&nbsp;8506–8510, PMID 3534891, {{PMC|386959}}.</ref> Bei Eukaryoten können mit einer [[IRES (Biologie)|IRES]] zwischen zwei proteincodierenden Sequenzen zwei verschiedene Proteine parallel erzeugt werden, wobei die Ausbeute des Proteins mit der proteincodierenden Sequenz nach der IRES meist geringer ist.

Version vom 29. April 2018, 09:18 Uhr

Ein Expressionsvektor ist eine DNA, die zur Herstellung rekombinanter Proteine durch Überexpression verwendet wird.

Eigenschaften

Expressionsvektoren gehören zu den Vektoren. Sie besitzen ein Operon, damit in einem geeigneten Wirt oder durch eine zellfreie Genexpression[1][2][3] eine mRNA mit einer proteincodierenden Sequenz erzeugt wird. Darüber hinaus besitzen sie einen Replikationsursprung für die Replikation der DNA, eine Sequenz zur Selektion des Expressionsvektors (z. B. eine Antibiotikumresistenz oder eine Auxotrophie) und einen Polylinker, in die die proteincodierende Sequenz des gewünschten Proteins (das Insert) eingefügt wird.[4] Meistens wird die DNA in Form eines Plasmids verwendet. Oftmals wird zusätzlich eine codierende Sequenz für ein Protein-Tag an die proteincodierende Sequenz angefügt, wodurch ein Fusionsprotein entsteht, das sich leichter reinigen lässt.

Im Gegensatz zu Expressionsvektoren sind Klonierungsvektoren nicht für die Expression von Proteinen geeignet, sondern nur zur Klonierung. Es können in einem Wirt auch mehrere Proteine parallel erzeugt werden, sofern Plasmide mit unterschiedlichen Selektionsmechanismen verwendet werden, da bei gleichem Selektionsmechanismus nur eines notwendig ist und oftmals auch nur ein Typ vom Wirt behalten wird. Ebenso werden Vektoren mit zwei Promotoren eingesetzt.[5] Bei Bakterien können auch Konstrukte mit zwei Cistrons eingesetzt werden.[6] Bei Eukaryoten können mit einer IRES zwischen zwei proteincodierenden Sequenzen zwei verschiedene Proteine parallel erzeugt werden, wobei die Ausbeute des Proteins mit der proteincodierenden Sequenz nach der IRES meist geringer ist.

Bakterielle Expressionsvektoren

Ein bakterieller Expressionsvektor

Die kostengünstigste Form der Proteinexpression erfolgt in Einzellern. Allerdings können nicht alle Proteine von Eukaryoten von Bakterien im nativen Zustand erzeugt werden, wodurch die biologische Aktivität herabgesetzt wird oder unerwünschte Einschlusskörperchen entstehen können, die sich negativ auf die Ausbeute bei der Proteinreinigung auswirken. Als Wirte werden meisten Escherichia coli,[7] Bacillus subtilis oder seltener auch Ralstonia eutropha[8] eingesetzt.

Bakterielle Expressionsvektoren besitzen oftmals einen Promotor, der aus dem lac-Operon (meist die lacUV5-Mutante ohne Katabolitrepression)[9] oder aus dem Bakteriophagen T7 (z. B. der pET-Vektor) stammen.[10] Plasmide des Typs pQE verwenden eine T5-Promotor mit einer geringeren Basalexpression, die sich besser für wirtstoxische Proteine eignen.[11] Weiterhin werden Teile des Arabinose-sensitiven Promotors araBAD oder des Rhamnose-sensitiven Promotors rhaBAD zur Steuerung der Induktion der Genexpression verwendet.[12] Ebenso werden aus verschiedenen Ursprüngen zusammengesetzte Promotoren verwendet, wie der Tac-Promotor aus dem trp- und dem lac-Promotor,[13] beispielsweise beim pGex-Vektor.

Eukaryotische Expressionsvektoren

Die kostengünstigste Expression in Eukaryoten wird in Hefen durchgeführt wie Saccharomyces cerevisiae oder Komagataella phaffii[14] (früher als Pichia pastoris bezeichnet, als Vektor z. B. pIC), die eine Glykosylierung der Proteine durchführen können. Sofern menschenähnlichere Glykosylierungsmuster erforderlich sind, wird eine Überexpression in Insektenzellkultur mit Baculovirus-Vektoren[15] oder in Säuger-Zellkulturen durchgeführt.[16] In Säugerzellen wird oftmals ein CMV-immediate/early-Promotor oder ein SV40-Promotor verwendet und eine Poly-A-Sequenz, seltener auch ein EF-1-Promotor.[17] Als Vektoren werden Plasmide,[18] Yeast Artificial Chromosomes (in Hefen), Mammalian Artificial Chromosomes (in Säugerzellen)[19] oder virale Vektoren verwendet.[20] Plasmide besitzen zwar ein eukaryotisches Operon, aber zur kostengünstigen Vermehrung in Bakterien einen bakteriellen Replikationsursprung.

In Pflanzen wird oftmals das Ti-Plasmid verwendet,[21] oder ein viraler Vektor basierend auf dem Tabakmosaikvirus (TMV), dem Potato-Virus X oder dem Cowpea-Mosaic-Virus.[22][23]

Literatur

Einzelnachweise

  1. ↑ T. Terada, T. Murata, M. Shirouzu, S. Yokoyama: Cell-free expression of protein complexes for structural biology. In: Methods in molecular biology. Band 1091, 2014, S. 151–159, doi:10.1007/978-1-62703-691-7_10, PMID 24203330.
  2. ↑ A. K. Brödel, D. A. Wüstenhagen, S. Kubick: Cell-free protein synthesis systems derived from cultured mammalian cells. In: Methods in molecular biology. Band 1261, 2015, S. 129–140, doi:10.1007/978-1-4939-2230-7_7, PMID 25502197.
  3. ↑ Dmitriy A. Vinarov, Carrie L. Loushin Newman, Ejan M. Tyler, John L. Markley, Mark N. Shahan: Wheat Germ Cell‐Free Expression System for Protein Production. In: Current Protocols in Protein Science (2006). Band 44, Ausgabe 1, S. 5.18.1-5.18.18. doi:10.1002/0471140864.ps0518s44.
  4. ↑ Mary Campbell: Biochemistry. Cengage Learning, 2007, ISBN 978-0-495-39041-1, S. 378.
  5. ↑ S. Öztürk, B. G. Ergün, P. Çalık: Double promoter expression systems for recombinant protein production by industrial microorganisms. In: Applied Microbiology and Biotechnology. Band 101, Nummer 20, Oktober 2017, S. 7459–7475, doi:10.1007/s00253-017-8487-y, PMID 28900685.
  6. ↑ B. E. Schoner, R. M. Belagaje, R. G. Schoner: Translation of a synthetic two-cistron mRNA in Escherichia coli. In: Proceedings of the National Academy of Sciences. Band 83, Nummer 22, November 1986, S. 8506–8510, PMID 3534891, PMC 386959 (freier Volltext).
  7. ↑ G. J. Gopal, A. Kumar: Strategies for the production of recombinant protein in Escherichia coli. In: The protein journal. Band 32, Nummer 6, August 2013, S. 419–425, doi:10.1007/s10930-013-9502-5, PMID 23897421.
  8. ↑ S. Gruber, D. Schwendenwein, Z. Magomedova, E. Thaler, J. Hagen, H. Schwab, P. Heidinger: Design of inducible expression vectors for improved protein production in Ralstonia eutropha H16 derived host strains. In: Journal of biotechnology. Band 235, Oktober 2016, S. 92–99, doi:10.1016/j.jbiotec.2016.04.026, PMID 27085887.
  9. ↑ A. E. Silverstone, R. R. Arditti, B. Magasanik: Catabolite-insensitive revertants of lac promoter mutants. In: Proceedings of the National Academy of Sciences. Band 66, Nummer 3, Juli 1970, S. 773–779, PMID 4913210, PMC 283117 (freier Volltext).
  10. ↑ J. W. Dubendorff, F. W. Studier: Controlling basal expression in an inducible T7 expression system by blocking the target T7 promoter with lac repressor. In: Journal of molecular biology. Band 219, Nummer 1, Mai 1991, S. 45–59, PMID 1902522.
  11. ↑ J. Konczal, C. H. Gray: Streamlining workflow and automation to accelerate laboratory scale protein production. In: Protein expression and purification. Band 133, Mai 2017, S. 160–169, doi:10.1016/j.pep.2017.03.016, PMID 28330825.
  12. ↑ L. Marschall, P. Sagmeister, C. Herwig: Tunable recombinant protein expression in E. coli: promoter systems and genetic constraints. In: Applied Microbiology and Biotechnology. Band 101, Nummer 2, Januar 2017, S. 501–512, doi:10.1007/s00253-016-8045-z, PMID 27999902, PMC 5566544 (freier Volltext).
  13. ↑ H. A. de Boer, L. J. Comstock, M. Vasser: The tac promoter: a functional hybrid derived from the trp and lac promoters. In: Proceedings of the National Academy of Sciences. Band 80, Nummer 1, Januar 1983, S. 21–25, PMID 6337371, PMC 393301 (freier Volltext).
  14. ↑ J. M. Cregg, J. L. Cereghino, J. Shi, D. R. Higgins: Recombinant protein expression in Pichia pastoris. In: Molecular biotechnology. Band 16, Nummer 1, September 2000, S. 23–52, doi:10.1385/MB:16:1:23, PMID 11098467.
  15. ↑ R. D. Possee, L. A. King: Baculovirus Transfer Vectors. In: Methods in molecular biology. Band 1350, 2016, S. 51–71, doi:10.1007/978-1-4939-3043-2_3, PMID 26820853.
  16. ↑ 24312845.
  17. ↑ D. W. Kim, T. Uetsuki, Y. Kaziro, N. Yamaguchi, S. Sugano: Use of the human elongation factor 1 alpha promoter as a versatile and efficient expression system. In: Gene. Band 91, Nummer 2, Juli 1990, S. 217–223, PMID 2210382.
  18. ↑ K. H. Khan: Gene expression in Mammalian cells and its applications. In: Advanced pharmaceutical bulletin. Band 3, Nummer 2, 2013, S. 257–263, doi:10.5681/apb.2013.042, PMID 24312845, PMC 3848218 (freier Volltext).
  19. ↑ A. Martella, S. M. Pollard, J. Dai, Y. Cai: Mammalian Synthetic Biology: Time for Big MACs. In: ACS synthetic biology. Band 5, Nummer 10, 10 2016, S. 1040–1049, doi:10.1021/acssynbio.6b00074, PMID 27076218.
  20. ↑ K. L. Hefferon: Virus expression vectors. In: Pharmaceutical patent analyst. Band 3, Nummer 3, Mai 2014, S. 249–260, doi:10.4155/ppa.14.17, PMID 24998286.
  21. ↑ R. Walden, J. Schell: Techniques in plant molecular biology–progress and problems. In: European journal of biochemistry. Band 192, Nummer 3, September 1990, S. 563–576, PMID 2209611.
  22. ↑ M. C. Cañizares, L. Nicholson, G. P. Lomonossoff: Use of viral vectors for vaccine production in plants. In: Immunology and cell biology. Band 83, Nummer 3, Juni 2005, S. 263–270, doi:10.1111/j.1440-1711.2005.01339.x, PMID 15877604.
  23. ↑ K. Hefferon: Plant Virus Expression Vectors: A Powerhouse for Global Health. In: Biomedicines. Band 5, Nummer 3, Juli 2017, S. , doi:10.3390/biomedicines5030044, PMID 28758953, PMC 5618302 (freier Volltext).
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