Plasmidpräparation

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Die Plasmidpräparation (auch Plasmidisolierung) ist eine molekularbiologische Methode zur Isolierung von Plasmid-DNA. Die Plasmidpräparation ist eine Variante der DNA-Extraktion.

Anwendung[Bearbeiten]

Die Verwendung von Plasmiden erlaubt es, genetisches Material in Bakterien zu vervielfältigen oder bestimmte Gene in andere Organismen zu übertragen. Die Ausbeute an Plasmiden hängt unter anderem vom Bakterienstamm, dem verwendeten Kulturmedium, dem Replikationsursprung des Plasmids (sog. high copy plasmids oder low copy plasmids) und den Kulturbedingungen ab (Schüttler bis zu 200 Rotationen pro Minute, Form der Kulturflasche wie z. B. Schikanenkolben, Temperatur). Zur Isolierung kleiner Mengen an Plasmiden (bis 25 µg) steht die Minipräp zur Verfügung, für größere Mengen bis 0,5 mg eignet sich die Maxipräp, darüber bis 2 mg die Megaprep und bis 10 mg die Gigaprep. Die Plasmidpräparation wird verwendet, um Plasmide aus transformierten Bakterien, zumeist Escherichia coli, präparativ zu erhalten.

Alkalische Lyse[Bearbeiten]

Hauptartikel: DNA-Extraktion

Es gibt mehrere Möglichkeiten zur Plasmidpräparation, eine häufig verwendete ist die "alkalische Lyse".[1] Die Bakterien mit dem Plasmid werden mit ca. 5000 x g abzentrifugiert und das Pellet anschließend in einem Puffer resuspendiert. Zur Degradation störender RNA enthält die Lösung meist zusätzlich eine RNase. Durch Zugabe einer Lösung von SDS und Natriumhydroxid werden die Zellen durch das Detergens und die alkalische Verseifung der Lipide lysiert. Die Zugabe einer leicht sauren Kaliumacetat-Lösung (pH-Wert 5,2) bewirkt zum Einen eine Neutralisation und zum Anderen, mit Hilfe des in der zweiten Lösung enthaltenen SDS, dass die Proteine und die genomische DNA ausgefällt werden. Nach einer weiteren Zentrifugation wird die gelöste Plasmid-DNA gelegentlich einer zusätzlichen Reinigung unterzogen z.B. einer Phenol-Chloroform-Extraktion oder einer Adsorption an Silicagel.[2][3][4] Die DNA kann dann mit einem Alkohol wie Ethanol oder Isopropanol ausgefällt werden. Der Alkohol entzieht der DNA die Hydrathülle. Mit 70 % Ethanol wird die gefällte DNA dann gewaschen und steht dann zur weiteren Verarbeitung zu Verfügung. Zur Vermessung der Konzentration im Photometer kann die DNA zum Beispiel in Wasser oder TRIS/EDTA-Puffer (pH 7,5) wieder gelöst werden.

Koch-Lyse[Bearbeiten]

Eine andere Aufschlussmethode stellt z. B. die sogenannte "Koch-Lyse" dar. Dabei werden die bakteriellen Zellwände im Zuge eines Zellaufschlusses durch Zugabe von Lysozym zerstört und die lysierten Bakterien für kurze Zeit aufgekocht. Die bakteriellen Abbauprodukte werden abzentrifugiert. Aus dem Überstand werden durch Zugabe von Phenol, Chloroform und Isoamylalkohol bakterielle Proteine und Membranen denaturiert, während die Plasmid DNA in der wässrigen Phase bleibt. Nach einem weiteren Zentrifugationsschritt zur Phasentrennung kann aus dem Überstand die Plasmid-DNA präzipitiert werden.

Alternative Verfahren[Bearbeiten]

Hauptartikel: DNA-Reinigung

Weitere, generelle DNA-Reinigungsmethoden sind z. B. die CsCl-Dichtegradientenzentrifugation.

Einzelnachweise[Bearbeiten]

  1. H. C. Birnboim, J. Doly: A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. In: Nucleic Acids Res. (1979), Band 7(6), S. 1513-23. PMID 388356; PMC 342324 (freier Volltext).
  2. M. A. Marko, R. Chipperfield, H. C. Birnboim: A procedure for the large-scale isolation of highly purified plasmid DNA using alkaline extraction and binding to glass powder. In: Anal Biochem. (1982), Band 121(2), S. 382-7. PMID 6179438.
  3. R. Boom, C. J. Sol, M. M. Salimans, C. L. Jansen, P. M. Wertheim-van Dillen, J. van der Noordaa: Rapid and simple method for purification of nucleic acids. In: J Clin Microbiol. (1990), Band 28(3), S. 495-503. PMID 1691208; PMC 269651 (freier Volltext).
  4. T. A. Borodina, H. Lehrach, A. V. Soldatov: DNA purification on homemade silica spin-columns. In: Anal Biochem. (2003), Band 321(1), S. 135-7. PMID 12963065.