Transfektion

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Als Transfektion wird in der Zellbiologie das Einbringen von Fremd-DNA oder RNA in tierische und teilweise auch andere eukaryotische Zellen bezeichnet.[1] In diesen Systemen wird, im Gegensatz zu ähnlichen Prozessen bei bakteriellen oder auch pflanzlichen Zellen, nicht von Transformation gesprochen, da die Transformation in Säugetierzellen die Umwandlung von Zellen in einen bösartigen Zustand (Tumor, Krebs) beschreibt. Bei der Transfektion unterscheidet man zwischen dem nur zeitweiligen Einbringen des Plasmids in die Wirtszelle (transiente Transfektion) und dem dauerhaften Einbau in das Genom (stabile Transfektion). Durch Abbauprozesse wird fremde DNA normalerweise schnell abgebaut, nach dem Einbau in die Wirts-DNA wird dieser Vorgang jedoch unterbunden.

Je nach Zellart eignen sich verschiedene Verfahren.

Chemische Verfahren

Im Prinzip handelt es sich hierbei um einen Spezialfall der Transformation, die jedoch als Methode eher in der Mikrobiologie Verwendung findet.

Calcium-Phosphat-Präzipitation

Das am häufigsten verwendete Transfektionsverfahren ist die 1973 durch Frank L. Graham und Alex J. van der Eb entwickelte Calcium-Phosphat-Präzipitation. In einem Gemisch aus Calciumchlorid und Natriumphosphat bindet sich die zu übertragende DNA an ausfallendes Calciumphosphat. Die ausgefallenen Kristalle werden der Zellkultur zugegeben und von den Zellen durch Endocytose aufgenommen. Die "Berieselung" der Zellen mit dem Präzipitat ist für die Zellen negativer Stress. Der ganze Vorgang ist stark von einer Vielzahl von Parametern abhängig, deren richtige Einstellung zudem von Zellart zu Zellart variiert:

  • Menge der Plasmid-DNA
  • Reinheit der Plasmid-DNA
  • Konzentration der Carrier-DNA (ein Überschuss an genomischer DNA zur Bildung einer ausreichenden Menge an Präzipitat)
  • Quelle der Carrier-DNA (optimal ist autologe DNA)
  • Größe der Carrier-DNA
  • Salzkonzentration und pH der Lösung
  • Inkubationsdauer
  • Präselektionsdauer bei Herstellung von Zelllinien durch permanente Expression bzw. Erholungsphase bei der Messung der rekombinanten Genaktivität bei transienter Expression

Die Methode erfordert experimentelles Geschick und ist nicht für alle Zellen mit gleichem Erfolg anwendbar. Sie funktioniert nur bei adhärent wachsenden Zellen wie z. B. den etablierten Nagerzelllinien der L-Zellen und 3T3-Zellen von Mäusen sowie den Hamsterzelllinien BHK und CHO zufriedenstellend. Mit dieser Methode wurde aber auch Transfektion von Protoplasten durchgeführt.[2]

Lipofektion

Genetisches Material kann mit Hilfe von Liposomen, Vesikeln, die sehr leicht mit der Zellmembran fusionieren, in Zellen eingebracht werden.

Kationische Polymere

Das älteste derartige Verfahren ist die Komplexierung von Plasmid-DNA mit Diethylaminoethyl-Dextran. Die DEAE-Dextran-Methode ist recht zellverträglich und erzielt Transfektionseffizienzen von bis zu 30 %, erlaubt aber nur transiente Transfektionen. Diese positiv geladenen, stark verzweigten Polymere komplexieren die Plasmid-DNA und werden von den Zielzellen aufgenommen. Die Methode ist in der Regel besser zellverträglich als die kationische Lipofektion.

Ein weiteres einfaches und (im Gegensatz zu anderen kommerziellen Reagentien) günstiges Verfahren der Transfektion bietet die Transfektion mittels Polyethylenimin,[3] welches im Vergleich zur Lipofektion hohe Transfektionseffizienzen sowohl für siRNA (> 85 %) als auch Plasmid-DNA bei niedriger Toxizität liefert.[4][5] Einige Verfahren benutzen kationische Dendrimere.[6]

Nanopartikel

In einer fächerübergreifenden Zusammenarbeit der Universität Bayreuth wurde ein neues Verfahren mit nicht-viralen Vektoren entwickelt. Die neuen nicht-viralen Vektoren bestehen aus kugelförmigen Nanopartikeln im Zentrum und aus zahlreichen Armen, die an die Nanopartikel angehängt sind. Sie sind positiv geladen und können deshalb große Mengen an negativ geladener DNA aufnehmen. Chemisch gesehen handelt es sich bei diesen Molekülen um positiv geladene Sternmoleküle aus PDMAEMA, Poly(2-(dimethylamino)ethylmethacrylat). Die Erfindung wurde von der BayPAT im Namen der Universität Bayreuth bereits zum Patent angemeldet. [7]

Physikalische Verfahren

Mikroinjektion

Bei der Mikroinjektion wird die DNA als Plasmid, ssDNA (einzelsträngige DNA) oder dsDNA (doppelsträngige DNA) direkt in den Zellkern bzw. ins Cytoplasma der Zelle mit Hilfe einer Mikrokapillare injiziert. Das Verfahren ist sowohl apparativ sehr aufwändig als auch manipulativ höchst anspruchsvoll. Benötigt werden:

  • Mikrokapillaren, in die einige Nanoliter DNA-Lösung aufgezogen werden
  • ein Mikroinjektor, der mittels eines präzisen Luftstoßes einige Femtoliter der Lösung aus der Spitze der Kapillare presst.
  • Mikromanipulatoren, zur Justierung der Injektionskapillare
  • ein hochwertiges Inversmikroskop, über das der Experimentator die visuelle Kontrolle behält

Das Verfahren besitzt eine Transfektionseffizienz von nahezu 100 % und erlaubt im Gegensatz zu allen anderen Methoden die Transfektion mitotisch ruhender Zellen, da hier die Kernmembran auf direktem, mechanischem Wege überwunden wird. Allerdings können nur relativ wenige Zellen in einem vernünftigen Zeitraum transfiziert werden - je nach Übung 60-200 pro Stunde.

Geschichte

1979 wurden die ersten menschlichen Zellen mit Glaskapillaren mikroinjiziert. 1976 konnte die Translation von mRNA nachgewiesen werden. Dazu wurde mRNA aus Enten in menschlichen Zellen und in Mauszellen translatiert. Es fanden normale Teilungen der mikroinjizierten Zellen statt. Außerdem konnte die Translation über mehrere Zellgenerationen bei injizierter Globin-mRNA nachgewiesen werden.

Verfahren

Die zu injizierenden Zellen werden auf einem Mikroinjektionsdeckglas mit 9.Feld-Raster gezüchtet. DNA- oder RNA-Lösung können anschließend über den Mikroinjektor per Druckluft in die Zellen injiziert werden. Danach müssen die Zellen für 24 Stunden im Brutschrank inkubiert werden. Während dieser Zeit findet die Translation der injizierten Sequenzen statt und es bilden sich neue Proteine. Mit dem Verfahren der Mikroinjektion ist es möglich, das Vorhandensein einer bestimmten mRNA mit unbekannten, dazugehörigen Gen zu bestimmen.

Elektroporation

Bei einer Elektroporation wird die Zellmembran durch Spannungspulse für DNA permeabel gemacht. Nennenswerte Transfektionsraten erhält man nur unter Bedingungen, die gleichzeitig je nach Zelltyp zwischen 20 und 50 % aller Zellen abtöten. Da die Zellen nicht adhärent vorliegen müssen, bietet sich das Verfahren vor allem für Suspensionskulturen an.

Mechanismus

Man kann sich die Zellmembran (Plasmamembran) als einen Plattenkondensator vorstellen, denn die Lipiddoppelschicht wirkt als Isolator. Da die Zellmembran eine Isolierung des elektrisch leitfähigen Cytoplasmas darstellt, kann elektrischer Strom so lange nicht durch die Zelle fließen, bis Poren in der Membran entstanden sind. Wird nun eine elektrische Spannung angelegt (Feldstärke mehrere kV/cm), so kommt es zur Polarisierung der Membran. Erreicht die transmembrane Spannung einen kritischen Wert von 0,4 bis 1 V, so kommt es durch eine lokale Zerstörung der Membranintegrität spontan zur drastischen Erhöhung ihrer Leitfähigkeit. Primär in der Membran entstandene hydrophobe Poren verwandeln sich bei Erreichen eines kritischen Radius spontan in relativ stabile hydrophile Poren (0,5–1 nm) mit einer Lebensdauer von wenigen Sekunden bis einigen Minuten, denn erstens bricht die Membranspannung wegen des Ladungsausgleiches durch die Poren wieder zusammen und zweitens ist die Membran ein selbstorganisierendes System, das sich selbst reorganisiert.[8][9]

Jüngere Forschungen an der Universität Lyon haben gezeigt, dass das Phänomen auch natürlicherweise vorkommt. So machen die elektrischen Entladungen bei Gewittern die Zellwände von im Boden lebenden Bakterien durchlässig, so dass fremde DNA aufgenommen werden kann. Diese Tatsache könnte eine wesentliche Rolle bei der beschleunigten Evolution von Mikroorganismen spielen.

Particle Gun

Auch dieses Verfahren ist apparativ sehr aufwändig. Die DNA wird an Mikroprojektile z. B. Wolfram- oder Goldpartikel adsorbiert. Die Mikroprojektile werden auf einem Makroträger fixiert. Dieser wird extrem beschleunigt. Ursprünglich durch eine Schwarzpulverladung - daher der Name particle gun - in den aktuellen Geräten durch Gas. Das Gas wird mechanisch vorkomprimiert. Wenn ein kritischer Druck überschritten wird, bricht eine Scheibe, hinter der sich der Makroträger befindet. Dessen Beschleunigung wird durch ein grobmaschiges Aufprallsieb abrupt gebremst, so dass die Mikroprojektile sich ablösen und mit hoher Geschwindigkeit durch das Sieb auf die Zielzellen zuschiessen. Sie werden erst in den Zellen abgebremst, wobei es dann zur Ablösung der DNA kommt.

Interessante Einsatzmöglichkeiten der particle gun sind:

  • Aufgrund der großen mechanischen Kraft eignet sich die Methode vorzüglich zur Penetration von pflanzlichen Zellen, deren Zellwand bei allen anderen Verfahren eine unüberwindliche Barriere darstellt und erst entfernt werden müsste.
  • in vivo Transfektion von Organen z. B. Transfektion einer Leber zur Gentherapie.
  • Die einzige Methode zur Transfektion von Organellen wie Mitochondrien oder Chloroplasten.

Magnet Assisted Transfection

Die Magnet Assisted Transfection (auch Magnetofektion) ist eine Transfektionsmethode, die mit Hilfe eines magnetischen Feldes DNA in die Zielzellen einschleust. Dabei werden eisenhaltige, magnetische Nanopartikel mit DNA beladen, die diese auf Grund ionischer Wechselwirkungen binden. Ein magnetisches Feld leitet die Nanopartikel zu und in die Zielzellen, in denen die DNA freigegeben wird.[10]

Sonoporation

Bei der Sonoporation werden mit Ultraschall Zellmembrane durch akustische Kavitation kurzzeitig perforiert.[11] Die Effizienz ist vergleichbar mit der Elektroporation. Ebenso wie bei der Elektroporation wird dabei die Zellviabilität reduziert.

Biologische Verfahren

Darunter fallen alle Methoden, bei denen biologische Transportmechanismen dazu ausgenutzt werden, die Plasmid-DNA in die Zelle zu schleusen.

Transferrinfektion

Dies war das erste Beispiel einer rezeptorvermittelten Transfektion.[12] Proteinchemisch wurde ein Konjugat aus dem Eisentransportprotein Transferrin und kationischem Poly-Lysin hergestellt. Dieses Konjugat konnte in hohem Maße Plasmid-DNA binden und hatte die Fähigkeit beibehalten an den zellulären Transferrinrezeptor zu binden. Durch die zellulären Transportmechanismen landet das Konjugat in den Lysosomen. Dort muss wie auch bei den chemischen Verfahren die DNA freigesetzt werden, diese die lysosomale Membran überwinden und in den Zellkern gelangen. Die Methode erzielte beeindruckende Erfolge bei Zelllinien mit atypisch hoher Dichte an Transferrinrezeptoren, zeigte bei "normalen" Zellen aber keinen Vorteil gegenüber herkömmlichen Methoden.

Antikörpervermittelte Transfektion

Dies ist kein Standardverfahren für die Routinetransfektion und soll hier nur erwähnt werden, weil es interessante Aspekte für eine In-vivo-Anwendung im Rahmen des Drug Targetings und der Gentherapie aufwirft. Anstelle von Transferrin wird für das Konjugat ein Antikörper gegen ein für die Zielzelle spezifisches Membranprotein verwendet.[13] Zur Bekämpfung von Tumoren könnte das DNA-Plasmid für ein Toxin kodieren.[14]

Quellen

  1. ↑ Lottspeich, F. und Engels, J.W.: Bioanalytik. Spektrum Akademischer Verlag, 2. Auflage 2006, ISBN 3-8274-1520-9
  2. ↑ Hain, R. et al. (1985): Uptake, integration, expression and genetic transmission of a selectable chimaeric gene by plant protoplasts. In: Molecular und General Genetics 199(2); 161-168; doi:10.1007/BF00330254
  3. ↑ O. Boussif, F. Lezoualc'h, M. A. Zanta, M. D. Mergny, D. Scherman, B. Demeneix, J. P. Behr: A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. In: Proc Natl Acad Sci U S A. (1995), Band 92(16), S. 7297–301. PMID 7638184; PMC 41326 (freier Volltext).
  4. ↑ W. T. Godbey, K. K. Wu, A. G. Mikos: Poly(ethylenimine) and its role in gene delivery. In: J Control Release. (1999), Band 60(2-3), S. 149–60. PMID 10425321.
  5. ↑ D. Goula, C. Benoist, S. Mantero, G. Merlo, G. Levi, B. A. Demeneix: Polyethylenimine-based intravenous delivery of transgenes to mouse lung. In: Gene Ther. (1998), Band 5(9), S. 1291–5. PMID 9930332. PDF.
  6. ↑ J. W. Wiseman, C. A. Goddard, D. McLelland, W. H. Colledge: A comparison of linear and branched polyethylenimine (PEI) with DCChol/DOPE liposomes for gene delivery to epithelial cells in vitro and in vivo. In: Gene Ther. (2003), Band 10(19), S. 1654–62. PMID 12923564.
  7. ↑ IDW-Online (vom 12. September 2011)
  8. ↑ Klenchin, V.A. und Sukharev, S.I. und Serov, S.M. und Chernomordik, S.V. und Chizmadzhev, Yu.A. (1991): Electrically induced DNA uptake by cells is a fast process involving DNA electrophoresis. In: Biophys J. Bd. 60, Nr. 4, S. 804–811. PMID 1660315
  9. ↑ Sukharev, S.I. und Klenchin, V.A. und Serov, S.M. und Chernomordik, S.V. und Chizmadzhev, Yu.A. (1992): Electroporation and electrophoretic DNA transfer into cells. The effect of DNA interaction with electropores. In: Biophys J. Bd. 63, Nr. 5, S. 1320–1327. PMID 1282374
  10. ↑ Bertram, J. (2006) MATra - Magnet Assisted Transfection: Combining Nanotechnology and Magnetic Forces to Improve Intracellular Delivery of Nucleic Acids. In: Current Pharmaceutical Biotechnology 7, 277-285.
  11. ↑ Yizhi Song, G Garaventa, S Bottero, AE Leprini, E Pallestrini, E Castello, EA Pallestrini, W. E. Huang: Ultrasound-mediated DNA transfer for bacteria. In: Nucleic Acids Res. 35. Jahrgang, Nr. 19, 2007, S. 1073–80, doi:10.1093/nar/gkm710, PMID 2095817.
  12. ↑ E. Wagner, M. Zenke, M. Cotten, H. Beug, M. L. Birnstiel: Transferrin-polycation conjugates as carriers for DNA uptake into cells. In: Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. Band 87, Nummer 9, Mai 1990, S. 3410–3414, PMID 2333290, PMC 53910 (freier Volltext).
  13. ↑ N. Shimizu, J. Chen, S. Gamou, A. Takayanagi: Immunogene approach toward cancer therapy using erythrocyte growth factor receptor-mediated gene delivery. In: Cancer gene therapy. Band 3, Nummer 2, 1996 Mar-Apr, S. 113–120, PMID 8729910.
  14. ↑ Y. Duan, J. Zheng, S. Han, Y. Wu, Y. Wang, D. Li, D. Kong, Y. Yu: A tumor targeted gene vector modified with G250 monoclonal antibody for gene therapy. In: Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. Band 127, Nummer 2, April 2008, S. 173–179, doi:10.1016/j.jconrel.2008.01.016, PMID 18316136.

Literatur

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