Polyhistidin-Tag

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Nickel-Nitrilotriessigsäure-Komplex.

Ein Polyhistidin-Tag (synonym His-Tag, Hexahistidin-Tag, His6-Tag) ist ein Protein-Tag, das zur Proteinreinigung und zum Nachweis markierter Proteine verwendet wird.[1]

Eigenschaften[Bearbeiten]

Die Aminosäuresequenz des Polyhistidin-Tags ist eine Folge von mindestens sechs Histidinen, deren Gensequenz N-terminal nach dem Start-Methionin-Codon oder C-terminal vor das Stopp-Codon in das offene Leseraster eines Gens kloniert wird.[2] Dadurch entsteht ein Fusionsprotein mit einem Polyhistidin-Tag. Gelegentlich wird eine Schnittstelle für eine Protease oder ein Intein zwischen Protein und Polyhistidin-Tag eingefügt, um eine Abspaltung des Tags nach einer Proteinreinigung zu ermöglichen.

Das Polyhistidin-Tag bindet mit mikromolarer Affinität an zweiwertige Nickel- oder Kobalt-Ionen und bildet einen Chelatkomplex. Werden die Ionen durch Bindung an einen Feststoff-gekoppelten Chelator immobilisiert, können die Proteine mit Polyhistidin-Tag in einer Affinitätschromatographie (genauer: in einer Metall-Chelat-Affinitätschromatographie) selektiv gebunden werden und durch Spülen der Säule mit 20 mM Imidazol von den ungebundenen Proteinen befreit werden.[3] Als Säulenbett wird meistens Nitrilotriessigsäure-Agarose (Ni-NTA-Agarose), seltener auch Ni2+-Iminodiessigsäure-Agarose (Ni-IDA-Agarose) oder Co2+-Carboxymethylaspartate-Agarose (Co-CMA-Agarose) verwendet. Die Elution der gebundenen Proteine erfolgt mit einem Puffer, der 75 bis 300 mM Imidazol, einen sauren pH-Wert (pH 4 für Nickel-Agarosen und pH 6 für Kobalt-Agarosen) oder Nickel- oder Kobaltionen enthält. Störsubstanzen sind EDTA, manche Tenside und Reduktionsmittel (z. B. aus dem Probenpuffer). Nach der Elution wird das Imidazol meistens durch Dialyse entfernt.

An die Nickel-basierten Säulenmaterialien bindet auch die Peptidyl-Prolyl-cis-trans-Isomerasen vom FKBP-Typ (SlyD, 25kDa) aus E. coli. Daher wird oftmals eine Tandem-Affinity-Purification zur weiteren Reinigung verwendet.[4] Es gibt auch SlyD-defiziente Bakterienstämme. Kobalt-CMA-Agarose bindet SlyD schwächer.

Durch eine serielle Verwendung von mehreren Polyhistidin-Tags können Proteine mit zunehmender Anzahl bei zunehmender Imidazol-Konzentration nacheinander eluiert werden. Dadurch können mehrere Proteine mit unterschiedlicher Hexahistidin-Anzahl gleichzeitig gereinigt und bei steigenden Imidazol-Konzentrationen nacheinander eluiert werden.[5]

Anwendungen[Bearbeiten]

Polyhistidin-Tags werden zur Reinigung rekombinanter Proteine per Affinitätschromatographie, für Pulldown-Assays und – bei Verwendung von Anti-Polyhistidin-Tag-Antikörpern – für Methoden mit einer Immunmarkierung (z. B. ELISA, Western Blot, Immunfluoreszenz, Immunhistochemie und Durchflusszytometrie) verwendet. Es gibt selektiv bindende Fluoreszenzfarbstoffe.[6] Ein Protein mit Polyhistidin-Tag kann auf Nickel- oder Kobalt-Oberflächen immobilisiert werden oder in Nickel-haltigen Membranen adsorbiert werden.[7]

Einzelnachweise[Bearbeiten]

  1. E. Hochuli, W. Bannwarth, H. Döbeli, R. Gentz, D. Stüber: Genetic Approach to Facilitate Purification of Recombinant Proteins with a Novel Metal Chelate Adsorbent. In: Nature Biotechnology. 6, Nr. 11, 1988, S. 1321–1325. doi:10.1038/nbt1188-1321.
  2. K. J. Petty: Metal-chelate affinity chromatography. In: Current protocols in neuroscience / editorial board, Jacqueline N. Crawley ... [et al.]. Chapter 5Mai 2001, S. Unit 5.10, ISSN 1934-8576. doi:10.1002/0471142301.ns0510s05. PMID 18428493.
  3. P Hengen: Purification of His-Tag fusion proteins from Escherichia coli. In: Trends in Biochemical Sciences. 20, Nr. 7, 1995, S. 285–6. doi:10.1016/S0968-0004(00)89045-3. PMID 7667882.
  4. A. C. Gavin, M. Bösche, R. Krause, P. Grandi, M. Marzioch, A. Bauer, J. Schultz, J. M. Rick, A. M. Michon, C. M. Cruciat, M. Remor, C. Höfert, M. Schelder, M. Brajenovic, H. Ruffner, A. Merino, K. Klein, M. Hudak, D. Dickson, T. Rudi, V. Gnau, A. Bauch, S. Bastuck, B. Huhse, C. Leutwein, M. A. Heurtier, R. R. Copley, A. Edelmann, E. Querfurth, V. Rybin, G. Drewes, M. Raida, T. Bouwmeester, P. Bork, B. Seraphin, B. Kuster, G. Neubauer, G. Superti-Furga: Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. In: Nature. Band 415, Nummer 6868, Januar 2002, ISSN 0028-0836, S. 141–147, doi:10.1038/415141a. PMID 11805826.
  5. Mark Howarth, Daniel J-F Chinnapen, Kimberly Gerrow, Pieter C Dorrestein, Melanie R Grandy, Neil L Kelleher, Alaa El-Husseini, Alice Y Ting: A monovalent streptavidin with a single femtomolar biotin binding site. In: Nature Methods. 3, Nr. 4, 2006, S. 267–73. doi:10.1038/nmeth861. PMID 16554831. PMC: 2576293 (freier Volltext).
  6. C Zhao, LM Hellman, X Zhan, WS Bowman, SW Whiteheart, MG Fried: Hexahistidine-tag-specific optical probes for analyses of proteins and their interactions. In: Analytical Biochemistry. 399, Nr. 2, 2010, S. 237–45. doi:10.1016/j.ab.2009.12.028. PMID 20036207. PMC: 2832190 (freier Volltext).
  7. J. Zhu, G. Sun: Facile fabrication of hydrophilic nanofibrous membranes with an immobilized metal-chelate affinity complex for selective protein separation. In: ACS applied materials & interfaces. Band 6, Nummer 2, Januar 2014, S. 925–932, ISSN 1944-8252. doi:10.1021/am4042965. PMID 24377297.