Polyhistidin-Tag

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Nickel-Nitrilotriessigsäure-Komplex.

Ein Polyhistidin-Tag (synonym His-Tag, Hexahistidin-Tag, His6-Tag) ist ein Protein-Tag, das zur Proteinreinigung und zum Nachweis markierter Proteine verwendet wird.[1]

Eigenschaften[Bearbeiten]

Die Aminosäuresequenz des Polyhistidin-Tags ist eine Folge von mindestens sechs Histidinen, deren Gensequenz N-terminal nach dem Start-Methionin-Codon oder C-terminal vor das Stopp-Codon in das offene Leseraster eines Gens kloniert wird.[2] Dadurch entsteht ein Fusionsprotein mit einem Polyhistidin-Tag. Gelegentlich wird eine Schnittstelle für eine Protease oder ein Intein zwischen Protein und Polyhistidin-Tag eingefügt, um eine Abspaltung des Tags nach einer Proteinreinigung zu ermöglichen.

Das Polyhistidin-Tag bindet mit mikromolarer Affinität an zweiwertige Nickel- oder Kobalt-Ionen und bildet einen Chelatkomplex. Werden die Ionen durch Bindung an einen Feststoff-gekoppelten Chelator immobilisiert, können die Proteine mit Polyhistidin-Tag in einer Affinitätschromatographie (genauer: in einer Metall-Chelat-Affinitätschromatographie) selektiv gebunden werden und durch Spülen der Säule mit 20 mM Imidazol von den ungebundenen Proteinen befreit werden.[3] Als Säulenbett wird meistens Nitrilotriessigsäure-Agarose (Ni-NTA-Agarose), seltener auch Ni2+-Iminodiessigsäure-Agarose (Ni-IDA-Agarose) oder Co2+-Carboxymethylaspartate-Agarose (Co-CMA-Agarose) verwendet. Die Elution der gebundenen Proteine erfolgt mit einem Puffer, der 75 bis 300 mM Imidazol, einen sauren pH-Wert (pH 4 für Nickel-Agarosen und pH 6 für Kobalt-Agarosen) oder Nickel- oder Kobaltionen enthält. Störsubstanzen sind EDTA, manche Tenside und Reduktionsmittel (z. B. aus dem Probenpuffer). Nach der Elution wird das Imidazol meistens durch Dialyse entfernt.

An die Nickel-basierten Säulenmaterialien bindet auch die Peptidyl-Prolyl-cis-trans-Isomerasen vom FKBP-Typ (SlyD, 25kDa) aus E. coli. Daher wird oftmals eine Tandem-Affinity-Purification zur weiteren Reinigung verwendet.[4] Es gibt auch SlyD-defiziente Bakterienstämme. Kobalt-CMA-Agarose bindet SlyD schwächer.

Durch eine serielle Verwendung von mehreren Polyhistidin-Tags können Proteine mit zunehmender Anzahl bei zunehmender Imidazol-Konzentration nacheinander eluiert werden. Dadurch können mehrere Proteine mit unterschiedlicher Hexahistidin-Anzahl gleichzeitig gereinigt und bei steigenden Imidazol-Konzentrationen nacheinander eluiert werden.[5]

Anwendungen[Bearbeiten]

Polyhistidin-Tags werden zur Reinigung rekombinanter Proteine per Affinitätschromatographie, für Pulldown-Assays und – bei Verwendung von Anti-Polyhistidin-Tag-Antikörpern – für Methoden mit einer Immunmarkierung (z. B. ELISA, Western Blot, Immunfluoreszenz, Immunhistochemie und Durchflusszytometrie) verwendet. Es gibt selektiv bindende Fluoreszenzfarbstoffe.[6] Ein Protein mit Polyhistidin-Tag kann auf Nickel- oder Kobalt-Oberflächen immobilisiert werden oder in Nickel-haltigen Membranen adsorbiert werden.[7]

Einzelnachweise[Bearbeiten]

  1. E. Hochuli, W. Bannwarth, H. Döbeli, R. Gentz, D. Stüber: Genetic Approach to Facilitate Purification of Recombinant Proteins with a Novel Metal Chelate Adsorbent. In: Nature Biotechnology. 6, Nr. 11, 1988, S. 1321–1325. doi:10.1038/nbt1188-1321.
  2. K. J. Petty: Metal-chelate affinity chromatography. In: Current protocols in neuroscience / editorial board, Jacqueline N. Crawley ... [et al.]. Chapter 5Mai 2001, S. Unit 5.10, ISSN 1934-8576. doi:10.1002/0471142301.ns0510s05. PMID 18428493.
  3. P Hengen: Purification of His-Tag fusion proteins from Escherichia coli. In: Trends in Biochemical Sciences. 20, Nr. 7, 1995, S. 285–6. doi:10.1016/S0968-0004(00)89045-3. PMID 7667882.
  4. AC Gavin, M Bösche, R Krause, P Grandi, M Marzioch, A Bauer, J Schultz, JM Rick: Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. In: Nature. 415, Nr. 6868, 2002, S. 141–7. doi:10.1038/415141a. PMID 11805826.
  5. Mark Howarth, Daniel J-F Chinnapen, Kimberly Gerrow, Pieter C Dorrestein, Melanie R Grandy, Neil L Kelleher, Alaa El-Husseini, Alice Y Ting: A monovalent streptavidin with a single femtomolar biotin binding site. In: Nature Methods. 3, Nr. 4, 2006, S. 267–73. doi:10.1038/nmeth861. PMID 16554831. PMC: 2576293 (freier Volltext).
  6. C Zhao, LM Hellman, X Zhan, WS Bowman, SW Whiteheart, MG Fried: Hexahistidine-tag-specific optical probes for analyses of proteins and their interactions. In: Analytical Biochemistry. 399, Nr. 2, 2010, S. 237–45. doi:10.1016/j.ab.2009.12.028. PMID 20036207. PMC: 2832190 (freier Volltext).
  7. J. Zhu, G. Sun: Facile fabrication of hydrophilic nanofibrous membranes with an immobilized metal-chelate affinity complex for selective protein separation. In: ACS applied materials & interfaces. Band 6, Nummer 2, Januar 2014, S. 925–932, ISSN 1944-8252. doi:10.1021/am4042965. PMID 24377297.