Analytische Ultrazentrifugation

Analytische Ultrazentrifugation

Bei der Analytischen Ultrazentrifugation (AUZ) handelt es sich um ein Analyse-Verfahren, welches die Bewegung und Position suspendierter Partikel in einem Zentrifugalfeld mittels optischer Messverfahren erfasst. Am häufigsten werden dabei Sedimentations- und Diffusionskoeffizienten bestimmt, wodurch Rückschlüsse auf Form, Größe, Dichte oder Masse der untersuchten Partikel oder Biomoleküle gezogen werden können. Maßgeblich wurde die Technik von The Svedberg entwickelt.

Beschreibung

In einem Zentrifugalfeld wirken Zentrifugalkraft, Reibungskraft und Auftriebskraft auf Partikel. Diese Kräfte und damit die Sedimentationgeschwindigkeit hängen von Größe, Form und Dichte der Partikel, sowie experimenteller Parameter wie der Drehzahl der Zentrifuge, Abstand zur Drehachse und Lösemitteleigenschaften ab. Darüber hinaus sind kleine Teilchen der Brownschen Bewegung unterworfen, was einen weiteren Einflussfaktor im Rahmen einer Messung darstellt. Der damit assoziierte Diffusionskoeffizient wird dabei durch Temperatur gewähltes Lösemittel, sowie Größe und Form des Partikels bestimmt. Integraler Bestandteil des Verfahrens ist dabei die Nutzung eines optischen Messverfahrens, welches die Erfassung der zeitlich und/oder räumlichen Verteilung der Partikel während der Zentrifugation ermöglicht. Ziel des Messverfahrens ist es dabei, die thermodynamischen und hydrodynamischen Phänomene so auszunutzen, dass Rückschlüsse auf Form, Dichte, Größe/Masse oder Assoziationsverhalten von DNA, Proteinen oder Nanopartikel gezogen werden können. Darüber hinaus können die erfassten optischen Eigenschaften an die ermittelten geometrischen Parameter gekoppelt werden.

Aufbau

Bei einer analytischen Ultrazentrifuge handelt es sich um eine Ultrazentrifuge, welche so umgerüstet wurde, dass die Probe während des Zentrifugiervorgangs im Vakuum weiter zugänglich für einen optischen Detektor ist. Hierfür werden spezielle typischerweise sektorförmige Messzellen in einem speziellen Rotor verwendet. Kommerziell erhältlich sind aktuell Absorptions- und Interferenzdetektoren.

Eigenentwicklungen der Anwender in Wissenschaft und Industrie umfassen auch Detektoren basierend auf Schlierenoptik und Fluoreszenz.

Theoretische Beschreibung

Sedimentation

Der Sedimentationskoeffizient beschreibt das Verhältnis aus Sedimentationsgeschwindigkeit und genutzter Zentrifugalbeschleunigung:

$s={\frac {v}{\omega ^{2}r}}={\frac {m(1-{\frac {\rho _{s}}{\rho _{p}}})}{f}}$

Die einzelnen Formelzeichen stehen für folgende Größen:

• $v$ – Sedimentationsgeschwindigkeit
• $r$ – Abstand des Partikels zur Drehachse
• $\omega$ – Winkelgeschwindigkeit
• $m$ – Masse des Partikels
• $\rho _{p}$ – Dichte des Partikels
• $\rho _{s}$ – Dichte des Lösemittels
• $f$ – Reibungsfaktor nach dem Stoke'schen Gesetz.

Dies bedeutet, dass der Sedimentationskoeffizient im Fall idealer Sedimentation nur von Material- und Lösemittelparameter und nicht von der radialen Position und der Drehzahl der Zentrifuge abhängt. Für Teilchen, welche vernachlässigbare Brown'sche Bewegung zeigen, kann aus dem Sedimentationskoeffizienten eine Bewegungsbahn für bekannte Anfangsbedingungen und Winkelgeschwindigkeit berechnet werden. Dazu komplementär kann $s$ aus der Partikelbahn und dem Zentrifugalfeld bestimmt werden.

Diffusion

Die mikroskopische Brown'sche Bewegung führt zu einem makroskopischen Teilchenstrom ${\vec {J}}$ entgegen eines Konzentrationsgradienten gemäß dem Fick'schem Gesetz mit Diffusionskoeffizient $D$ und Partikelkonzentration $c$:

${\vec {J}}=-D{\vec {\nabla }}c$

Dabei kann der Diffusionskoeffizient gemäß der Einstein-Smoluchowski-Beziehung aufgefasst werden als:

$D={\frac {k_{B}T}{f}}$

Dabei beschreibt $T$ die absolute Temperatur und $k_{B}$ die Boltzmann-Konstante. Der Diffusionskoeffizient hängt somit von Größe und Form ab.

Lamm-Gleichung

Um nun ein Gesamtsystem an Partikel in einem Zentrifugalfeld zu betrachten, muss von der mikroskopischen Betrachtung der Partikelbahn auf eine makroskopsiche Betrachtung analog zum dfiffusionsgetriebenen Teilchenstrom übergegangen werden. Unter Ausnutzung zylindrischer Koordinaten und der Kontinuitätsgleichung kann die nach Ole Lamm benannte Gleichung für eine einzelne Spezies aufgestellt werden:

${\frac {\partial c}{\partial t}}=D\left[\left({\frac {\partial ^{2}c}{\partial r^{2}}}\right)+{\frac {1}{r}}\left({\frac {\partial c}{\partial r}}\right)\right]-s\omega ^{2}\left[r\left({\frac {\partial c}{\partial r}}\right)+2c\right]$Dabei bezeichnet $t$ die Zeit.

Die numerischen Lösungen dieser Differentialgleichung erlauben es somit zeit- und ortsabhängige Sedimentation- und Diffusionsvorgänge in einer sektorförmigen Messzelle zu beschreiben und somit auch Messdaten hinsichtlich $s$ und $D$ zu analysieren.

Svedberg-Gleichung

Da $s$ und ${\ce {D}}$ beide von Größe und Form des untersuchten Partikels abhängen, kann ein unbekannter Parameter durch Kombination beider Koeffizienten eliminiert werden. Die durch Ersetzung von $f$ erhaltenen Gleichung ist nach The Svedberg benannt:

$M={\frac {s\cdot N_{A}k_{B}T}{D\cdot (1-{\frac {\rho _{s}}{\rho _{p}}})}}$

Dabei bezeichnet $M$ die molare Masse und $N_{A}$ die Avogadro-Konstante. Durch Kenntnis von $s$ und ${\ce {D}}$ und der entsprechenden Dichte (oft auch dem partiellen spezifischen Volumen ${\bar {\nu }}$) eines z.B. Proteins ist es somit möglich die molare Masse unabhängig von der Form zu bestimmen.