RNA-Extraktion

Die RNA-Isolierung aus Zellen ermöglicht eine Analyse der momentanen Zelltätigkeit zu einem bestimmten Zeitpunkt, da nur die Gene, die auch aktuell in der Zelle transkribiert werden im Moment der Isolierung als RNA vorliegen. Somit stellt die RNA-Isolierung eine wichtige Technik in der Molekularbiologie dar und die isolierte RNA kann in zahlreichen Methoden zur Analyse der Genexpression genutzt werden.

Zellaufschluss

Die RNA eines Organismus kann auf mehreren Wegen isoliert werden. Die meisten Verfahren beginnen mit einer Konzentration der Zellen durch Zentrifugation und einem für die jeweilige Gruppe geeigneten Zellaufschluss des Zell-Niederschlags. So müssen z. B. bei pflanzlichen, pilzigen oder bakteriellen Zellen, welche im Vergleich zu tierischen Zellen, Mycoplasmen und einigen Archaeenarten zusätzlich zur Zellmembran eine Zellwand besitzen, meist zusätzliche enzymatische (z. B. Lysozym bei Bakterien oder Proteinase K zur Proteolyse) oder mechanische Zerkleinerungsschritte (Standmixer) erfolgen. Nach einem Zellaufschluss folgt meist eine Klärung des Homogenates durch Filtration oder Zentrifugation. RNA aus Mitochondrien oder Chloroplasten können durch eine Zellfraktionierung von der RNA des Zellkerns und Zytosols getrennt werden. Da RNA vergleichsweise schnell von zellulären RNasen abgebaut wird und eine relativ kurze biologische Halbwertszeit aufweist, werden die Extraktionen zügig bei etwa 4 °C durchgeführt. Die verwendeten Lösungen werden daher mit DEPC-behandeltem, RNAse-freiem Wasser angesetzt. Oftmals wird dem Aufschlusspuffer zusätzlich Mercaptoethanol oder Dithiothreitol hinzugefügt, um RNasen durch die Spaltung ihrer Disulfidbrücken zu inaktivieren.

Eigenschaften der RNA

RNA ist ein polares Biopolymer mit relativ hoher molarer Masse, weshalb sie in unpolarer Umgebung durch die verkleinerte Hydrathülle und die daraus folgende Absenkung ihrer Löslichkeit ausfällt. Daneben ist RNA aufgrund des Ribosephosphat-Rückgrates mit negativen Ladungen proportional zur Kettenlänge in sauren, wässrigen Lösungen unlöslich. Bei niedrigen pH-Werten sind die Phosphatgruppen und somit die negativen Ladungen der RNA mit Protonen abgesättigt, wodurch die Hydrathülle sich ebenfalls verkleinert. RNA ist ein wenig polarer und wasserlöslicher als DNA, da es pro Nukleotid eine Hydroxygruppe mehr besitzt.

RNasen (Enzyme, die die Spaltung von RNA in kleinere Fragmente katalysieren) besitzen eine hohe Stabilität und können auch nach Autoklavierung noch aktiv sein. RNA ist sehr anfällig für den Abbau durch RNasen, deren natürliche Aufgabe die Mg²⁺-unabhängige Hydrolyse von Phosphodiesterbindungen im Phosphatrückgrad der RNA ist. Deshalb erfordert der Umgang mit RNA mehr Sorgfalt als das Arbeiten mit der sehr viel stabileren DNA. Um RNA-Abbau zu vermeiden, sollten RNA und RNasen frühzeitig voneinander getrennt werden und verhindert werden, RNasen aus der Umgebung in die Probe einzubringen. Darum sollten Einweghandschuhe getragen werden, weil RNasen von allen Organismen produziert werden und daher auch im menschlichen Schweiß auf der Hautoberfläche vorhanden sind. Außerdem ist es sinnvoll einen bestimmten Satz an Verbrauchsmaterialien (Pipetten, Pipettenboxen usw.) nur für die RNA-Versuche zu verwenden. Zudem sollte spezielles RNase-freies Wasser verwendet werden.

RNA-Isolierung

Wie bereits erwähnt ist es bei der Isolierung von RNA sehr wichtig, RNasen möglichst frühzeitig von der RNA zu trennen. Alle Methoden zur Isolierung von RNA beruhen darauf, die Zellen in einer chemischen Umgebung zu lysieren, in der RNasen zügig denaturiert werden. Anschließend wird die RNA von den übrigen zellulären Bestandteilen getrennt. Auf diese Weise erhält man Gesamt-RNA. Diese Gesamt-RNA lässt sich entweder direkt für weitere Experimente benutzen (z. B. Northern Blot, Reverse Transkription in cDNA), oder sie kann als Ausgangssubstanz für die Isolierung von mRNA verwendet werden.

Die meisten RNA-Extraktionen basieren nach dem Zellaufschluss auf drei unterschiedlichen Verfahren, der Zwei-Phasen-Extraktion, der Dichtegradientenzentrifugation oder der Fällungsreaktion, letztere eventuell mit zusätzlicher selektiver Adsorption an eine RNA-bindende Matrix. Die RNA-Extraktionsverfahren ähneln denen der DNA-Extraktion. Die Verfahren werden zum Teil auch miteinander kombiniert. Meistens folgt auf eine der Methoden eine abschließende Ethanolfällung.

Arbeitsschritte bei der RNA-Isolierung

Methode nach Chomczynski und Sacchi

Bei dieser Methode wird mit einem speziellen Reagenz (z. B. TRIzol Reagent^® der Firma Invitrogen oder TriFast™ der Firma peqLab) gearbeitet. Damit ist es möglich, nach einem bestimmten Protokoll RNA aus Zellen oder Gewebe zu gewinnen. Dieses Verfahren basiert auf der sogenannten single-step-Methode nach Chomczynski und Sacchi. Trizol enthält Guanidiniumthiocyanat, welches die Zellen lysiert und gleichzeitig RNasen und andere Enzyme inaktiviert. Zusätzlich enthält das Reagenz Phenol, in dem sich RNA löst. Durch Zugabe von Chloroform und anschließender Zentrifugation erfolgt die Phasentrennung. Danach sind drei Phasen zu erkennen. Die obere wässrige Phase enthält RNA, die Interphase DNA und die untere Chloroformphase Proteine. Die RNA in der wässrigen Phase wird anschließend mit Isopropanol oder Ethanol präzipitiert. Nach zwei Waschschritten wird die RNA in z. B. RNase-freiem Wasser gelöst und steht für weitere Anwendungen zur Verfügung.

„Nonidet P-40“- Methode

Diese Methode ist nicht für Gewebe geeignet und dient zur Gewinnung von mRNA aus dem Zytosol. Der Vorteil dieser Methode besteht darin, dass die Zellkerne intakt bleiben und somit zusätzlich noch die Möglichkeit besteht DNA zu isolieren. Das Prinzip beruht auf dem nichtionischen Detergenz Nonidet P-40, welches zu den Zellen gegeben wird und sich die DNA (Zellkerne) nach der Zentrifugation als Pellet absetzt. RNA, Proteine und Zelltrümmer bleiben in Lösung. Anschließend erfolgt wie bei der single-step-Methode die Isolierung mit Phenol/Chloroform.

Kit-Systeme

Als weitere Möglichkeit der RNA-Isolierung stehen viele Kit-Systeme von verschiedenen Firmen und in zahlreichen Ausführungen zur Verfügung (z. B. RNeasy Mini Kit^® der Firma Qiagen). Bei diesen Kit-Systemen verwendet man kleine Säulchen, die RNA spezifisch binden.

Konzentrationsbestimmung mittels Spektralphotometrie

Bei der spektralphotometrischen Konzentrationsbestimmung misst man die optische Dichte bei λ=260 nm (OD₂₆₀), dem Absorptionsmaximum von Nukleinsäuren (DNA, RNA), und bei λ=280 nm (OD₂₈₀), dem Absorptionsmaximum von Proteinen. Ob die Probe mit genomischer DNA oder Proteinen verunreinigt ist, kann durch den Quotienten aus OD₂₆₀ und OD₂₈₀ ermittelt werden. Bei reiner RNA sollte das Verhältnis ungefähr bei 2,0 liegen. Liegt der Wert unterhalb ist die Probe mit Protein, genomischer DNA und/oder aromatischen Substanzen kontaminiert. In diesem Fall sollte die RNA erneut gereinigt werden. Da eine OD₂₆₀ von 1 dabei 40 µg/ml RNA entspricht, lässt sich die RNA-Konzentration mit folgender Formel berechnen:

Konzentration [µg/ml] = OD₂₆₀ × 40 µg/ml × Verdünnungsfaktor

Kontrolle der RNA-Integrität durch Agarose-Gelelektrophorese

RNA-Banden nach Gelelektrophorese
a: genomische DNA
b: 28S-rRNA
c: 18S-rRNA
d: 5S-rRNA

Mit Hilfe der Agarose-Gelelektrophorese können Nukleinsäuren ihrer Größe nach aufgetrennt werden, wobei kleine Fragmente schneller wandern als größere. Die Methode basiert auf den Wanderungseigenschaften der Nukleinsäuren, die durch ihre negativ geladenen Phosphatgruppen bei angelegter elektrischer Spannung in Richtung Anode (Pluspol) wandern. Dafür wird ein Agarosegel verwendet, das anschließend durch verschiedene Farbstoffe (z. B. Methylenblau) angefärbt werden kann. Dadurch kann die RNA sichtbar gemacht und fotografiert werden. Bei intakter RNA sind im Gel zwei deutlich getrennte Banden, die 28S- und 18S-Bande ribosomaler RNA zu erkennen. Das 2:1-Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten der 28S- und 18S-rRNA-Bande ist ein Zeichen dafür, dass die mRNA nicht abgebaut ist. Die 5S-Bande ist meist kaum oder gar nicht zu sehen.

Siehe auch

• Genexpressionsanalyse

Literatur

• C Wagener, O Müller: Molekulare Onkologie: Entstehung, Progression, klinische Aspekte. 3., komplett aktualisierte und erw. Aufl. Thieme, Stuttgart [u. a.] 2009. ISBN 978-3131035134.
• Friedrich Lottspeich, Haralabos Zorbas: Bioanalytik. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg 1998, ISBN 978-3827400413.
• Cornel Mülhardt: Der Experimentator: Molekularbiologie/Genomics. Sechste Auflage. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg 2008, ISBN 3-82-742036-9.
• J. Sambrook, T. Maniatis, D. W. Russel: Molecular cloning: a laboratory manual. 3rd edition (2001), Cold Spring Harbor Laboratory Press. ISBN 0-87969-577-3.

Weblinks

• RNase and DEPC Treatment: Fact or Laboratory Myth.