Western Blot

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Western Blot (Westernblot), auch Immunblot (engl. Immunoblot) bezeichnet die Übertragung (engl. Blotting) von Proteinen auf eine Trägermembran, die anschließend über unterschiedliche Reaktionen nachgewiesen werden können. Die Übertragung kann auf unterschiedliche Weise durchgeführt werden: mittels Diffusion, Kapillarwirkung oder Elektrophorese. Anwendung findet der Western Blot in der biochemischen und medizinischen Forschung sowie in der Diagnostik.

Die Western Blot-Methode wurde ursprünglich 1979 im Labor von Robert Nowinski im Fred Hutchinson Cancer Research Center in Seattle von W. Neal Burnette[1] und unabhängig im Labor von George R. Stark an der Universität Stanford entwickelt.[2] Im selben Jahr konnten Harry Towbin und Mitarbeiter das Verfahren wie im einfacheren Southern Blot auf Nitrocellulose umstellen,[3] was auch heutzutage die einfachere und präferierte Methode ist.

Die Bezeichnung des Blot-Verfahrens („Western Blot“) stammt vom englischen blot für Klecks oder Fleck und von engl. blotting paper für Löschpapier, bei dem auch ein identischer Abdruck des Originals entsteht. Diese wurde erstmals 1981 von Neal Burnette[4] als eine Allusion eingeführt (die Veröffentlichung erschien mit zwei Jahren Verspätung da die Zeitschrift sie ursprünglich abgelehnt hatte).[5] Edwin Southern gilt als der Erfinder der Blotting-Technik. Im Jahr 1975 entwickelte er eine Methode für die Auftrennung von DNA-Fragmenten und nachfolgende Hybridisierung, die er als Southern Blot bezeichnete. Die entsprechende Auftrennung von RNA-Fragmenten wurde in Anlehnung an seinen Namen als Northern Blot bezeichnet. Daher nannte man das Proteinblotting mit SDS Western Blot.

Einen Eastern Blot per se gibt es nicht. Dennoch wird der Ausdruck „Eastern Blot“ für verschiedene Methoden in Anspruch genommen, z. B für eine elektrophoretische Auftrennung und einen Transfer der Proteine auf Membranen mit einem kationischen Detergens (z. B. CTAB[6][7] oder 16-BAC[8]), bei dem die Proteine in die entgegengesetzte Richtung (zur Kathode) wandern. Der Ausdruck Eastern Blot wurde auch für das Blotten von Lipiden auf Membranen, den Transfer nativer Proteine aus nichtdenaturierenden Gelen oder das Auftropfen (engl. Blotting) von Molekülen verwendet.[9]

Prinzip[Bearbeiten]

Westernblot einer Nitrozellulosemembran, an die Proteine in unterschiedlichen Mengen (von links: 17 ng, 13 ng, 11 ng, 8 ng, 4 ng) fixiert wurden. Die Detektion erfolgte mit Hilfe eines zweiten Antikörpers, an den das Enzym Meerrettichperoxidase(HRP) gekoppelt wurde. Durch Chemolumineszenz wurde ein Film belichtet und entwickelt. Die Lumineszenzreaktion erfolgte in einer Lösung von 100 mM TRIS/HCl pH 6,8; 0,2 mM p-Cumarsäure (in Dimethylsulfoxid gelöst); 1,2 mM Luminol (Natriumsalz, in Dimethylsulfoxid gelöst) und 0,01 % (V/V) Wasserstoffperoxid.

Vor dem eigentlichen Western Blot wird ein Proteingemisch mit Hilfe einer Gel-Elektrophoresetechnik in einer Trägermatrix (SDS-PAGE, Nativ-PAGE, isoelektrische Fokussierung, 2D-Gelelektrophorese, usw.) entsprechend ihrer Größe, Ladung oder anderer Eigenschaften aufgetrennt. Hierbei werden die zu untersuchenden Proteine zuerst per Gelelektrophorese (in der Regel ein Polyacrylamid-Gel mit optimaler Acrylamid-Konzentration) in Proteinbanden aufgetrennt.

Proteintransfer[Bearbeiten]

Beim Western Blot wird ein senkrecht zum Polyacrylamid-Gel gerichtetes elektrisches Feld angelegt (Elektrotransfer), wodurch die Proteine in Richtung der Anode wandern. Sofern kein Zeitdruck besteht, kann der Transfer alternativ durch Kapillarwirkung in Richtung eines trockenen Stapels eines hydrophilen, adsorbierenden Materials erfolgen (Kapillartransfer). Beim Transfer wandern die Proteine aus dem Gel auf eine Membran, z. B. Nitrocellulose, Nylon, Glasfaser oder meistens Polyvinylidenfluorid (PVDF). Bei Nylon oder PVDF bleiben Proteine aufgrund hydrophober und polarer Wechselwirkungen an der Membranoberfläche haften, während die Adsorption bei Nitrocellulose oder Glasfasern über ionische und polare Wechselwirkungen erfolgt. Beim Transfer bleibt das Muster der elektrophoretischen Auftrennung erhalten. Die Proteine sind nun aber für weitere Methoden zugänglich (z. B. Bindung eines Immunkonjugats). Nach diesem Vorgang kann das an den Proteinen angelagerte SDS ausgewaschen werden. Daher können die Proteine renaturieren und teilweise ihre Sekundär- und Tertiärstruktur wieder einnehmen, aufgrund der räumlichen Trennung der verschiedenen Untereinheiten eines Proteins kann die Quartärstruktur so jedoch nicht wiederhergestellt werden. Zur Bestimmung der Anzahl und Größe der Untereinheiten eines Proteins kann jedoch vor der SDS-PAGE eine kovalente Vernetzung der Untereinheiten durchgeführt werden, die ein Aufkochen in Probenpuffer für die SDS-PAGE übersteht und nach einer Immunfärbung den Aufbau eines Proteinkomplexes aufzeigen kann. Für die elektrophoretische Übertragung werden zwei unterschiedliche Systeme verwendet: das Tank-Blot-System und das Semidry-Blot-System, die sich in Aufbau und eingesetzten Puffermengen und -systemen unterscheiden.

Proteindetektion[Bearbeiten]

Strukturformel von Amidoschwarz, dessen Natriumsalz Amidoschwarz 10 B als Farbstoff eingesetzt wird

Die temporäre Anfärbung aller Proteine auf der Blotmembran erlaubt eine Überprüfung des Proteintransfers und eine Abschätzung der Proteinmengen in den verschiedenen Spuren des Gels vor einer Immundetektion. Die Gesamtheit der membrangebundenen Proteine kann über bestimmte Farbstoffe sichtbar gemacht werden (Ladekontrolle). Beispiele sind Ponceau S,[10] Kolloidales Gold, Amidoschwarz[11] oder Tusche. Andere Farbstoffe sind in der Lage, posttranslationale Modifikationen wie z. B. phosphorylierte Proteine zu markieren. Die bei der SDS-PAGE häufig verwendeten Färbungen wie die Coomassie-Färbung oder die Silberfärbung erlauben nur eine geringe Renaturierung der Proteine während der Entfärbung vor einer Immundetektion und entfärben zudem unvollständig.[12] Fluoreszente Färbungen besitzen in zweidimensionalen Anwendungen einen größeren linearen dynamischen Bereich und erlauben eine genauere Mengenbestimmung, wie z. B. die Gesamtproteinfärbungen mit Trichloroethanol[13][14] oder Epicocconon.[15] Im Anschluss erfolgt die im nächsten Abschnitt beschriebene Immundetektion. Je nach Versuchsaufbau können auch mit anderen Methoden selektiv einzelne Proteine sichtbar gemacht werden, z. B. radioaktiv markierte Antikörper oder andere Proteine, die durch den Einbau von Isotopen bei der Proteinsynthese oder durch nachträgliche Phosphorylierung radioaktiv markiert werden, bei Enzymen durch Umsetzen eines entsprechenden Substrats.

Immundetektion einzelner Proteine[Bearbeiten]

Hauptartikel: Immunmarkierung

Die Proteinbanden werden meistens auf der Membran mit Hilfe spezifischer Antikörper identifiziert. Spezifische Antikörper (monoklonal) oder Mischungen von spezifischen Antikörpern (polyklonal) binden an der passenden Proteinbande auf der Membran. Unspezifisch gebundene Antikörper werden aufgrund von Waschschritten mit Puffern, die Detergentien enthalten, wieder entfernt. Dabei macht man sich die Affinität der Bindung zwischen Antigen und Antikörper zunutze: Ein antigenspezifischer Primärantikörper bindet an „sein“ Epitop auf dem räumlich von den anderen Proteinen getrennten Antigen mit einer charakteristischen Molmasse. Weil die Renaturierung nicht vollständig ist, können bei der Verwendung monoklonaler Antikörper, die ein diskontinuierliches Epitop (synonym: Konformationsepitop) am Protein erkennen, Probleme auftreten. Mit Antikörpern, die ein kontinuierliches Epitop (synonym: Sequenzepitop) erkennen können, ist eine Renaturierung nicht erforderlich.

Die Detektion erfolgt meistens mit einem Immunkonjugat. An die Fc-Region des primären Antikörpers bindet ein sekundärer Antikörper als Antikörperkonjugat (Immunkonjugat) mit einem Reporterenzym, über das nach weiteren Waschschritten die Detektion erfolgt. Die Verwendung eines Sekundärantikörper-Konjugats anstelle eines Primärantikörper-Konjugats erlaubt dessen modulare Verwendung bei verschiedenen Primärantikörpern mit einhergehender Kostenersparnis, da die Kopplung jedes einzelnen Primärantikörpers mit einem Reporterenzym entfällt. Weiterhin kommt es durch den Sekundärantikörper zur Signalverstärkung, da der polyklonale, gegen mehrere Epitope auf dem Fc-Fragment einer Spezies gerichtete Sekundärantikörper an mehrere Stellen im Fc-Bereich aller Primärantikörper einer Art binden kann und dort viele Reporterenzyme gruppiert. Reporterenzym-Antikörperkonjugate (-Immunkonjugate) sind im Handel erhältlich.

Je nach Fragestellung kann beim Immunblot – wie unten beschrieben - das Antigen oder – wie z. B. beim HIV-Test – auch der Primärantikörper das Suchobjekt sein. Auch Antikörper sind Proteine, und daher kann man ihre antigenen Eigenschaften neben dem Western Blot auch z. B. im Immunblot, ELISPOT und ELISA sichtbar machen.

Ablauf[Bearbeiten]

Schema der Immundetektion. Der primäre Antikörper bindet an sein Antigen, welches auf einer Membran fixiert ist. An diesen wiederum bindet der sekundäre Antikörper, der z. B. mit dem Enzym HRP gekoppelt ist. HRP katalysiert die Umsetzung von Luminol oder anderen Dioxetanen in seine oxidierte Form, dessen Lumineszenz detektiert werden kann.

Ein typischer Western Blot kann folgendermaßen aussehen:

  • Nach dem Transfer (SDS-PAGE und Blot) der Proteine auf die Membran müssen zuerst die freien unspezifischen Proteinbindungsstellen auf der Membran blockiert werden, da sich sonst die Antikörper an diese Bindungstellen heften und einen spezifischen Nachweis von Antigenen unmöglich machen würden. Das Blockieren der freien Bindungsstellen erfolgt mit einem für die Antikörper nicht erkennbaren Protein oder chemischen Polymer. Dafür eignen sich Lösungen von entfettetem Milchpulver, Rinderserumalbumin (BSA, bovine serum albumin), Gelatine und andere Proteine oder auch Lösungen von Polyvinylpyrrolidon mit einem milden Detergens.[16][17] Wurde zusätzlich zu den zu untersuchenden Proteinen ein ungefärbter Größenmarker (synonym: Komigrationsstandard) verwendet, sollte zuerst eine reversible Färbung aller Proteine auf der Membran mit z. B. Ponceau S erfolgen. Die anschließend sichtbaren Markerbanden können mit mechanischem Druck auf die Membran erhalten werden und so auch noch nach der Farbreaktion zur Proteinidentifizierung herangezogen werden. Bei vorgefärbten Größenmarkern entfällt die reversible Proteinfärbung.
  • Die Membran wird nun mit einer verdünnten Antikörper-Lösung behandelt, wobei die Antikörper spezifisch gegen ein Protein oder auch gegen mehrere Proteine auf der Membran gerichtet sind.
  • Einige Waschschritte mit einer Detergenslösung entfernen schwächer haftende, unspezifisch gebundene Antikörper von der Membran.
  • Eine zweite Antikörperlösung (mit dem Sekundär-Antikörper) wird auf die Membran gegeben, deren Antikörper spezifisch gegen bestimmte Bereiche des ersten Antikörpers gerichtet sind (in der Regel die Fc-Region des Antikörpers) und an diese Bereiche binden.
  • Nach weiteren Waschschritten erfolgt nun je nach Detektionsmethode die Sichtbarmachung. Bei Enzym-Immunkonjugaten wird durch das Enzym eine Farb- oder Chemolumineszenzreaktion katalysiert.

Immunblot vs. (EL)ISA[Bearbeiten]

Beides sind Methoden, die zum Nachweis von Antigenen (Proteinen) mit Hilfe markierter Antikörper dienen: Beide sind damit ISAs (Immunosorbent Assay), Methoden aus dem Bereich der Proteomik.

Der Immunblot erweitert den ELISA gewissermaßen um die Dimension der elektrophoretischen Auftrennung auf Kosten einer selektiven Anreicherung der Antigene durch Coating-Antikörper. Diese fehlende Anreicherung kann durch eine zusätzliche Proteinreinigung oder eine Immunpräzipitation erreicht werden. Durch die Gelelektrophorese und die Fixierung auf einem Festmedium (der Blotmembran) stehen den Antikörpern an verschiedenen, definierten Orten unterschiedliche Antigene getrennt zur „Auswahl“: Ein einziger Immunblot kann z. B. ein Serum mittels einer Vielzahl aufgeblotteter Antigene auf ebendiese Vielzahl an zugehörigen Antikörpern überprüfen, jedoch werden aufgrund der Denaturierung während der Probenvorbereitung zur SDS-PAGE fast ausschließlich kontinuierliche Epitope (synonym Sequenzepitope) nachgewiesen. Durch die räumliche Auftrennung können ebenso mehrere Bestandteile, gegen die ein Serum Antikörper enthält, parallel und selektiv nachgewiesen werden. Dieser Effekt kann durch Seren von Immunisierten oder Rekonvaleszenten (polyklonal) oder auch durch Mischungen von monoklonalen Antikörpern erreicht werden.

Anwendungen[Bearbeiten]

Im Bereich der Proteinbiochemie dient der Western Blot zum Nachweis von bestimmten Proteinen und Protein-Veränderungen, z. B. Phosphorylierung. Es kann auch eine semiquantitative Analyse durchgeführt werden (Probe A enthält mehr Protein X als Probe B), mit dem Auftrag einer Verdünnungsreihe einer bekannten Proteinkonzentration kann die Abschätzung der Menge auf dem Blot etwas genauer verglichen werden.

Im Bereich der Medizin dient das Western Blotting dem Nachweis diagnostisch relevanter Proteine, so zum Beispiel von Antikörpern im Serum, welche für das Vorliegen bestimmter Infektionskrankheiten typisch sein können. Mittels des Western Blots kann man Teststreifen herstellen, um z. B. Antikörper gegen bestimmte Viren im Serum nachzuweisen. Außerdem hilft diese Methode in der medizinischen Forschung bei der Suche nach krankheitsrelevanten Proteinen z. B. dem BSE-Erreger oder HIV. Auch Proteine wie die ERK, die gehäuft in Tumoren vorkommen, können über Western Blot quantifiziert und entartete Zellen hierdurch erkannt werden. Hiermit kann z. B. bestimmt werden, inwiefern sich bestimmte Medikamente regulativ auf die vermehrte Expression solcher Proteine in der Zelle auswirken und somit eine regulative Wirkung auf das weitere Wachstum der Tumorzellen haben.

Einzelnachweise[Bearbeiten]

  1. Rajendrani Mukhopadhyay W. Neal Burnette: the man behind the Western Blot, ASBMB Today 2012
  2. Jaime Renart, Jakob Reiser, George E. Stark: Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure. In: Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. Bd. 76, Nr. 7, 1979, S. 3116–3120, PMID 91164, PMC 383774 (freier Volltext).
  3. Harry Towbin, Theophil Staehelin, Julian Gordon: Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. In: Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. Bd. 76, Nr. 9, 1979, S. 4350–4354, PMID 388439, PMC 411572 (freier Volltext).
  4. W. Neal Burnette: „Western blotting“: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. In: Analytical Biochemistry. Bd. 112, Nr. 2, 1981, S. 195–203, PMID 6266278, doi:10.1016/0003-2697(81)90281-5.
  5. Citation's Classic: W. Neal Burnette (PDF; 240 kB)
  6. Engelbert Buxbaum: Cationic electrophoresis and electrotransfer of membrane glycoproteins. In: Analytical Biochemistry. Bd. 314, Nr. 1, 2003, S. 70–76, PMID 12633604, doi:10.1016/S0003-2697(02)00639-5.
  7. Dianne T. Akin, Raymond Shapira, Joseph M. Kinkade Jr.: The determination of molecular weights of biologically active proteins by cetyltrimethylammonium bromide-polyacrylamide gel electrophoresis. In: Analytical Biochemistry. Bd. 145, Nr. 1, 1985, S. 170–176, PMID 4003759, doi:10.1016/0003-2697(85)90343-4.
  8. Joachim Hartinger, Katinka Stenius, Dagmar Högemann, Reinhard Jahn: 16-BAC/SDS-PAGE: a two-dimensional gel electrophoresis system suitable for the separation of integral membrane Proteins. In: Analytical Biochemistry. Bd. 240, Nr. 1, 1996, S. 126–133, PMID 8811889, doi:10.1006/abio.1996.0339.
  9. Hiroyuki Tanaka, Noriko Fukuda, Yukihiro Shoyama: Eastern blotting and immunoaffinity concentration using monoclonal antibody for ginseng saponins in the field of traditional chinese medicines. In: Journal of Agricultural and Food Chemistry. Bd. 55, Nr. 10, S. 3783–3787, PMID 17455950, doi:10.1021/jf063457m.
  10. Isabel Romero-Calvo, Borja Ocon, Patricia Martinez-Moya, Maria D. Suarez et al.: Reversible Ponceau staining as a loading control alternative to actin in Western blots. In: Analytical Biochemistry. Bd. 401, 2010, S. 318–320, PMID 20206115.
  11. Fabrizio Gentile, Ernesto Bali, Giuseppe Pignalosa: Sensitivity and applications of the nondenaturing staining of proteins on polyvinylidene difluoride membranes with Amido black 10B in water followed by destaining in water. In: Analytical Biochemistry. Bd. 245, 1997, S. 260–262, PMID 9056225
  12. Charlotte Welinder, Lars Ekblad: Coomassie staining as loading control in Western blot analysis. In: Journal of Proteome Research Bd. 10, 2011, S. 1416-1419, PMID 21186791.
  13. Carol L. Ladner,Jing Yang, Raymond J. Turner, Robert A. Edwards: Visible fluorescent detection of proteins in polyacrylamide gels without staining. In: Analytical Biochemistry Bd. 326, 2004, S. 13-20, PMID 14769330.
  14. Jennifer E. Gilda, Aldrin V. Gomes: Stain-Free total protein staining is a superior loading control to β-actin for Western blots. In: Analytical Biochemistry Bd. 440, 2013, S. 186-188, PMID 23747530.
  15. Christian P. Moritz, Sabrina X. Marz, Ralph Reiss, Thomas Schulenborg, Eckhard Friauf: Epicocconone staining: a powerful loading control for Western blots. In: Proteomics PMID 24339236.
  16. John W. Haycock: Polyvinylpyrrolidone as a blocking agent in immunochemical studies. In: Analytical Biochemistry. Bd. 208, Nr. 2, 1993, S. 397–399, PMID 8095775, doi:10.1006/abio.1993.1068.
  17. Klaus Klarskov, Stephen Naylor: India ink staining after sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis and in conjunction with Western blots for peptide mapping by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. In: Rapid Communications in Mass Spectrometry. Bd. 16, Nr. 1, 2002, ISSN 0951-4198, S. 35–42, PMID 11754245, doi:10.1002/rcm.522.

Literatur[Bearbeiten]

Weblinks[Bearbeiten]