Dichtegradientenzentrifugation

Die Dichtegradientenzentrifugation gehört zu den physikalischen Trennverfahren von Partikeln anhand der Sedimentation in einem Dichtegradienten. Verschiedene gelöste Makromoleküle werden in einer Ultrazentrifuge anhand ihrer Bewegungsgeschwindigkeit (Sedimentationsgeschwindigkeit) oder Dichte unter dem Einfluss starker Zentrifugalkräfte sortiert.

Eigenschaften

Dabei hängt die Bewegungsgeschwindigkeit ab von

• der Winkelgeschwindigkeit des Rotors
• dem Abstand des Maximums des Konzentrationsgradienten vom Rotorzentrum
• der Form des Moleküls
• der Dichte des Lösungsmittels
• der Viskosität des Lösungsmittels.

einfacher Gradientenmischer

Für die Dichtegradientenzentrifugation ist ein Lösungsmittel erforderlich, das infolge eines von unten nach oben verlaufenden Konzentrationsgefälles eines darin gelösten Stoffes eine von oben nach unten ansteigendende Dichte aufweist. Dies wird erreicht, indem das Zentrifugenglas mit einem ansteigenden Gradienten einer Lösung gefüllt wird. Bei umgekehrter Reihenfolge vermischt sich die Lösung beim Absinken der schwereren Lösung, der Gradient sinkt dabei auf null. Die höchste Dichte des Gradienten liegt am Boden des Zentrifugenglases, und jeder Bereich hat eine größere Dichte als der unmittelbar darüber (in Richtung Rotormittelpunkt) liegende. Durch den Gradienten nähert sich die Wanderungsgeschwindigkeit bei zunehmender Entfernung vom Rotormittelpunkt einer linearen Zunahme, ohne Dichtegradient wächst sie sich exponentiell mit dem Radius. Eine Möglichkeit, einen solchen Dichtegradienten zu erzeugen, ist der Gradientenmischer. Die zu untersuchende Probe wird auf die Oberfläche dieser Lösung mit dem Gradienten gegeben. Während der mehrstündigen Trennung sedimentieren die Moleküle mit unterschiedlicher Geschwindigkeit in der Lösung, und zwar solange die Dichte der Probe größer ist als die Dichte des Lösungsmittels und umso schneller, je größer der Dichteunterschied ist. Nach Einstellung des Gleichgewichts erhält man unterschiedliche Banden der Bestandteile der Probe. Bei Erreichen einer Dichte, die der des Moleküls entspricht, endet die Wanderung und die zentrifugierte Probe befindet sich im Gleichgewicht. Für ein trennscharfes Ergebnis müssen die einzelnen Banden gegen eine Vermischung durch Konvektion geschützt werden, weshalb gekühlt wird. Im Anschluß an eine Zentrifugation können sich die Banden durch Diffusion, Vibrationen und Stöße vermischen, weshalb zügig und erschütterungsarm fraktioniert wird.

Bei der Dichtegradientenzentrifugation stellt sich für jede Molekülsorte ein Gleichgewicht einer Sortierung durch die Sedimentation und einer gegenläufigen Diffusion ein, kleinere Moleküle haben dabei unschärfere Banden. Für jede Molekülsorte kann eine Sedimentationskonstante K bestimmt werden. Sie ist als Quotient von Sedimentationsgeschwindigkeit und Zentrifugalbeschleunigung definiert und wird als Svedberg-Einheit (S) angegeben.

Begriffsdefinitionen

Fluoreszenz von DNA mit Ethidiumbromid im Cäsiumchlorid-Gradienten

Grundsätzlich gibt es zwei unterschiedliche Methoden der Dichtegradientenzentrifugation:

• Bei einer Trennung nach Sinkgeschwindigkeit beziehungsweise nach zurückgelegter Strecke nach einer bestimmten Zeit wird die Zentrifugation vor Erreichen des Gleichgewichts abgebrochen. Da hierbei nur die Sedimentationsrate von Belang ist, wird diese Zentrifugation als rate-zonal centrifugation bezeichnet. Hierbei kann ein kontinuierlicher (gleichmäßig ansteigend) oder ein diskontinuierlicher Gradient (mit Konzentrationsstufen) verwendet werden. Ein Beispiel dafür wären ribosomale Untereinheiten in einem Gradienten aus Rohrzucker. Dabei verbreitern sich die Banden im Laufe der Zeit durch die Diffusion. Nach sehr langer Zeit würden alle ribosomalen Untereinheiten auf dem Boden des Röhrchens landen.
• Die Trennung nach gleicher Dichte, die isopyknische Zentrifugation. Ein Beispiel dafür wären Nukleinsäuren mit Ethidiumbromid in einem Gradienten aus Cäsiumchlorid. Nur bei der isopyknischen Zentrifugation werden die Banden im Laufe der Zeit immer schärfer, und bleiben auch nach sehr langer Zeit (im Gleichgewicht) an derselben Stelle des Röhrchens.

Bestimmung der Molmasse

Durch eine Gleichgewichtszentrifugation kann das Molekulargewicht M (in Kilogramm pro Mol) bei bekanntem partiellem spezifischen Volumen ν bestimmt werden. Dieses beträgt bei Proteinen ungefähr 0,000735 Kubikmeter pro Kilogramm.

$\frac{d \ln c}{dx^2} = \frac{M(1- \nu \overrightarrow {\rho})}{2RT} \omega^2$

Alternativ kann die Molmasse auch über die isopyknische Zentrifugation mit der Dichte ρ_s an der Position der Proteinbande, der Position der Bande x_s, dem Dichtegradienten dρ/dx an der Position der Proteinbande (in Kg m^-4) und der Halbwertsbreite Δx_1/2 der Konzentrationsverteilung ermittelt werden.

$M = \frac{8RT \rho_\text{s} \ln 2}{\omega^2 x_\text{s} \Delta x^2_\text{1/2} \frac{\partial \rho}{\partial x}}$

Anwendungen

In der Biologie und Medizin wird ein ähnliches Verfahren benutzt, um verschiedene Zelltypen bzw. die Bestandteile aufgebrochener Zellen aufgrund ihrer Schwebedichte zu trennen. Man arbeitet hier mit steilen Gradienten von Rohrzucker (Saccharose) bzw. Cäsiumchlorid. Als weitere Trennlösungen kommen synthetische Polymere aus Saccharose (Ficoll) oder Kieselgel (Percoll) zum Einsatz. Im einfachsten Fall reduziert sich der Gradient auf nur eine Dichtestufe, die durch vorsichtiges Übereinanderschichten zweier Lösungen unterschiedlicher Dichte aufgebaut wurde. Die zentrifugierten Zellen oder Zellbestandteile sammeln sich in diesem Fall an der Grenzschicht zwischen beiden Schichten.

Für die Dichtegradientenzentrifugation sind Rotoren mit ausschwingenden Röhrchenhaltern besser geeignet, als Rotoren mit starren Röhrchenhaltern. In jedem Falle ist es aber günstig, am Ende der Zentrifugation den Rotor ungebremst auslaufen zu lassen, um den Dichtegradienten nicht zu verwirbeln.

Literatur

• Paul Reinhart Schimmel, Charles R. Cantor: Biophysical Chemistry: Part II: Techniques for the Study of Biological Structure and Function. H.C. Freeman Co., San Francisco, 1980, S. 619 - 642. ISBN 0-7167-1190-7.

Weblinks

• Alfred Pingoud, Claus Urbanke: Arbeitsmethoden der Biochemie. DeGruyter, Berlin 1997, ISBN 3-11-016513-9 (als Google-Book).