„CRISPR/Cas-Methode“ – Versionsunterschied

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== Eigenschaften ==
== Eigenschaften ==
Das CRISPR/Cas-System entstammt einem adaptiven antiviralen Abwehrmechanismus aus Bakterien, dem [[CRISPR]].<ref>R. Sorek, V. Kunin, P. Hugenholtz: ''CRISPR–a widespread system that provides acquired resistance against phages in bacteria and archaea.'' In: ''Nature reviews. Microbiology.'' Band 6, Nummer 3, März 2008, S.&nbsp;181–186, {{ISSN|1740-1534}}. [[doi:10.1038/nrmicro1793]]. PMID 18157154.</ref> Es wird verwendet, um DNA an einer bestimmbaren [[DNA-Sequenz]] zu schneiden. Dadurch können z. B. DNA-Sequenzen entfernt oder andere DNA-Sequenzen an dieser Stelle eingefügt werden. Das CRISPR/Cas-System kann durch Zugabe eines DNA-[[Oligonukleotid]]s auch zur Veränderung von [[RNA]] verwendet werden.<ref>M. R. O'Connell, B. L. Oakes, S. H. Sternberg, A. East-Seletsky, M. Kaplan, J. A. Doudna: ''Programmable RNA recognition and cleavage by CRISPR/Cas9.'' In: ''Nature.'' Band 516, Nummer 7530, Dezember 2014, S.&nbsp;263–266, {{ISSN|1476-4687}}. [[doi:10.1038/nature13769]]. PMID 25274302.</ref>
Das CRISPR/Cas-System entstammt einem adaptiven antiviralen Abwehrmechanismus aus Bakterien, dem [[CRISPR]].<ref>R. Sorek, V. Kunin, P. Hugenholtz: ''CRISPR–a widespread system that provides acquired resistance against phages in bacteria and archaea.'' In: ''Nature reviews. Microbiology.'' Band 6, Nummer 3, März 2008, S.&nbsp;181–186, {{ISSN|1740-1534}}. [[doi:10.1038/nrmicro1793]]. PMID 18157154.</ref><ref>D. Rath, L. Amlinger, A. Rath, M. Lundgren: ''The CRISPR-Cas immune system: biology, mechanisms and applications.'' In: ''Biochimie.'' Band 117, Oktober 2015, S.&nbsp;119–128, {{DOI|10.1016/j.biochi.2015.03.025}}, PMID 25868999 (Review).</ref> Es wird verwendet, um DNA an einer bestimmbaren [[DNA-Sequenz]] zu schneiden. Dadurch können z. B. DNA-Sequenzen entfernt oder andere DNA-Sequenzen an dieser Stelle eingefügt werden. Das CRISPR/Cas-System kann durch Zugabe eines DNA-[[Oligonukleotid]]s auch zur Veränderung von [[RNA]] verwendet werden.<ref>M. R. O'Connell, B. L. Oakes, S. H. Sternberg, A. East-Seletsky, M. Kaplan, J. A. Doudna: ''Programmable RNA recognition and cleavage by CRISPR/Cas9.'' In: ''Nature.'' Band 516, Nummer 7530, Dezember 2014, S.&nbsp;263–266, {{ISSN|1476-4687}}. [[doi:10.1038/nature13769]]. PMID 25274302.</ref>


''Cas''-Proteine können als [[Ribonukleoprotein]]e bestimmte RNA-Sequenzen binden. Die [[Endonuklease]] ''[[Cas9]]'' (von {{enS}} ''CRISPR-associated'', veraltet auch ''Cas5, Csn1'' oder ''Csx12'') kann eine bestimmte RNA-Sequenz (''crRNA repeat'', Sequenz GUUUUAGAGCU(A/G)UG(C/U)UGUUUUG)<ref>G. Gasiunas, R. Barrangou, P. Horvath, V. Siksnys: ''Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria.'' In: ''Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.'' Band 109, Nummer 39, September 2012, S.&nbsp;E2579–E2586, {{ISSN|1091-6490}}. [[doi:10.1073/pnas.1208507109]]. PMID 22949671. {{PMC|3465414}}.</ref> binden und DNA schneiden. Diese ''crRNA repeat''-Sequenz bildet eine RNA-[[Sekundärstruktur]] und wird dann von ''Cas9'' gebunden.<ref>V. Kunin, R. Sorek, P. Hugenholtz: ''Evolutionary conservation of sequence and secondary structures in CRISPR repeats.'' In: ''Genome biology.'' Band 8, Nummer 4, 2007, S.&nbsp;R61, {{ISSN|1465-6914}}. [[doi:10.1186/gb-2007-8-4-r61]]. PMID 17442114. {{PMC|1896005}}.</ref> An der ''crRNA repeat''-Sequenz befindet sich anschließend eine an die Ziel-DNA bindende Sequenz (''crRNA spacer''), beide Sequenzen werden zusammen als ''crRNA'' bezeichnet. Als zweiter Teil dient die ''crRNA spacer''-Sequenz in der Funktion eines variablen Adapters, welche komplementär zur Ziel-DNA ist und an die Ziel-DNA bindet. Dadurch wird die DNA nahe der Bindungsstelle geschnitten.
''Cas''-Proteine können als [[Ribonukleoprotein]]e bestimmte RNA-Sequenzen binden. Die [[Endonuklease]] ''[[Cas9]]'' (von {{enS}} ''CRISPR-associated'', veraltet auch ''Cas5, Csn1'' oder ''Csx12'') kann eine bestimmte RNA-Sequenz (''crRNA repeat'', Sequenz GUUUUAGAGCU(A/G)UG(C/U)UGUUUUG)<ref>G. Gasiunas, R. Barrangou, P. Horvath, V. Siksnys: ''Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria.'' In: ''Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.'' Band 109, Nummer 39, September 2012, S.&nbsp;E2579–E2586, {{ISSN|1091-6490}}. [[doi:10.1073/pnas.1208507109]]. PMID 22949671. {{PMC|3465414}}.</ref> binden und DNA schneiden. Diese ''crRNA repeat''-Sequenz bildet eine RNA-[[Sekundärstruktur]] und wird dann von ''Cas9'' gebunden.<ref>V. Kunin, R. Sorek, P. Hugenholtz: ''Evolutionary conservation of sequence and secondary structures in CRISPR repeats.'' In: ''Genome biology.'' Band 8, Nummer 4, 2007, S.&nbsp;R61, {{ISSN|1465-6914}}. [[doi:10.1186/gb-2007-8-4-r61]]. PMID 17442114. {{PMC|1896005}}.</ref> An der ''crRNA repeat''-Sequenz befindet sich anschließend eine an die Ziel-DNA bindende Sequenz (''crRNA spacer''), beide Sequenzen werden zusammen als ''crRNA'' bezeichnet. Als zweiter Teil dient die ''crRNA spacer''-Sequenz in der Funktion eines variablen Adapters, welche komplementär zur Ziel-DNA ist und an die Ziel-DNA bindet. Dadurch wird die DNA nahe der Bindungsstelle geschnitten.


Wird an eine ''crRNA repeat''-Sequenz anstatt der natürlich vorkommenden ''crRNA spacer''-Sequenz eine andere, zu einer DNA-Zielsequenz komplementäre RNA-Sequenz angefügt und diese ''crRNA'' zu einer zur DNA-Sequenz analogen RNA (''tracrRNA'', von engl. ''trans-acting CRISPR RNA'') hinzugegeben, schneidet ''Cas9'' die DNA nahe der Zielsequenz. Die beiden RNA-Stränge der ''crRNA'' und der ''tracrRNA'' können auch in einem einzelnen, teilweise [[Hybridisierung (Molekularbiologie)|selbsthybridisierenden]] RNA-Strang untergebracht werden.<ref name="PMID 22745249" /> Durch das ''Cas9'' mit den entsprechenden RNA-Sequenzen kann sequenzspezifisch doppelsträngige, teilweise komplementäre DNA geschnitten werden, wodurch gezielte [[Deletion]]en erzeugt werden können. Durch [[Transformation (Genetik)|Transformation]] oder [[Transfektion]] von einem [[Vektor (Gentechnik)|Vektor]] können Lebewesen mit dem CRISPR/Cas-System "ergänzt" werden, die es natürlicherweise nicht besitzen, z. B. manche Bakterienstämme,<ref name="pmid23360965">W. Jiang, D. Bikard, D. Cox, F. Zhang, L. A. Marraffini: ''RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems.'' In: ''Nature biotechnology.'' Band 31, Nummer 3, März 2013, S.&nbsp;233–239, {{ISSN|1546-1696}}. [[doi:10.1038/nbt.2508]]. PMID 23360965. {{PMC|3748948}}.</ref> [[Bäckerhefe]],<ref name="pmid23460208">J. E. DiCarlo, J. E. Norville, P. Mali, X. Rios, J. Aach, G. M. Church: ''Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems.'' In: ''Nucleic acids research.'' Band 41, Nummer 7, April 2013, S.&nbsp;4336–4343, {{ISSN|1362-4962}}. [[doi:10.1093/nar/gkt135]]. PMID 23460208. {{PMC|3627607}}.</ref> [[Taufliege]]n,<ref name="pmid2408874">G. W. Thickbroom, F. L. Mastaglia: ''Cerebral events preceding self-paced and visually triggered saccades. A study of presaccadic potentials.'' In: ''Electroencephalography and clinical neurophysiology.'' Band 62, Nummer 4, Juli 1985, S.&nbsp;277–289, {{ISSN|0013-4694}}. PMID 2408874.</ref> [[Zebrabärbling]]e,<ref name="pmid23360964">W. Y. Hwang, Y. Fu, D. Reyon, M. L. Maeder, S. Q. Tsai, J. D. Sander, R. T. Peterson, J. R. Yeh, J. K. Joung: ''Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system.'' In: ''Nature biotechnology.'' Band 31, Nummer 3, März 2013, S.&nbsp;227–229, {{ISSN|1546-1696}}. [[doi:10.1038/nbt.2501]]. PMID 23360964. {{PMC|3686313}}.</ref> [[Mäuse]]<ref name="pmid23643243">H. Wang, H. Yang, C. S. Shivalila, M. M. Dawlaty, A. W. Cheng, F. Zhang, R. Jaenisch: ''One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.'' In: ''Cell.'' Band 153, Nummer 4, Mai 2013, S.&nbsp;910–918, {{ISSN|1097-4172}}. [[doi:10.1016/j.cell.2013.04.025]]. PMID 23643243. {{PMC|3969854}}.</ref> und [[Mensch]]en.<ref name="pmid23287722">P. Mali, L. Yang, K. M. Esvelt, J. Aach, M. Guell, J. E. DiCarlo, J. E. Norville, G. M. Church: ''RNA-guided human genome engineering via Cas9.'' In: ''Science (New York, N.Y.).'' Band 339, Nummer 6121, Februar 2013, S.&nbsp;823–826, {{ISSN|1095-9203}}. [[doi:10.1126/science.1232033]]. PMID 23287722. {{PMC|3712628}}.</ref><ref name="DOI10.1007/s13238-015-0153-5">Puping Liang, Yanwen Xu, Xiya Zhang, Chenhui Ding, Rui Huang, Zhen Zhang, Jie Lv, Xiaowei Xie, Yuxi Chen, Yujing Li, Ying Sun, Yaofu Bai, Zhou Songyang, Wenbin Ma, Canquan Zhou, Junjiu Huang: ''CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes.'' In: ''Protein & Cell.'' 6, 2015, S.&nbsp;363, [[doi:10.1007/s13238-015-0153-5]].</ref>
Wird an eine ''crRNA repeat''-Sequenz anstatt der natürlich vorkommenden ''crRNA spacer''-Sequenz eine andere, zu einer DNA-Zielsequenz komplementäre RNA-Sequenz angefügt und diese ''crRNA'' zu einer zur DNA-Sequenz analogen RNA (''tracrRNA'', von engl. ''trans-acting CRISPR RNA'') hinzugegeben, schneidet ''Cas9'' die DNA nahe der Zielsequenz. Die beiden RNA-Stränge der ''crRNA'' und der ''tracrRNA'' können auch in einem einzelnen, teilweise [[Hybridisierung (Molekularbiologie)|selbsthybridisierenden]] RNA-Strang untergebracht werden.<ref name="PMID 22745249" /> Durch das ''Cas9'' mit den entsprechenden RNA-Sequenzen kann sequenzspezifisch doppelsträngige, teilweise komplementäre DNA geschnitten werden, wodurch gezielte [[Deletion]]en erzeugt werden können. Durch [[Transformation (Genetik)|Transformation]] oder [[Transfektion]] von einem [[Vektor (Gentechnik)|Vektor]] können Lebewesen mit dem CRISPR/Cas-System "ergänzt" werden, die es natürlicherweise nicht besitzen, z. B. manche Bakterienstämme,<ref name="pmid23360965">W. Jiang, D. Bikard, D. Cox, F. Zhang, L. A. Marraffini: ''RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems.'' In: ''Nature biotechnology.'' Band 31, Nummer 3, März 2013, S.&nbsp;233–239, {{ISSN|1546-1696}}. [[doi:10.1038/nbt.2508]]. PMID 23360965. {{PMC|3748948}}.</ref> [[Bäckerhefe]],<ref name="pmid23460208">J. E. DiCarlo, J. E. Norville, P. Mali, X. Rios, J. Aach, G. M. Church: ''Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems.'' In: ''Nucleic acids research.'' Band 41, Nummer 7, April 2013, S.&nbsp;4336–4343, {{ISSN|1362-4962}}. [[doi:10.1093/nar/gkt135]]. PMID 23460208. {{PMC|3627607}}.</ref> [[Taufliege]]n,<ref name="pmid2408874">K. J. Beumer, D. Carroll: ''Targeted genome engineering techniques in Drosophila.'' In: ''Methods (San Diego, Calif.).'' Band 68, Nummer 1, Juni 2014, S.&nbsp;29–37, {{DOI|10.1016/j.ymeth.2013.12.002}}, PMID 24412316, {{PMC|4048800}} (Review).</ref> [[Zebrabärbling]]e,<ref name="pmid23360964">W. Y. Hwang, Y. Fu, D. Reyon, M. L. Maeder, S. Q. Tsai, J. D. Sander, R. T. Peterson, J. R. Yeh, J. K. Joung: ''Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system.'' In: ''Nature biotechnology.'' Band 31, Nummer 3, März 2013, S.&nbsp;227–229, {{ISSN|1546-1696}}. [[doi:10.1038/nbt.2501]]. PMID 23360964. {{PMC|3686313}}.</ref> [[Mäuse]]<ref name="pmid23643243">H. Wang, H. Yang, C. S. Shivalila, M. M. Dawlaty, A. W. Cheng, F. Zhang, R. Jaenisch: ''One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.'' In: ''Cell.'' Band 153, Nummer 4, Mai 2013, S.&nbsp;910–918, {{ISSN|1097-4172}}. [[doi:10.1016/j.cell.2013.04.025]]. PMID 23643243. {{PMC|3969854}}.</ref> und [[Mensch]]en.<ref name="pmid23287722">P. Mali, L. Yang, K. M. Esvelt, J. Aach, M. Guell, J. E. DiCarlo, J. E. Norville, G. M. Church: ''RNA-guided human genome engineering via Cas9.'' In: ''Science (New York, N.Y.).'' Band 339, Nummer 6121, Februar 2013, S.&nbsp;823–826, {{ISSN|1095-9203}}. [[doi:10.1126/science.1232033]]. PMID 23287722. {{PMC|3712628}}.</ref><ref name="DOI10.1007/s13238-015-0153-5">Puping Liang, Yanwen Xu, Xiya Zhang, Chenhui Ding, Rui Huang, Zhen Zhang, Jie Lv, Xiaowei Xie, Yuxi Chen, Yujing Li, Ying Sun, Yaofu Bai, Zhou Songyang, Wenbin Ma, Canquan Zhou, Junjiu Huang: ''CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes.'' In: ''Protein & Cell.'' 6, 2015, S.&nbsp;363, [[doi:10.1007/s13238-015-0153-5]].</ref>


Durch Doppelstrangbrüche kann die Häufigkeit einer [[Homologe Rekombination|homologen Rekombination]] deutlich erhöht werden,<ref>N. Rudin, E. Sugarman, J. E. Haber: ''Genetic and physical analysis of double-strand break repair and recombination in Saccharomyces cerevisiae.'' In: ''Genetics.'' Band 122, Nummer 3, Juli 1989, S.&nbsp;519–534, {{ISSN|0016-6731}}. PMID 2668114. {{PMC|1203726}}.</ref> wodurch ein sequenzspezifischer Schnitt durch ''Cas9'' auch zum Einfügen von DNA-Sequenzen (z. B. im Zuge der Gentherapie) verwendet werden kann, sofern die anschließend einzufügende DNA an beiden Enden jeweils eine zur jeweiligen Zielsequenz überlappende Sequenz aufweist.<ref>P. D. Hsu, E. S. Lander, F. Zhang: ''Development and Applications of CRISPR-Cas9 for Genome Engineering.'' In: ''Cell.'' Band 157, Nummer 6, Juni 2014, S.&nbsp;1262–1278, {{ISSN|1097-4172}}. [[doi:10.1016/j.cell.2014.05.010]]. PMID 24906146. [http://www.cell.com/cell/pdf/S0092-8674%2814%2900604-7.pdf PDF].</ref> Die Änderung mehrerer DNA-Zielsequenzen wird als [[Multiplex Genome Editing]] bezeichnet. Zur Minimierung unspezifischer DNA-Schnitte und der daraus folgenden [[Mutagenese]] werden verschiedene Ansätze zur Erhöhung der [[Beurteilung eines Klassifikators|Spezifität]] untersucht, wie [[Proteindesign]] der Cas9 oder Ersatz von der Endonukleaseaktivität von Cas9 durch [[Fusionsprotein|Kombination]] mit anderen Endonukleasen. Die Mutation von [[Asparaginsäure]] zu [[Alanin]] an der Position 10 in Cas9 (kurz: D10A) inaktiviert die Endonukleasefunktion unter Erhalt der RNA-DNA-Bindungsfunktion.<ref>K. Ishida, P. Gee, A. Hotta: ''Minimizing off-Target Mutagenesis Risks Caused by Programmable Nucleases.'' In: ''International journal of molecular sciences.'' Band 16, Nummer 10, 2015, S.&nbsp;24751–24771, {{DOI|10.3390/ijms161024751}}, PMID 26501275, {{PMC|4632775}} (Review).</ref> Weiterhin wird die Spezifität durch die [[Affinität (Biochemie)|Affinität]] der RNA-DNA-Bindung bestimmt.<ref>H. O'Geen, A. S. Yu, D. J. Segal: ''How specific is CRISPR/Cas9 really?'' In: ''Current opinion in chemical biology.'' [elektronische Veröffentlichung vor dem Druck] Oktober 2015, {{DOI|10.1016/j.cbpa.2015.10.001}}, PMID 26517564.</ref>
Durch Doppelstrangbrüche kann die Häufigkeit einer [[Homologe Rekombination|homologen Rekombination]] deutlich erhöht werden,<ref>N. Rudin, E. Sugarman, J. E. Haber: ''Genetic and physical analysis of double-strand break repair and recombination in Saccharomyces cerevisiae.'' In: ''Genetics.'' Band 122, Nummer 3, Juli 1989, S.&nbsp;519–534, {{ISSN|0016-6731}}. PMID 2668114. {{PMC|1203726}}.</ref> wodurch ein sequenzspezifischer Schnitt durch ''Cas9'' auch zum Einfügen von DNA-Sequenzen (z. B. im Zuge der Gentherapie) verwendet werden kann, sofern die anschließend einzufügende DNA an beiden Enden jeweils eine zur jeweiligen Zielsequenz überlappende Sequenz aufweist.<ref>P. D. Hsu, E. S. Lander, F. Zhang: ''Development and Applications of CRISPR-Cas9 for Genome Engineering.'' In: ''Cell.'' Band 157, Nummer 6, Juni 2014, S.&nbsp;1262–1278, {{ISSN|1097-4172}}. [[doi:10.1016/j.cell.2014.05.010]]. PMID 24906146. [http://www.cell.com/cell/pdf/S0092-8674%2814%2900604-7.pdf PDF].</ref> Die Änderung mehrerer DNA-Zielsequenzen wird als [[Multiplex Genome Editing]] bezeichnet. Zur Minimierung unspezifischer DNA-Schnitte und der daraus folgenden [[Mutagenese]] werden verschiedene Ansätze zur Erhöhung der [[Beurteilung eines Klassifikators|Spezifität]] untersucht, wie [[Proteindesign]] der Cas9 oder Ersatz von der Endonukleaseaktivität von Cas9 durch [[Fusionsprotein|Kombination]] mit anderen Endonukleasen. Die Mutation von [[Asparaginsäure]] zu [[Alanin]] an der Position 10 in Cas9 (kurz: D10A) inaktiviert die Endonukleasefunktion unter Erhalt der RNA-DNA-Bindungsfunktion.<ref>K. Ishida, P. Gee, A. Hotta: ''Minimizing off-Target Mutagenesis Risks Caused by Programmable Nucleases.'' In: ''International journal of molecular sciences.'' Band 16, Nummer 10, 2015, S.&nbsp;24751–24771, {{DOI|10.3390/ijms161024751}}, PMID 26501275, {{PMC|4632775}} (Review).</ref> Weiterhin wird die Spezifität durch die [[Affinität (Biochemie)|Affinität]] der RNA-DNA-Bindung bestimmt.<ref>H. O'Geen, A. S. Yu, D. J. Segal: ''How specific is CRISPR/Cas9 really?'' In: ''Current opinion in chemical biology.'' [elektronische Veröffentlichung vor dem Druck] Oktober 2015, {{DOI|10.1016/j.cbpa.2015.10.001}}, PMID 26517564.</ref><ref>T. Koo, J. Lee, J. S. Kim: ''Measuring and Reducing Off-Target Activities of Programmable Nucleases Including CRISPR-Cas9.'' In: ''Molecules and cells.'' Band 38, Nummer 6, Juni 2015, S.&nbsp;475–481, {{DOI|10.14348/molcells.2015.0103}}, PMID 25985872, {{PMC|4469905}} (Review).</ref><ref>Y. Ma, L. Zhang, X. Huang: ''Genome modification by CRISPR/Cas9.'' In: ''The FEBS journal.'' Band 281, Nummer 23, Dezember 2014, S.&nbsp;5186–5193, {{DOI|10.1111/febs.13110}}, PMID 25315507 (Review).</ref>


== Typen ==
== Typen ==
Es existieren mehr als 40 verschiedene ''Cas''-Proteinfamilien.<ref>D. H. Haft, J. Selengut, E. F. Mongodin, K. E. Nelson: ''A guild of 45 CRISPR-associated (Cas) protein families and multiple CRISPR/Cas subtypes exist in prokaryotic genomes.'' In: ''PLoS computational biology.'' Band 1, Nummer 6, November 2005, S.&nbsp;e60, {{ISSN|1553-7358}}. [[doi:10.1371/journal.pcbi.0010060]]. PMID 16292354. {{PMC|1282333}}.</ref> Die Familien können in drei Typen eingeteilt werden.<ref name="DOI10.1126/science.aaa4535">D. W. Taylor, Y. Zhu, R. H. J. Staals, J. E. Kornfeld, A. Shinkai, J. van der Oost, E. Nogales, J. A. Doudna: ''Structures of the CRISPR-Cmr complex reveal mode of RNA target positioning.'' In: ''Science.'' 348, 2015, S.&nbsp;581, [[doi:10.1126/science.aaa4535]].</ref> Typ I und Typ II binden und schneiden doppelsträngige DNA, während Typ III einzelsträngige RNA bindet und schneidet.<ref name="DOI10.1126/science.aaa4535" /> Die Typen I und III sind strukturell verwandt, was einen gemeinsamen Ursprung nahelegt.<ref name="DOI10.1126/science.aaa4535" /> Das helikale Protein ''Cas'' des Typs III besitzt mehrere ''[[β-Schleife|β-hairpins]]'', die in Abständen von sechs Nukleotiden die Doppelhelix der crRNA und der Ziel-RNA für den Schnitt auseinanderdrücken.<ref name="DOI10.1126/science.aaa4535" />
Es existieren mehr als 40 verschiedene ''Cas''-Proteinfamilien.<ref>D. H. Haft, J. Selengut, E. F. Mongodin, K. E. Nelson: ''A guild of 45 CRISPR-associated (Cas) protein families and multiple CRISPR/Cas subtypes exist in prokaryotic genomes.'' In: ''PLoS computational biology.'' Band 1, Nummer 6, November 2005, S.&nbsp;e60, {{ISSN|1553-7358}}. [[doi:10.1371/journal.pcbi.0010060]]. PMID 16292354. {{PMC|1282333}}.</ref> Die Familien können in drei Typen eingeteilt werden.<ref name="DOI10.1126/science.aaa4535">D. W. Taylor, Y. Zhu, R. H. J. Staals, J. E. Kornfeld, A. Shinkai, J. van der Oost, E. Nogales, J. A. Doudna: ''Structures of the CRISPR-Cmr complex reveal mode of RNA target positioning.'' In: ''Science.'' 348, 2015, S.&nbsp;581, [[doi:10.1126/science.aaa4535]].</ref> Typ I, II und IIIa binden und schneiden doppelsträngige DNA, während Typ IIIb einzelsträngige RNA bindet und schneidet.<ref name="PMID 24909109">J. van der Oost, E. R. Westra, R. N. Jackson, B. Wiedenheft: ''Unravelling the structural and mechanistic basis of CRISPR-Cas systems.'' In: ''Nature reviews. Microbiology.'' Band 12, Nummer 7, Juli 2014, S.&nbsp;479–492, {{DOI|10.1038/nrmicro3279}}, PMID 24909109, {{PMC|4225775}} (Review).</ref><ref name="DOI10.1126/science.aaa4535" /> Bei allen Typen erfolgt die Bildung des ''spacers'' in Bakterien durch ''Cas1'' und ''Cas2''.<ref name="PMID 24909109" /> Bei den Typen I-A und I-E erfolgt der DNA-Schnitt durch Cas3'', während bei Typ II ''Cas9'', bei Typ III-A ''Csm6'' und bei Typ III-B ''Cmr4'' den Schnitt bewirkt.<ref name="PMID 24909109" /> Die Typen I und III sind strukturell verwandt, was einen gemeinsamen Ursprung nahelegt.<ref name="DOI10.1126/science.aaa4535" /> Das helikale Protein ''Cas'' des Typs III besitzt mehrere ''[[β-Schleife|β-hairpins]]'', die in Abständen von sechs Nukleotiden die Doppelhelix der crRNA und der Ziel-RNA für den Schnitt auseinanderdrücken.<ref name="DOI10.1126/science.aaa4535" />


Das Cas9 stammt meistens entweder aus ''[[Streptococcus pyogenes]]'' (''SpCas9'') oder ''[[Staphylococcus aureus]]'' (''SaCas9''), wobei die codierende DNA-Sequenz von SaCas9 etwa 1000 Basenpaare kürzer ist.<ref name="DOI10.1038/nature14299">F. Ann Ran, L. e. Cong, Winston X. Yan, David A. Scott, Jonathan S. Gootenberg, Andrea J. Kriz, Bernd Zetsche, Ophir Shalem, Xuebing Wu, Kira S. Makarova, Eugene V. Koonin, Phillip A. Sharp, Feng Zhang: ''In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9.'' In: ''Nature.'' 520, 2015, S.&nbsp;186, [[doi:10.1038/nature14299]].</ref>
Das Cas9 stammt meistens entweder aus ''[[Streptococcus pyogenes]]'' (''SpCas9'') oder ''[[Staphylococcus aureus]]'' (''SaCas9''), wobei die codierende DNA-Sequenz von SaCas9 etwa 1000 Basenpaare kürzer ist.<ref name="DOI10.1038/nature14299">F. Ann Ran, L. e. Cong, Winston X. Yan, David A. Scott, Jonathan S. Gootenberg, Andrea J. Kriz, Bernd Zetsche, Ophir Shalem, Xuebing Wu, Kira S. Makarova, Eugene V. Koonin, Phillip A. Sharp, Feng Zhang: ''In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9.'' In: ''Nature.'' 520, 2015, S.&nbsp;186, [[doi:10.1038/nature14299]].</ref>


Eine alternative Methode mit gleicher Spannbreite möglicher DNA-Zielsequenzen ist das [[CRISPR/Cpf1-System]].
Eine alternative Methode mit gleicher Spannbreite möglicher DNA-Zielsequenzen ist das [[CRISPR/Cpf1-System]]. Alternativ zum CRISPR/Cas-System können teilweise [[Transcription Activator-like Effector Nuclease]]s und [[Zinkfingernuklease]]n verwendet werden.


== Anwendungen ==
== Anwendungen ==
[[Datei:CRISPR Sterics.pdf|mini|Blockade der Genexpression durch eine ''Cas9''-Mutante (''dCas9'') im Zuge der CRISPRi]]
[[Datei:CRISPR Sterics.pdf|mini|Blockade der Genexpression durch eine ''Cas9''-Mutante (''dCas9'') im Zuge der CRISPRi]]
Das CRISPR/Cas-System kann unter anderem zum [[Genome Editing]] (Deletionen und Insertionen) und damit auch zur [[Gentherapie]] verwendet werden.<ref>Y. Wang, Z. Li, J. Xu, B. Zeng, L. Ling, L. You, Y. Chen, Y. Huang, A. Tan: ''The CRISPR/Cas System mediates efficient genome engineering in Bombyx mori.'' In: ''Cell research.'' Band 23, Nummer 12, Dezember 2013, S.&nbsp;1414–1416, {{ISSN|1748-7838}}. [[doi:10.1038/cr.2013.146]]. PMID 24165890. {{PMC|3847576}}.</ref><ref>T. R. Sampson, D. S. Weiss: ''Exploiting CRISPR/Cas systems for biotechnology.'' In: ''BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology.'' Band 36, Nummer 1, Januar 2014, S.&nbsp;34–38, {{ISSN|1521-1878}}. [[doi:10.1002/bies.201300135]]. PMID 24323919.</ref> Alternativ zum CRISPR/Cas-System können [[Transcription Activator-like Effector Nuclease]]s und [[Zinkfingernuklease]]n verwendet werden. Weiterhin wird das CRISPR/Cas-System zur Entfernung der Genome von [[Infektionserreger]]n chronischer [[Infektionskrankheit]]en wie das [[Hepatitis-B-Virus]]<ref>G. Lin, K. Zhang, J. Li: ''Application of CRISPR/Cas9 Technology to HBV.'' In: ''International journal of molecular sciences.'' Band 16, Nummer 11, 2015, S.&nbsp;26077–26086, {{DOI|10.3390/ijms161125950}}, PMID 26540039 (Review).</ref> und das [[HIV]] eingesetzt.<ref>L. Ye, J. Wang, A. I. Beyer, F. Teque, T. J. Cradick, Z. Qi, J. C. Chang, G. Bao, M. O. Muench, J. Yu, J. A. Levy, Y. W. Kan: ''Seamless modification of wild-type induced pluripotent stem cells to the natural CCR5Δ32 mutation confers resistance to HIV infection.'' In: ''Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.'' Band 111, Nummer 26, Juli 2014, S.&nbsp;9591–9596, {{DOI|10.1073/pnas.1407473111}}, PMID 24927590, {{PMC|4084478}}.</ref> Das CRISPR/Cas-System wird zur Korrektur von [[Mutation]]en bei der Erzeugung [[Induzierte pluripotente Stammzelle|induzierter pluripotenter Stammzellen]]<ref>H. L. Li, P. Gee, K. Ishida, A. Hotta: ''Efficient genomic correction methods in human iPS cells using CRISPR-Cas9 system.'' In: ''Methods (San Diego, Calif.).'' [elektronische Veröffentlichung vor dem Druck] Oktober 2015, {{DOI|10.1016/j.ymeth.2015.10.015}}, PMID 26525194.</ref> und [[Embryonale Stammzelle|embryonalen Stammzellen]] verwendet.<ref>T. Horii, I. Hatada: ''Genome Editing Using Mammalian Haploid Cells.'' In: ''International journal of molecular sciences.'' Band 16, Nummer 10, 2015, S.&nbsp;23604–23614, {{DOI|10.3390/ijms161023604}}, PMID 26437403, {{PMC|4632716}} (Review).</ref><ref>E. A. Vasileva, O. U. Shuvalov, A. V. Garabadgiu, G. Melino, N. A. Barlev: ''Genome-editing tools for stem cell biology.'' In: ''Cell death & disease.'' Band 6, 2015, S.&nbsp;e1831, {{DOI|10.1038/cddis.2015.167}}, PMID 26203860, {{PMC|4650720}} (Review).</ref> Weitere Anwendungen werden untersucht.<ref>N. Savić, G. Schwank: ''Advances in therapeutic CRISPR/Cas9 genome editing.'' In: ''Translational research : the journal of laboratory and clinical medicine.'' [elektronische Veröffentlichung vor dem Druck] September 2015, {{DOI|10.1016/j.trsl.2015.09.008}}, PMID 26470680.</ref>
Das CRISPR/Cas-System kann unter anderem zum [[Genome Editing]] (Deletionen/[[Gen-Knockout]]<ref>O. Shalem, N. E. Sanjana, F. Zhang: ''High-throughput functional genomics using CRISPR-Cas9.'' In: ''Nature reviews. Genetics.'' Band 16, Nummer 5, Mai 2015, S.&nbsp;299–311, {{DOI|10.1038/nrg3899}}, PMID 25854182, {{PMC|4503232}} (Review).</ref> und Insertionen) und damit auch zur [[Gentherapie]] verwendet werden.<ref>Y. Wang, Z. Li, J. Xu, B. Zeng, L. Ling, L. You, Y. Chen, Y. Huang, A. Tan: ''The CRISPR/Cas System mediates efficient genome engineering in Bombyx mori.'' In: ''Cell research.'' Band 23, Nummer 12, Dezember 2013, S.&nbsp;1414–1416, {{ISSN|1748-7838}}. [[doi:10.1038/cr.2013.146]]. PMID 24165890. {{PMC|3847576}}.</ref><ref>T. R. Sampson, D. S. Weiss: ''Exploiting CRISPR/Cas systems for biotechnology.'' In: ''BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology.'' Band 36, Nummer 1, Januar 2014, S.&nbsp;34–38, {{ISSN|1521-1878}}. [[doi:10.1002/bies.201300135]]. PMID 24323919.</ref> Weiterhin wird das CRISPR/Cas-System zur Entfernung der Genome von [[Infektionserreger]]n chronischer [[Infektionskrankheit]]en wie das [[Hepatitis-B-Virus]]<ref>G. Lin, K. Zhang, J. Li: ''Application of CRISPR/Cas9 Technology to HBV.'' In: ''International journal of molecular sciences.'' Band 16, Nummer 11, 2015, S.&nbsp;26077–26086, {{DOI|10.3390/ijms161125950}}, PMID 26540039 (Review).</ref> und das [[HIV]] eingesetzt.<ref>L. Ye, J. Wang, A. I. Beyer, F. Teque, T. J. Cradick, Z. Qi, J. C. Chang, G. Bao, M. O. Muench, J. Yu, J. A. Levy, Y. W. Kan: ''Seamless modification of wild-type induced pluripotent stem cells to the natural CCR5Δ32 mutation confers resistance to HIV infection.'' In: ''Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.'' Band 111, Nummer 26, Juli 2014, S.&nbsp;9591–9596, {{DOI|10.1073/pnas.1407473111}}, PMID 24927590, {{PMC|4084478}}.</ref> Die gezielte Veränderung einzelner Gene wird bei der Charakterisierung von [[Onkogen]]en und somit zur Untersuchung der [[Tumor]]entstehung verwendet.<ref>F. J. Sánchez-Rivera, T. Jacks: ''Applications of the CRISPR-Cas9 system in cancer biology.'' In: ''Nature reviews. Cancer.'' Band 15, Nummer 7, Juli 2015, S.&nbsp;387–395, {{DOI|10.1038/nrc3950}}, PMID 26040603, {{PMC|4530801}} (Review).</ref>
Das CRISPR/Cas-System wird zur Untersuchung der Funktionen von teilweise unbekannten [[Gen]]en eingesetzt.<ref>T. Wijshake, D. J. Baker, B. van de Sluis: ''Endonucleases: new tools to edit the mouse genome.'' In: ''Biochimica et biophysica acta.'' Band 1842, Nummer 10, Oktober 2014, S.&nbsp;1942–1950, {{DOI|10.1016/j.bbadis.2014.04.020}}, PMID 24794718.</ref> Weiterhin wird es zur Korrektur von [[Mutation]]en bei der Erzeugung [[Induzierte pluripotente Stammzelle|induzierter pluripotenter Stammzellen]]<ref>H. L. Li, P. Gee, K. Ishida, A. Hotta: ''Efficient genomic correction methods in human iPS cells using CRISPR-Cas9 system.'' In: ''Methods (San Diego, Calif.).'' [elektronische Veröffentlichung vor dem Druck] Oktober 2015, {{DOI|10.1016/j.ymeth.2015.10.015}}, PMID 26525194.</ref> und [[Embryonale Stammzelle|embryonalen Stammzellen]] verwendet.<ref>T. Horii, I. Hatada: ''Genome Editing Using Mammalian Haploid Cells.'' In: ''International journal of molecular sciences.'' Band 16, Nummer 10, 2015, S.&nbsp;23604–23614, {{DOI|10.3390/ijms161023604}}, PMID 26437403, {{PMC|4632716}} (Review).</ref><ref>E. A. Vasileva, O. U. Shuvalov, A. V. Garabadgiu, G. Melino, N. A. Barlev: ''Genome-editing tools for stem cell biology.'' In: ''Cell death & disease.'' Band 6, 2015, S.&nbsp;e1831, {{DOI|10.1038/cddis.2015.167}}, PMID 26203860, {{PMC|4650720}} (Review).</ref> Weitere Anwendungen werden untersucht.<ref>N. Savić, G. Schwank: ''Advances in therapeutic CRISPR/Cas9 genome editing.'' In: ''Translational research : the journal of laboratory and clinical medicine.'' [elektronische Veröffentlichung vor dem Druck] September 2015, {{DOI|10.1016/j.trsl.2015.09.008}}, PMID 26470680.</ref>


Mit dem CRISPR/Cas-System wurden unter anderem [[Bakteriophage]]n-resistente Bakterienstämme erzeugt, durch eine adaptive [[Resistenz]] bei Hinzufügen entsprechender RNA bei industriell wichtigen Bakterien, z. B. in der [[Milch]]- oder [[Wein]]industrie. Durch ein mutiertes ''Cas'' ohne funktionsfähige Endonuklease (''dCas9'') kann ein [[DNA-bindendes Protein]] erzeugt werden, welches analog zur [[RNAi]] zu einem [[Gen-Knockdown|Knockdown]] von endogenen Genen führt,<ref>L. S. Qi, M. H. Larson, L. A. Gilbert, [[Jennifer Doudna|J. A. Doudna]], J. S. Weissman, A. P. Arkin, W. A. Lim: ''Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression.'' In: ''Cell.'' Band 152, Nummer 5, Februar 2013, S.&nbsp;1173–1183, {{ISSN|1097-4172}}. [[doi:10.1016/j.cell.2013.02.022]]. PMID 23452860. {{PMC|3664290}}.</ref> z. B. durch Transformation mit einem [[Plasmid]], aus dem ''Cas9'' und eine CRISPR-RNA [[Transkription (Biologie)|transkribiert]] wird (''CRISPRi'').<ref>M. H. Larson, L. A. Gilbert, X. Wang, W. A. Lim, J. S. Weissman, L. S. Qi: ''CRISPR interference (CRISPRi) for sequence-specific control of gene expression.'' In: ''Nature protocols.'' Band 8, Nummer 11, November 2013, S.&nbsp;2180–2196, {{ISSN|1750-2799}}. [[doi:10.1038/nprot.2013.132]]. PMID 24136345. {{PMC|3922765}}.</ref> Anhand charakteristischer CRISPR-Sequenzen können CRISPR/Cas enthaltende [[Bakterien]]stämme identifiziert werden (''spoligotyping''). Ein [[grün fluoreszierendes Protein]] kann mit einer Cas-[[Mutante]] als [[Fusionsprotein]] zur Markierung von [[DNA-Sequenz]]en (auch repetitiver Sequenzen wie [[Telomer]]e) verwendet werden.<ref>B. Chen, L. A. Gilbert, B. A. Cimini, J. Schnitzbauer, W. Zhang, G. W. Li, J. Park, E. H. Blackburn, J. S. Weissman, L. S. Qi, B. Huang: ''Dynamic Imaging of Genomic Loci in Living Human Cells by an Optimized CRISPR/Cas System.'' In: ''Cell.'' Band 155, Nummer 7, Dezember 2013, S.&nbsp;1479–1491, {{ISSN|1097-4172}}. [[doi:10.1016/j.cell.2013.12.001]]. PMID 24360272.</ref> Durch das CRISPR/Cas-System konnte die Herstellungszeit von transgenen Tieren wie transgenen [[Farbmaus|Mäusen]] von bis zu zwei Jahren auf wenige Wochen verkürzt werden.<ref name="pmid23643243" />
Mit dem CRISPR/Cas-System wurden unter anderem [[Bakteriophage]]n-resistente Bakterienstämme erzeugt, durch eine adaptive [[Resistenz]] bei Hinzufügen entsprechender RNA bei industriell wichtigen Bakterien, z. B. in der [[Milch]]- oder [[Wein]]industrie. Durch ein mutiertes ''Cas'' ohne funktionsfähige Endonuklease (''dCas9'') kann ein [[DNA-bindendes Protein]] erzeugt werden, welches analog zur [[RNAi]] zu einem [[Gen-Knockdown|Knockdown]] von endogenen Genen führt,<ref>L. S. Qi, M. H. Larson, L. A. Gilbert, [[Jennifer Doudna|J. A. Doudna]], J. S. Weissman, A. P. Arkin, W. A. Lim: ''Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression.'' In: ''Cell.'' Band 152, Nummer 5, Februar 2013, S.&nbsp;1173–1183, {{ISSN|1097-4172}}. [[doi:10.1016/j.cell.2013.02.022]]. PMID 23452860. {{PMC|3664290}}.</ref> z. B. durch Transformation mit einem [[Plasmid]], aus dem ''Cas9'' und eine CRISPR-RNA [[Transkription (Biologie)|transkribiert]] wird (''CRISPRi'').<ref>M. H. Larson, L. A. Gilbert, X. Wang, W. A. Lim, J. S. Weissman, L. S. Qi: ''CRISPR interference (CRISPRi) for sequence-specific control of gene expression.'' In: ''Nature protocols.'' Band 8, Nummer 11, November 2013, S.&nbsp;2180–2196, {{ISSN|1750-2799}}. [[doi:10.1038/nprot.2013.132]]. PMID 24136345. {{PMC|3922765}}.</ref> Anhand charakteristischer CRISPR-Sequenzen können CRISPR/Cas enthaltende [[Bakterien]]stämme identifiziert werden (''spoligotyping''). Ein [[grün fluoreszierendes Protein]] kann mit einer Cas-[[Mutante]] als [[Fusionsprotein]] zur Markierung von [[DNA-Sequenz]]en (auch repetitiver Sequenzen wie [[Telomer]]e) verwendet werden.<ref>B. Chen, L. A. Gilbert, B. A. Cimini, J. Schnitzbauer, W. Zhang, G. W. Li, J. Park, E. H. Blackburn, J. S. Weissman, L. S. Qi, B. Huang: ''Dynamic Imaging of Genomic Loci in Living Human Cells by an Optimized CRISPR/Cas System.'' In: ''Cell.'' Band 155, Nummer 7, Dezember 2013, S.&nbsp;1479–1491, {{ISSN|1097-4172}}. [[doi:10.1016/j.cell.2013.12.001]]. PMID 24360272.</ref> Durch das CRISPR/Cas-System konnte die Herstellungszeit von transgenen Tieren wie transgenen [[Farbmaus|Mäusen]] von bis zu zwei Jahren auf wenige Wochen verkürzt werden.<ref name="pmid23643243" />

== Literatur ==
* M. Belfort, R. P. Bonocora: ''Homing endonucleases: from genetic anomalies to programmable genomic clippers.'' In: ''Methods in molecular biology (Clifton, N.J.).'' Band 1123, 2014, S.&nbsp;1–26, {{DOI|10.1007/978-1-62703-968-0_1}}, PMID 24510256, {{PMC|4436680}.
* V. Pattanayak, J. P. Guilinger, D. R. Liu: ''Determining the specificities of TALENs, Cas9, and other genome-editing enzymes.'' In: ''Methods in enzymology.'' Band 546, 2014, S.&nbsp;47–78, {{DOI|10.1016/B978-0-12-801185-0.00003-9}}, PMID 25398335, {{PMC|4440668}}.
* R. Barrangou, A. Birmingham, S. Wiemann, R. L. Beijersbergen, V. Hornung, A. v. Smith: ''Advances in CRISPR-Cas9 genome engineering: lessons learned from RNA interference.'' In: ''Nucleic acids research.'' Band 43, Nummer 7, April 2015, S.&nbsp;3407–3419, {{DOI|10.1093/nar/gkv226}}, PMID 25800748, {{PMC|4402539}}.


== Weblinks ==
== Weblinks ==

Version vom 7. Dezember 2015, 23:07 Uhr

Das CRISPR/Cas-System (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) ist eine biochemische Methode, um DNA gezielt zu schneiden und zu verändern (Genome Editing). Gene können mit dem CRISPR/Cas-System eingefügt, entfernt oder ausgeschaltet werden,[1] auch Nukleotide in einem Gen können geändert werden.[2] Das CRISPR/Cas-System wurde 2012 von Emmanuelle Charpentier und Jennifer Doudna entdeckt.

Eigenschaften

Das CRISPR/Cas-System entstammt einem adaptiven antiviralen Abwehrmechanismus aus Bakterien, dem CRISPR.[3][4] Es wird verwendet, um DNA an einer bestimmbaren DNA-Sequenz zu schneiden. Dadurch können z. B. DNA-Sequenzen entfernt oder andere DNA-Sequenzen an dieser Stelle eingefügt werden. Das CRISPR/Cas-System kann durch Zugabe eines DNA-Oligonukleotids auch zur Veränderung von RNA verwendet werden.[5]

Cas-Proteine können als Ribonukleoproteine bestimmte RNA-Sequenzen binden. Die Endonuklease Cas9 (von englisch CRISPR-associated, veraltet auch Cas5, Csn1 oder Csx12) kann eine bestimmte RNA-Sequenz (crRNA repeat, Sequenz GUUUUAGAGCU(A/G)UG(C/U)UGUUUUG)[6] binden und DNA schneiden. Diese crRNA repeat-Sequenz bildet eine RNA-Sekundärstruktur und wird dann von Cas9 gebunden.[7] An der crRNA repeat-Sequenz befindet sich anschließend eine an die Ziel-DNA bindende Sequenz (crRNA spacer), beide Sequenzen werden zusammen als crRNA bezeichnet. Als zweiter Teil dient die crRNA spacer-Sequenz in der Funktion eines variablen Adapters, welche komplementär zur Ziel-DNA ist und an die Ziel-DNA bindet. Dadurch wird die DNA nahe der Bindungsstelle geschnitten.

Wird an eine crRNA repeat-Sequenz anstatt der natürlich vorkommenden crRNA spacer-Sequenz eine andere, zu einer DNA-Zielsequenz komplementäre RNA-Sequenz angefügt und diese crRNA zu einer zur DNA-Sequenz analogen RNA (tracrRNA, von engl. trans-acting CRISPR RNA) hinzugegeben, schneidet Cas9 die DNA nahe der Zielsequenz. Die beiden RNA-Stränge der crRNA und der tracrRNA können auch in einem einzelnen, teilweise selbsthybridisierenden RNA-Strang untergebracht werden.[1] Durch das Cas9 mit den entsprechenden RNA-Sequenzen kann sequenzspezifisch doppelsträngige, teilweise komplementäre DNA geschnitten werden, wodurch gezielte Deletionen erzeugt werden können. Durch Transformation oder Transfektion von einem Vektor können Lebewesen mit dem CRISPR/Cas-System "ergänzt" werden, die es natürlicherweise nicht besitzen, z. B. manche Bakterienstämme,[8] Bäckerhefe,[9] Taufliegen,[10] Zebrabärblinge,[11] Mäuse[12] und Menschen.[13][14]

Durch Doppelstrangbrüche kann die Häufigkeit einer homologen Rekombination deutlich erhöht werden,[15] wodurch ein sequenzspezifischer Schnitt durch Cas9 auch zum Einfügen von DNA-Sequenzen (z. B. im Zuge der Gentherapie) verwendet werden kann, sofern die anschließend einzufügende DNA an beiden Enden jeweils eine zur jeweiligen Zielsequenz überlappende Sequenz aufweist.[16] Die Änderung mehrerer DNA-Zielsequenzen wird als Multiplex Genome Editing bezeichnet. Zur Minimierung unspezifischer DNA-Schnitte und der daraus folgenden Mutagenese werden verschiedene Ansätze zur Erhöhung der Spezifität untersucht, wie Proteindesign der Cas9 oder Ersatz von der Endonukleaseaktivität von Cas9 durch Kombination mit anderen Endonukleasen. Die Mutation von Asparaginsäure zu Alanin an der Position 10 in Cas9 (kurz: D10A) inaktiviert die Endonukleasefunktion unter Erhalt der RNA-DNA-Bindungsfunktion.[17] Weiterhin wird die Spezifität durch die Affinität der RNA-DNA-Bindung bestimmt.[18][19][20]

Typen

Es existieren mehr als 40 verschiedene Cas-Proteinfamilien.[21] Die Familien können in drei Typen eingeteilt werden.[22] Typ I, II und IIIa binden und schneiden doppelsträngige DNA, während Typ IIIb einzelsträngige RNA bindet und schneidet.[23][22] Bei allen Typen erfolgt die Bildung des spacers in Bakterien durch Cas1 und Cas2.[23] Bei den Typen I-A und I-E erfolgt der DNA-Schnitt durch Cas3, während bei Typ II Cas9, bei Typ III-A Csm6 und bei Typ III-B Cmr4 den Schnitt bewirkt.[23] Die Typen I und III sind strukturell verwandt, was einen gemeinsamen Ursprung nahelegt.[22] Das helikale Protein Cas des Typs III besitzt mehrere β-hairpins, die in Abständen von sechs Nukleotiden die Doppelhelix der crRNA und der Ziel-RNA für den Schnitt auseinanderdrücken.[22]

Das Cas9 stammt meistens entweder aus Streptococcus pyogenes (SpCas9) oder Staphylococcus aureus (SaCas9), wobei die codierende DNA-Sequenz von SaCas9 etwa 1000 Basenpaare kürzer ist.[24]

Eine alternative Methode mit gleicher Spannbreite möglicher DNA-Zielsequenzen ist das CRISPR/Cpf1-System. Alternativ zum CRISPR/Cas-System können teilweise Transcription Activator-like Effector Nucleases und Zinkfingernukleasen verwendet werden.

Anwendungen

Blockade der Genexpression durch eine Cas9-Mutante (dCas9) im Zuge der CRISPRi

Das CRISPR/Cas-System kann unter anderem zum Genome Editing (Deletionen/Gen-Knockout[25] und Insertionen) und damit auch zur Gentherapie verwendet werden.[26][27] Weiterhin wird das CRISPR/Cas-System zur Entfernung der Genome von Infektionserregern chronischer Infektionskrankheiten wie das Hepatitis-B-Virus[28] und das HIV eingesetzt.[29] Die gezielte Veränderung einzelner Gene wird bei der Charakterisierung von Onkogenen und somit zur Untersuchung der Tumorentstehung verwendet.[30]

Das CRISPR/Cas-System wird zur Untersuchung der Funktionen von teilweise unbekannten Genen eingesetzt.[31] Weiterhin wird es zur Korrektur von Mutationen bei der Erzeugung induzierter pluripotenter Stammzellen[32] und embryonalen Stammzellen verwendet.[33][34] Weitere Anwendungen werden untersucht.[35]

Mit dem CRISPR/Cas-System wurden unter anderem Bakteriophagen-resistente Bakterienstämme erzeugt, durch eine adaptive Resistenz bei Hinzufügen entsprechender RNA bei industriell wichtigen Bakterien, z. B. in der Milch- oder Weinindustrie. Durch ein mutiertes Cas ohne funktionsfähige Endonuklease (dCas9) kann ein DNA-bindendes Protein erzeugt werden, welches analog zur RNAi zu einem Knockdown von endogenen Genen führt,[36] z. B. durch Transformation mit einem Plasmid, aus dem Cas9 und eine CRISPR-RNA transkribiert wird (CRISPRi).[37] Anhand charakteristischer CRISPR-Sequenzen können CRISPR/Cas enthaltende Bakterienstämme identifiziert werden (spoligotyping). Ein grün fluoreszierendes Protein kann mit einer Cas-Mutante als Fusionsprotein zur Markierung von DNA-Sequenzen (auch repetitiver Sequenzen wie Telomere) verwendet werden.[38] Durch das CRISPR/Cas-System konnte die Herstellungszeit von transgenen Tieren wie transgenen Mäusen von bis zu zwei Jahren auf wenige Wochen verkürzt werden.[12]

Literatur

  • M. Belfort, R. P. Bonocora: Homing endonucleases: from genetic anomalies to programmable genomic clippers. In: Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). Band 1123, 2014, S. 1–26, doi:10.1007/978-1-62703-968-0_1, PMID 24510256, {{PMC|4436680}.
  • V. Pattanayak, J. P. Guilinger, D. R. Liu: Determining the specificities of TALENs, Cas9, and other genome-editing enzymes. In: Methods in enzymology. Band 546, 2014, S. 47–78, doi:10.1016/B978-0-12-801185-0.00003-9, PMID 25398335, PMC 4440668 (freier Volltext).
  • R. Barrangou, A. Birmingham, S. Wiemann, R. L. Beijersbergen, V. Hornung, A. v. Smith: Advances in CRISPR-Cas9 genome engineering: lessons learned from RNA interference. In: Nucleic acids research. Band 43, Nummer 7, April 2015, S. 3407–3419, doi:10.1093/nar/gkv226, PMID 25800748, PMC 4402539 (freier Volltext).

Weblinks

Einzelnachweise

  1. ↑ a b Martin Jinek, Krzysztof Chylinski, Ines Fonfara, Michael Hauer, Jennifer A. Doudna, Emmanuelle Charpentier: A Programmable Dual-RNA–Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity. In: Science. Band 337, Nr. 6096, 17. August 2012, ISSN 0036-8075, S. 816–821, doi:10.1126/science.1225829, PMID 22745249.
  2. ↑ H. Ochiai: Single-Base Pair Genome Editing in Human Cells by Using Site-Specific Endonucleases. In: International journal of molecular sciences. Band 16, Nummer 9, 2015, S. 21128–21137, doi:10.3390/ijms160921128, PMID 26404258, PMC 4613245 (freier Volltext) (Review).
  3. ↑ R. Sorek, V. Kunin, P. Hugenholtz: CRISPR–a widespread system that provides acquired resistance against phages in bacteria and archaea. In: Nature reviews. Microbiology. Band 6, Nummer 3, März 2008, S. 181–186, ISSN 1740-1534. doi:10.1038/nrmicro1793. PMID 18157154.
  4. ↑ D. Rath, L. Amlinger, A. Rath, M. Lundgren: The CRISPR-Cas immune system: biology, mechanisms and applications. In: Biochimie. Band 117, Oktober 2015, S. 119–128, doi:10.1016/j.biochi.2015.03.025, PMID 25868999 (Review).
  5. ↑ M. R. O'Connell, B. L. Oakes, S. H. Sternberg, A. East-Seletsky, M. Kaplan, J. A. Doudna: Programmable RNA recognition and cleavage by CRISPR/Cas9. In: Nature. Band 516, Nummer 7530, Dezember 2014, S. 263–266, ISSN 1476-4687. doi:10.1038/nature13769. PMID 25274302.
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