Multiphotonenmikroskop

Zweiphotonen-Fluoreszenzaufnahme an einem Schnitt durch einen Mausdarm. Zellkerne in grün, Schleim der Becherzellen in blau, Aktin (Phalloidin-Färbung) in rot. Anregung erfolgte bei 780 nm durch einen Titan:Saphir-Laser.

Zweiphotonenaufnahme eines gefärbten Rhizom-Querschnitts des Maiglöckchens. Die Anregung erfolgte mit 840 nm, drei Farbkanäle wurden aufgezeichnet und übereinander gelegt.

Ein Multiphotonenmikroskop (englisch Multi-Photon Laser Scanning Microscope – MPLSM) ist ein spezielles Lichtmikroskop. Unter Multiphotonenmikroskopie werden Multiphotonen-Fluoreszenzmikroskopie (Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie und Drei-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie) sowie Higher Harmonic Generation Microscopy (Second Harmonic Generation (SHG) und Third Harmonic Generation (THG)) zusammengefasst. Deren gemeinsame Eigenschaft ist, dass ein nachweisbares Photon (Lichtteilchen) entsteht, indem zwei oder drei Photonen im gleichen Molekül zusammentreffen.

Am weitesten verbreitet ist die Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie, manchmal auch nur Zweiphotonenmikroskopie genannt. Bei der herkömmlichen Fluoreszenzmikroskopie wird in einem fluoreszierenden Molekül ein Elektron durch die Absorption jeweils eines Photons „angeregt“, also in einen höheren Energiezustand versetzt. Bei der Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie wird die Anregung des Elektrons dagegen durch die gleichzeitige Absorption zweier Photonen hervorgerufen (Zwei-Photonen-Absorption). Auch eine Anregung mit drei oder mehr gleichzeitig eintreffenden Photonen ist möglich.

Bei bestimmten Stoffen ist auch eine Bildgebung mittels Frequenzverdopplung (Second-Harmonic-Generation) bzw. Frequenzverdreifachung (Third-Harmonic-Generation) möglich. Hierbei entstehen aus zwei (oder drei) Photonen ein Photon der exakt halben (drittel) Wellenlänge.

Die genannten Techniken erfordern eine ähnliche technische Ausstattung, so dass beispielsweise ein Gerät, dass für Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie gebaut wurde, auch Second Harmonic Generation ermöglicht. Die Arbeitsweise eines Multiphotonenmikroskops ähnelt der eines konfokalen Laserscanningmikroskops. Während jedoch normale Laserscanning-Mikroskopie eine Eindringtiefe je nach Präparat von 50–80 µm hat, können mit 2-Photonen-Mikroskopie tiefere Bereiche, z.B von 200 µm, in sehr günstigen Fällen sogar bis zu 1000 µm (=1 mm) erreicht werden. Dadurch sind Aufnahmen von lebenden Geweben möglich, die anderweitig für die Bildgebung unerreichbar sind.

Während bei normaler Fluoreszenzanregung die Fluoreszenz linear von der Anregungsintensität abhängt, sind 2-Photonen-Anregung sowie Second-Harmonic-Generation im Quadrat von der Stärke des Anregungslichts abhängig, 3-Photonen-Anregung sowie Third-Harmonic-Generation hoch 3. Daher werden diese Techniken der nichtlinearen Optik zugerechnet.

Multi-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie

Prinzip

Jablonski-Schema der Fluoreszenzanregung durch ein (lila), zwei (hellrot) oder drei Photonen (dunkelrot) und Aussendung eines Photons (türkis) am Beispiel eines blau leuchtenden Fluorochroms.

Spektrum des sichtbaren Lichts. Kurzwelliges Licht (links) ist energiereicher als langwelliges (rechts).

Theoretische Verteilung des Fluoreszenzlichts einer punktförmigen Struktur (Punktspreizfunktion) bei normaler (Weitfeld-) Fluoreszenzmikroskopie, Zwei-Photonen-Mitroskopie und confocaler Mikroskopie, oben in der Fokusebene, unten entlang der optischen Achse.

Fluoreszenz entsteht, wenn Farbstoffe ankommende Photonen absorbieren und in der Folge ein anderes Photon wieder abgeben. Durch das ankommende, „anregende“ Photon wird ein Elektron auf ein höheres Energieniveau gehoben, die Energie also derart zwischengespeichert. Bei normaler Fluoreszenzmikroskopie geschieht diese Anregung durch genau ein Photon. Das Elektron bleibt für einige Nanosekunden auf dem höheren Energieniveau, bevor es wieder zurück fällt und dabei ein neues, längerwelliges, energieärmeres Photon aussendet. Wenn etwa mit blauem Licht angeregt wird, entsteht meist grüne Fluoreszenz, etwa bei Fluorescein.

Das eine Anregungsphoton kann durch zwei oder mehr Photonen ersetzt werden, wenn diese in der Summe die gleiche Energie haben wie sonst ein Anregungsphoton. So kann dunkelrotes oder infrarotes Licht eingesetzt werden, um grüne Fluoreszenz zu erzeugen. Außerdem müssen beide Photonen gleichzeitig (innerhalb einer Attosekunde = 10^{-18 s) eintreffen, da kein stabiles Zwischenenergieniveau existiert.}

Im Gegensatz zur üblichen Fluoreszenzmikroskopie wird also nicht mit einer Wellenlänge angeregt, die unterhalb der emittierten Wellenlänge liegt (siehe Stokes-Shift), sondern mit deutlich größerer Wellenlänge. Im Fall der Zwei-Photonen-Fluoreszenzikroskopie beträgt z. B. die Anregungswellenlänge in etwa das Doppelte der normalerweise verwendeten Anregungswellenlänge, bei Drei-Photonen-Anregung ein Dreifaches.

Praktische Umsetzung

Schema eines Zweiphotonenmikroskops mit Detektoren für grüne und rote Fluoreszenz

Um ein gleichzeitiges Eintreffen zweier (oder mehr) Photonen am Fokuspunkt zu erreichen, sind sehr hohe Photonendichten erforderlich. Diese werden nur erzielt, wenn ein modengekoppelter, gepulster Laser eingesetzt wird.

Die für die Anregung in der Regel eingesetzten Titan:Saphir-Laser sind kostspielig (~150000 Euro) und stellen daher eine große Hürde für einen verbreiteten Einsatz dar. Ti:Sa-Laser können auf Wellenlängen von etwa 700 nm bis etwa 1050 nm eingestellt werden. Größere Wellenlängen können durch den Einsatz eines „Optisch parametrischen Oszillators“ (OPO) erzeugt werden. Dieser wird mit dem Ti:Sa-Laser „gepumpt“ und kann dann Wellenlängen bis über 1300 nm erzeugen. Damit können auch rote und dunkelrote Fluoreszenzfarbstoffe im Zwei-Photonen-Modus angeregt werden.

Wie bei einem konfokalen Laserscanningmikroskop wird der Laserstrahl durch das Objektiv des Mikroskops auf einen Punkt des Präparats fokussiert. Durch im Strahlengang befindliche bewegliche Spiegel (Scanspiegel; englisch to scan = rastern) wird der Laserstrahl in seiner Lage so verändert, dass der Fokuspunkt sich durch das Präparat bewegt, dieses also abrastert. Die dadurch entstehende Fluoreszenz wird vom Objektiv aufgefangen, über dichroitische Strahlteiler spektral aufgetrennt und schließlich von Detektoren aufgefangen. Diese Detektoren, sogenannte Photomultiplier, messen die Helligkeit jedes Bildpunktes also nacheinander. Zu keinem Zeitpunkt entsteht im Mikroskop ein vollständiges Bild des Präparats. Dies wird erst im Steuerungscomputer zusammengesetzt.

Vorteile

Schema der Fluoreszenzanregung, links im konventionellen Modus, rechts im Zwei-Photonenmodus.

Wie oben dargestellt, ist für die Erzeugung des Zweiphotonen-Effekts eine sehr hohe Photonendichte erforderlich, für die ein gepulster Laser eingesetzt wird. Selbst dann kommt es nur im Fokuspunkt zu einer genügend hohen Photonendichte um eine Fluoreszenzanregung zu erzeugen, nicht aber darüber und darunter, denn die Zwei-Photonen-Anregung ist im Quadrat abhängig von der Lichtintensität. Über und unter dem Fokuspunkt verteilt sich die gleich Menge Anregungsphotonen über einen stark zunehmenden Durchmesser des Strahlkegels. Fluoreszenz wird also nur im Fokuspunkt erzeugt, während in einem normalen Fluoreszenzmikroskop im gesamten Strahlkegel, auch über und unter der Fokusebene Fluoreszenz-Anregung stattfindet. Dies hat zwei Vorteile.

Zum einen ist dadurch auch ein Ausbleichen von Fluoreszenzfarbstoffen und die Erzeugung von Phototoxizität auf den Fokuspunkt beschränkt, beziehungsweise auf die Fokusebene beim Erzeugen eines Bildes.

Zum anderen kann die gesamte vom Objektiv aufgefangene Fluoreszenz für das zu erstellende Bild verwendet werden. Im Gegensatz zum konfokalen Laserscanningmikroskop ist also keine Lochblende (Pinhole) nötig, um Licht aus anderen Ebenen auszufiltern. Daher ist es, wiederum im Vergleich zum konfokalen Laserscanningmikroskop, auch nicht nötig, die Fluoreszenz über die Scanspiegel aufzufangen, stattdessen kann eine „non-descanned detection“ durchgeführt werden. Die Detektion kann dadurch räumlich dichter am Präparat erfolgen, was wiederum das Auffangen eines Teils der im Präparat gestreuten Fluoreszenz erlaubt.

Ein weiterer Vorteil ist die höhere Eindringtiefe durch geringere Streuung von längerwelligem Licht. Kurzwelliges, z.B. blaues Licht wird stark gestreut. Dieser Effekt ist beispielsweise verantwortlich dafür, dass ein unbewölkter Tageshimmel blau ist und nicht schwarz: Sonnenlicht wird in der Atmosphäre gestreut und der blaue Anteil erreicht die Erdoberfläche auf indirektem Weg. Dagegen erreicht uns von einer untergehenden Sonne nur noch der rote, langwellige, nicht gestreute Lichtanteil. Der blaue wird unterwegs abgelenkt. Streuung geschieht auch in biologischen Geweben: Wenn mit einer starken Taschenlampe durch eine Hand geleuchtet wird, dringt nur der rote Lichtanteil durch. Da bei der 2-Photonen-Mikroskopie infrarotes oder dunkelrotes Licht für die Fluoreszenzanregung eingesetzt wird, können dadurch tiefere Regionen erreicht werden.

Second und Third Harmonic Generation

Bei Second Harmonic Generation (SHG) handelt es sich nicht um einen Fluoreszenzeffekt, sie ist also physikalisch nicht verwandt mit Multiphotonen-Fluoreszenzanregung. SHG tritt aber unter gleichartigen Beleuchtungsbedingungen auf wie multiphotoneninduzierte Fluoreszenz.

SHG wird an bestimmten periodischen Strukturen erzeugt (siehe auch Frequenzverdopplung), z.B. an Harnstoffkristallen, in biologischen Geweben etwa an Kollagenfasern und an glatter Muskulatur. SHG erleichtert dadurch die Orientierung im Präparat. Bei SHG wird die Wellenlänge des Lichts exakt halbiert. Bei Anregungswellenlängen oberhalb von 800 nm, die bei der 2-Photonen-Mikroskopie häufig verwendet werden, entsteht dabei sichtbares Licht.

Wenn die Anregungswellenlänge über 1200 nm liegt, lässt sich auch Third Harmonics Generation (THG) beobachten bezeihungsweise mit Filtern für sichtbares Licht auffangen. THG entsteht, wenn optisch unterschiedlich dichte Strukturen nebeneinander liegen, beispielsweise Zellen und Blutplasma.

Geschichte

Das physikalische Prinzip der Anregung eines Moleküls durch mehrere Photonen geht zurück auf Maria Goeppert-Mayer. Das Verfahren selbst wurde in den 1990er Jahren entwickelt.

Literatur

• Cox G, Kable E: Second-harmonic imaging of collagen. In: Methods Mol. Biol. 319. Jahrgang, 2006, S. 15–35, PMID 16719349.  ISBN 978-1-58829-157-8. Als kostenloses Sample hier
• Alberto Diaspro (Hrsg): Confocal and Two-Photon Microscopy: Foundations, Applications and Advances. Wiley-Liss, 2001, ISBN 0471409200
• Friedl P, Wolf K, von Andrian UH, Harms G: Biological second and third harmonic generation microscopy. In: Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4. Jahrgang, März 2007, S. Unit 4.15, doi:10.1002/0471143030.cb0415s34, PMID 18228516.