Ligandenbindungstest

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Der Proteinkomplex Arp2/3 besteht aufgrund affiner Bindungen der Untereinheiten zueinander.

Ein Ligandenbindungstest (englisch ligand binding assay, LBA) ist eine Methode der Biochemie und Pharmakologie zur Messung der Affinität der Bindung zweier Moleküle zueinander.[1][2][3]

Prinzip[Bearbeiten]

Bindung von Tacrin (blau) an der Cholinesterase.
Hauptartikel: Affinität (Biochemie)

Die Bindungsneigung zweier Moleküle aneinander wird als Affinität bezeichnet. Jedes Molekül kann an jedes Andere mit der entsprechenden Affinität binden. Die Bindungspartner einer Bindung können z. B. ein Ligand und ein Rezeptor sein. Kleine Moleküle werden meistens in einer Tasche eines Proteins gebunden, da durch die vergrößerte Kontaktfläche eine affinere Bindung ermöglicht wird. Die maximale Ligandenbindung Bmax und die Dissoziationskonstante Kd können durch ein Scatchard-Diagramm ermittelt werden. Die Dissoziationskonstanten hochaffiner Bindungen liegen bei etwa 10-9 M-1 (z. B. Hormone an ihre Rezeptoren, stabile Proteinkomplexe, Antigen-Antikörper-Bindungen).

Im Gegensatz zu den folgenden Ligandenbindungstests messen die Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie, die Bio-Layer-Interferometrie und die Messung von Impedanzänderungen die Änderung der Schichtdicke ohne eine Verwendung einer Markierung, benötigen jedoch meistens höhere Konzentrationen an Liganden.

Filtermembranen[Bearbeiten]

Der Filtertest (synonym Membranbindungstest) wird durch das Hinzufügen eines markierten möglichen Bindungspartners zu einem auf einer Oberfläche (z. B. Filterpapier, PVDF-Membranen, Polyethylenimin-beschichtete Glasfaserfilter) immobilisierten Molekül erzielt. Die Markierung kann radioaktiv, ein Reporterenzym, Biotin, ein Fluorophor, oder ein Oligonukleotid sein. Nach mehreren Waschschritten der beschichteten Oberfläche wird die Menge an verbliebenen gebundenen Molekülen bestimmt. Verfahren ohne Waschsschritte werden gelegentlich als mix-and-measure bezeichnet.[2]

Zuerst erfolgt die Messung der Gleichgewichtskonstante bei verschiedenen Konzentrationen des mit dem Reporter markierten Moleküls. Hierbei wird das markierte Molekül mit dem immobilisierten Bindungspartner bis zum erreichen des chemischen Gleichgewichts inkubiert. Anschließend wird die Membran getrocknet und die Menge des gebundenen Reportermoleküls bestimmt. Nach einer zuvor festgelegten Anzahl an Waschschritten wird die Menge der Reportermoleküle auf der Membran erneut gemessen, was Auskunft über die Auswaschung an Reportermolekülen gibt. (englisch off-rate). Alternativ kann die Auswaschung auch durch Bestimmung des Zeitlichen Verlaufs der Menge an Reportermolekülen ermittelt werden.

Größenausschlusschromatographie[Bearbeiten]

Sofern Rezeptor und Ligand unterschiedliche Molmassen besitzen, können die aneinander gebundenen Bindungspartner auch per Größenausschlusschromatographie isoliert und die Menge anhand der Markierung bestimmt werden.

Isotherme Titrationskalorimetrie[Bearbeiten]

Mit der isothermen Titrationskalorimetrie kann die Affinität bestimmt werden, sofern die Bindung nicht ausschließlich entropisch getrieben ist (bei einer isenthalpen Bindung). Hierbei werden keine Markierungen benötigt, kurzzeitige Bindungen werden nicht erfasst.

Geschichte[Bearbeiten]

Ursprünglich wurden Ligandenbindungstests bei der Proteincharakterisierung von Hormonen, Neurotransmittern und ihren Rezeptoren eingesetzt. In der medizinischen Diagnostik von Brustkrebs wurde eine Variante verwendet, bei der an Zellextrakte gebundenes radioaktiv markiertes Estradiol gemessen wird, nach einer Adsorption ungebundenen Estradiols an Dextran-beschichtete Aktivkohle.[4]

Literatur[Bearbeiten]

Weblinks[Bearbeiten]

Einzelnachweise[Bearbeiten]

  1. G. S. Sittampalam, S. D. Kahl, W. P. Janzen: High-throughput screening: advances in assay technologies. In: Current opinion in chemical biology. Band 1, Nummer 3, Oktober 1997, S. 384–391, ISSN 1367-5931. PMID 9667878.
  2. a b L. A. de Jong, D. R. Uges, J. P. Franke, R. Bischoff: Receptor-ligand binding assays: technologies and applications. In: Journal of chromatography. B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. Band 829, Nummer 1–2, Dezember 2005, S. 1–25, ISSN 1570-0232. doi:10.1016/j.jchromb.2005.10.002. PMID 16253574.
  3. D. DeSimone, J. Y. Shih, H. C. Gunn, V. Patel, L. Uy, T. M. Thway: Method transfer for ligand-binding assays: recommendations for best practice. In: Bioanalysis. Band 3, Nummer 18, September 2011, S. 2143–2152, ISSN 1757-6199. doi:10.4155/bio.11.199. PMID 21942524.
  4. W. L. McGuire: Estrogen receptors in human breast cancer. In: The Journal of clinical investigation. Band 52, Nummer 1, Januar 1973, S. 73–77, ISSN 0021-9738. doi:10.1172/JCI107175. PMID 4345203. PMC 302228 (freier Volltext).