Hellfeldmikroskopie

aus Wikipedia, der freien Enzyklopädie
(Weitergeleitet von Köhler-Beleuchtung)
Zur Navigation springen Zur Suche springen
Hellfeld-mikroskopische Aufnahme eines gefärbten Schnittes des Zuckerrohrs. Das gesamte mikroskopische Gesichtsfeld is hell beleuchtet.
Hellfeldmikroskopie an einem gefärbten Schnitt durch das Rhizom eines Adlerfarns. Hier ist ein Leitbündel zu sehen.

Als Hellfeldmikroskopie werden Mikroskopierverfahren bezeichnet, bei denen sich das zu beobachtende Objekt in einem hellen Feld befindet und dieses helle Feld das mikroskopische Bild ausleuchtet. Farbige und dunkle Strukturen im Präparat absorbieren das Licht, so dass ein entsprechendes Abbild des Präparats entsteht. Hellfeldmikroskopie ist das älteste mikroskopische Verfahren. Der Begriff wurde geprägt in Abgrenzung zu der im 19. Jahrhundert aufkommenden Dunkelfeldmikroskopie. Aus der Lichtmikroskopie kommend findet die Bezeichnung auch in der Transmissionselektronenmikroskopie Anwendung.

In der Lichtmikroskopie kann das helle Feld erzeugt werden, indem das Licht, meist durch einen Kondensor gebündelt, durch das Präparat hindurch in das Objektiv fällt. Diese Durchlicht-Hellfeldmikroskopie wird unter anderem für farbige biologisch-medizinische Präparate verwendet. Sie ist das mit Abstand am weitesten verbreitete Mikroskopierverfahren. Einfache Mikroskope wie Schülermikroskope arbeiten generell nach diesem Prinzip.

Alternativ kann die Beleuchtung aus der Richtung des Objektivs auf das Präparat fallen, durch das Objektiv selbst oder seitlich an diesem vorbei. Diese Auflicht-Hellfeldmikroskopie ist in den Materialwissenschaften verbreitet, wo lichtundurchlässige Präparate untersucht werden.

Bauweisen[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

Durchlicht und Auflicht[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

Das helle Feld in dem sich das Präparat befindet, kann durch Beleuchtung aus verschiedenen Richtungen erzeugt werden.
1. Beim heute als „typisches Mikroskop“ empfundenen Durchlicht-Hellfeldmikroskop erfolgt die Beleuchtung durch das Präparat hindurch, vom Objektiv aus gesehen von hinten (orange Pfeile in der Schemazeichnung). Es können also nur lichtdurchlässige Präparate untersucht werden.
Bei Auflicht-Mikroskopie wird das Präparat dagegen von der Seite des Objektivs beleuchtet. Es gibt es zwei Möglichkeiten.
2. Die Beleuchtung erfolgt durch das Objektiv selbst (hellblaue Pfeile). Dann befindet sich im Mikroskop im Lichtweg ein halbdurchlässiger Spiegel, der die Lichtquelle zum Präparat hin spiegelt, aber auch Licht vom Präparat zum Okular hin durchlässt (siehe Auflichtmikroskopie). Solche Hellfeldmikroskope werden für die Beobachtung von undurchsichtigen Materialien verwendet, wie etwa Mineralien.
3. Die Beleuchtung kann auch seitlich am Objektiv vorbei erfolgen (grüner Pfeil). Dieses Verfahren wird sehr häufig bei Stereomikroskopen eingesetzt.
Eine seitliche Beleuchtung (magenta-farbener Pfeil) wurde oder wird bei manchen Spezialverfahren verwendet (Spaltultramikroskop und Lichtscheibenmikroskopie), aber nicht für Hellfeldmikroskopie.

Einfache und zusammengesetzte Mikroskope[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

Ein Nachbau eines einfachen Mikroskops von van Leeuwenhoek. Rechts ist am Ende einer Raute eine Spitze zu sehen, auf die das Präparat montiert wurde. Darunter ist die Glaslinse in die Metallplatte eingelassen. Das Mikroskop wurde mit der Seite, die hier auf der Unterlage liegt, dicht vor das Auge gehalten.

Hellfeld-Mikroskopie kann „einfachen“ oder mit „zusammengesetzten“ Mikroskopen durchgeführt werden. Heutige Mikroskope sind typischerweise „zusammengesetzte Mikroskope“.

Einfache Mikroskope haben nur eine Glaslinse und funktionieren im Prinzip wie eine Lupe. Die Linse ist jedoch stärker gekrümmt und vergrößert dadurch stärker. Um die starke Krümmung der Linsenoberfläche zu ermöglichen, muss die Linse einen kleinen Durchmesser haben. Da der Brennpunkt nahe an der Linse liegt muss diese dicht vor das Auge gehalten werden. Ein einfaches Mikroskop besteht also aus einer Glaslinse und einer Halterung für diese. Die bekanntesten dürften jene von Antonie van Leeuwenhoek gebauten Geräte sein, mit denen ihm Ende des 17. Jahrhunderts zahlreiche wissenschaftliche Entdeckungen gelangen.

Zusammengesetzte Mikroskope bestehen aus mindestens zwei Linsen, einem Objektiv und einem Okular. In heutigen Mikroskopen bestehen Objektive und Okulare jedoch aus mehreren Linsen, um verschiedene optische Fehler auszugleichen. Hier ist etwa die chromatische Aberration zu nennen, die erst im 19. Jahrhundert durch Einführung neuer Glassorten begrenzt werden konnten. Da sich chromatische Fehler von Objektiv und Okular multiplizieren waren zusammengesetzte Mikroskope den einfachen Mikroskopen zuvor unterlegen.

Aufrechte und inverse Mikroskope[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

Inverses Mikroskop

Ein Mikroskop, bei dem sich das Objektiv oberhalb des Präparats befindet wird als aufrechtes Mikroskop bezeichnet. Bei Hellfeldmikroskopie kommt das Licht von unten zum Präparat, darüber ist das Objektiv, durch das das Licht nach oben zum Okular geht. Dies ist die häufigere Bauart.

Wird dieser Lichtweg umgekehrt, dann spricht man von einem inversen Mikroskop. Das Licht fällt hier von oben auf das Präparat, darunter befindet sich das Objektiv. Um ein bequemes Arbeiten zu ermöglichen wird das Licht dann umgelenkt, so dass in die Okulare von oben hineingeschaut werden kann (siehe Abbildung rechts). Inverse Mikroskope werden beispielsweise zur Beobachtung von Zellkultur-Zellen eingesetzt, da sich die Zellen am Boden des Kulturgefäßes aufhalten. Der Abstand von den Zellen zum Objektiv wäre bei einem aufrechten Mikroskop zu groß.

Beleuchtung bei Durchlicht-Hellfeldmikroskopen[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

Um das Gesichtsfeld hell auszuleuchten gibt es zwei verbreitete Beleuchtunsverfahren. Die kritische Beleuchtung ist die historisch ältere. Sie wird heute noch in manchen sehr einfachen Mikroskopen verwendet. Die von August Köhler entwickelte Köhler'sche Beleuchtung erlaubt eine gleichmäßigere Beleuchtung des Präparats. Sie ist heute Standard in Routine- und Forschungsmikroskopen. Durchlicht-Hellfeldmikroskopie mit Köhlerscher Beleuchtung ist der Ausgangspunkt für die Anwendung von speziellen lichtmikroskopischen Kontrastverfahren wie Phasenkontrast und Differentialinterferenzkontrast.

Kritische Beleuchtung[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

Bei der kritischen Beleuchtung wird ein verkleinertes Abbild der Lichtquelle in der Präparateebene erzeugt. Wenn als Lichtquelle eine Glühbirne verwendet wird, wird also der Glühwendel mit Hilfe des Kondensors in der Schärfeebene abgebildet. Dadurch ist sichergestellt, dass das Präparat mit der maximal möglichen Helligkeit beleuchtet wird. Die Brennweite eines Mikroskopkondensors ist meist ziemlich kurz. Um ein Bild der Lichtquelle in der Schärfeebene des Mikroskops erzeugen zu können muss erstens der Kondensor dicht am Präparat positioniert sein. Zweitens muss die Lichtquelle vergleichsweise weit vom Kondensor entfernt sein, so dass sie deutlich vor seiner vorderen Brennebene liegt. Um zu verhindern, dass das Bild des Glühwendels die Erkennung von Präparatstrukturen erschwert, wird ein Mattglas-Filter in den Beleuchtungstrahlengang gelegt, unterhalb des Kondensors. Sollte dies nicht ausreichend sein kann der Kondensor etwas abgesenkt werden, so dass das Bild des Glühwendels unscharf wird.[1]

Schema der kritischen Beleuchtung mit einer Glühlampe als Lichtquelle. Um mehr Licht der Lampe zu nutzen kann kurz nach ihr noch ein Kollektor (eine Sammellinse) eingebaut sein[2].

Wenn zur Beleuchtung keine Lampe, sondern ein Spiegel für Tageslicht eingesetzt wird, ist dieser meist auf einer Seite plan und auf der anderen Seite hohl. Der Hohlspiegel kann für Objektive mit geringer Vergrößerung eingesetzt werden, wenn der Kondensor entfernt wurde. Bei höheren Vergrößerungen muss die Beleuchtung auf einen kleineren Bereich des Präparats kondensiert werden. Dies geschieht mit dem Kondensor unter Verwendung des Planspiegels. Mit Tageslichtbeleuchtung kann es bei kritischer Beleuchtung zur Abbildung von Strukturen aus der Umgebung wie Fensterrahmen kommen. Auch hier hilft ein Mattglas-Filter unter dem Kondensor oder eine Kondensor-Absenkung.[1]

Köhlersche Beleuchtung [Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

August Köhler beschäftigte sich Ende des 19. Jahrhunderts mit der Mikrofotografie, also der Fotografie mit Hilfe eines Mikroskops. Bei direkter Beobachtung durch das Okular war die ungleichmäßige Helligkeit des Gesichtsfeldes bei kritischer Beleuchtung vergleichsweise wenig störend, da das Präparat je nach Bedarf hin und her verschoben werden konnte. Bei der Mikrofotografie führte eine ungleichmäßige Ausleuchtung jedoch zu einer schlechten Bildqualität. Er entwickelte daher ein Verfahren, das eine gleichmäßige Helligkeit bei gleich hoher Gesamthelligkeit erlaubte. Er veröffentlichte dieses Verfahren, das heute nach ihm benannt ist, 1893[3]. Der Vorgang des Einstellens der Köhlerschen Beleuchtung wird als köhlern bezeichnet.[1][2]

Köhlersche Beleuchtung hat neben einer gleichmäßigen Gesichtsfeldausleuchtung noch einen weiteren Vorteil: Nur der Bereich des Präparats, der tatsächlich beobachtet wird, wird beleuchtet. Dadurch wird störendes Streulicht, das in benachbarten Bereichen entstehen würde, vermieden. Bei dieser Beleuchtungsart wird ein Bild der Lichtquelle nicht in der Präparateebene erzeugt, sondern in der Ebene der Blende unterhalb des Kondensors bezeichnet. Diese wird als Kondensorblene oder Aperturblende bezeichnet. In der Präparateebene wird dagegen ein Bild der Leuchtfeldblende (auch: Feldblende) scharf abgebildet. Diese Blende befindet sich in der Nähe der Lichtquelle, in der Regel ist sie im Mikroskopfuß fest eingebaut. Das Bild in der Präparateebene wird scharfgestellt, indem der Kondensor auf oder ab bewegt wird. Köhlersche Beleuchtung ist nur mit einer künstlichen Lichtquelle möglich.[1][2]

Verschränkte Strahlengänge bei der Köhlerschen Beleuchtung. Siehe Haupttext für Erklärungen.

Ein geköhlertes Mikroskop hat zwei miteinander in Beziehung stehende, verflochtene Strahlengänge und jeder der beiden hat mehrere 'konjugierte Ebenen', das heißt was in einer der Ebenen scharf abgebildet ist, ist auch in den anderen konjugierten Ebenen scharf.

Der Abbildungsstrahlengang (in der Zeichnung unten) hat folgende konjugierte Ebenen (in der Zeichnung hellblau unterlegt): Leuchtfeldblende (A), Präparatebene (B), Zwischenbild (C), Retina des Beobachters (D). Um dies zu erreichen wird beim Vorgang des Köhlerns das Mikroskop zunächst auf zu beobachtende Strukturen im Präparat scharf gestellt, so dass diese im Zwischenbild und auf der Retina scharf sind. Dann wird die Leuchtfeldblende, die wie die Kondensorblende als Irisblende ausgeführt ist, zunächst zugezogen und der Kondensor wird in der Höhe so verstellt, dass der Leuchfeldblendenrand ebenfalls scharf abgebildet wird. Falls nötig kann der Kondensor anschließend zentriert werden, so dass das Bild der Öffnung der Leuchtfeldblende genau in der Mitte des Gesichtsfeldes liegt. Anschließend wird die Leuchtfeldblende gerade so weit geöffnet, dass ihr Rand eben nicht mehr sichtbar ist.
Der Beleuchtungsstrahlengang (in der Zeichnung oben) hat folgende konjugierten Ebenen (in der Zeichnung hellblau unterlegt): Lichtquelle (1), Kondensorblende (2), hintere Brennebene des Objektivs (3), Pupille des Beobachters (4).

Die Köhlersche Beleuchtung kann als eine kritische Beleuchtung angesehen werden, bei der die Lichtquelle die Öffnung der Leuchtfeldblende ist.[1][2]

Literatur[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

  • Dieter Gerlach: Das Lichtmikroskop. Eine Einführung in Funktion, Handhabung und Spezialverfahren für Mediziner und Biologen. 2. Auflage. Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1985, ISBN 3-13-530302-0.
  • Michael Volger (Hrsg.: Irene K. Lichtscheidl): Lichtmikroskopie online. Abgerufen im 22. Juli 2013 (Theoretische Einführung und Anleitung zur praktischen Anwendung an der Uni Wien. Auch als pdf-Datei verfügbar.).

Einzelnachweise[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

  1. a b c d e Dieter Gerlach: Das Lichtmikroskop. Eine Einführung in Funktion, Handhabung und Spezialverfahren für Mediziner und Biologen. Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1976, ISBN 3-13-530301-2, S. 64–71.
  2. a b c d Jörg Haus: Optische Mikroskopie Funktionsweise und Kontrastierverfahren. John Wiley & Sons, 2014, ISBN 978-3-527-41286-0, S. 17–21 (eingeschränkte Vorschau in der Google-Buchsuche).
  3. [[August Köhler (Optiker)|]]: Ein neues Beleuchtungsverfahren für mikrophotographische Zwecke. In: Zeitschrift für wissenschaftliche Mikroskopie. Band X., Nr. 4, 1893, S. 433–440 (online bei archive.org).