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Fluoreszenzmikroskopie

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Mikroskopische Aufnahmen eines Blattes des Mooses Plagiomnium undulatum. Oben Hellfeldmikroskopie, unten eine fluoreszenzmikroskopische Aufnahme. Die rote Autofluoreszenz der Chloroplasten ist gut zu erkennen.

Fluoreszenzmikroskopie ist eine spezielle Form der Lichtmikroskopie. Sie beruht auf dem physikalischen Effekt der Fluoreszenz. Wenn fluoreszierende Stoffe mit Licht bestimmter Wellenlängen angeregt werden, strahlen sie Licht anderer, längerer Wellenlängen ab (Stokes-Verschiebung). Das Abstrahlen wird als Emission bezeichnet. Bei der Fluoreszenzmikroskopie wird das erzeugte, vergrößerte Bild des untersuchten Objekts nur durch abgestrahltes (emitiertes) Licht erzeugt. Durch Farbfilter wird sichergestellt, dass das Anregungslicht blockiert wird. Fluoreszenzmikroskopische Bilder sind dann informativ, wenn nicht das ganze mikroskopische Präparat gleichmäßig fluoresziert, sondern wenn nur einige Strukturen leuchten. Diese Strukturen geben dann helle Signale vor dunklem Hintergrund.

Jedes fluoreszierende Molekül im Präparat kann dabei als neue Lichtquelle angesehen werden. Liegt die Intensität der von diesen Molekülen abgestrahlte Fluoreszenz über der Nachweisgrenze können auch Strukturen nachgewiesen werden, die weit kleiner sind als die Auflösungsgrenze eines Lichtmikroskops. In dieser Hinsicht besteht Ähnlichkeit zur Dunkelfeldmikroskopie.

Neben der klassischen Fluoreszenzmikroskopie gibt es einige weiterentwickelte mikroskopische Anwendungen, die Spezialformen der Fluoreszenzmikroskopie sind. Hierzu gehören die konfokale Laserscanningmikroskopie und die Multi-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie. Auch verschiedene Verfahren, die die Auflösung durch Umgehung des Abbe-Limits verbessern, sogenannte Höchstauflösungs- oder Superresolution-Verfahren sind fluoreszenzmikroskopischer Art[1].

Grundlagen[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

Fluoreszenz[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

Hauptartikel: Fluoreszenz
Jablonski-Diagramm, das die Energieniveaus veranschaulicht. Die Anregung hebt ein Elektron von einem der Grundzustände auf einen der angeregten Zustände. Bei der Fluoreszenzemission fällt es vom niedrigsten angeregten Zustand auf einen der Grundzustände.
Anregungs- (schwarz) und Emissionsspektrum (rot) von Fluorescein. Es wird am effektivsten mit Licht einer Wellenlänge von ca. 490 nm angeregt und strahlt am hellsten bei 520 nm.

Ein fluoreszierendes Molekül hat mindestens ein Elektron, dass durch Absorption eines Photons von einem energiearmen Grundzustand in einen energiereicheren angeregten Zustand übergehen kann. Der Energieunterschied zwischen den beiden Zuständen entspricht dabei genau dem Energiegehalt des absorbierten Photons. Fällt das Elektron auf einen Grundzustand zurück wird ein Photon ausgesendet. Diese Lichtemission wenige Nanosekunden nach der Absorption ist die Fluoreszenz. Damit sie zustande kommt muss zwischen dem Grundzustand und dem angeregten Zustand ein deutlicher Unterschied im Energiegehalt liegen und dazwischen dürfen keine weiteren Energieniveaus liegen, da angeregte Elektronen sonst über nichtstrahlende Prozesse in den Grundzustand zurück kehren.[2]

Sowohl der Grundzustand als auch der angeregte Zustand haben mehrere Unterzustände, so dass nicht nur Photonen mit genau einem bestimmten Energiegehalt absorbiert oder emittiert werden können, sondern auch Photonen mit ähnlichen Energiegehalten. Da sich der Energiegehalt eines Photons umgekehrt proportional zu seiner Wellenlänge verhält bedeutet das, dass ein fluoreszierender Stoff durch einige ähnliche Wellenlängen angeregt werden: Man spricht vom Anregungsspektrum. Genauso strahlt er einige ähnliche Wellenlängen ab, das Emissionsspektrum.[2]

Das Abstrahlen der Fluoreszenz geschieht grundsätzlich vom niedrigsten angeregten Energieniveau aus (Kasha-Regel). Wird das Elektron durch die Absorption des Anregungsphotons auf einen höheren angeregten Zustand gehoben, so gelangt es zunächst durch nichtstrahlende Energieabgabe auf das niedrigste angeregte Energieniveau, bevor es zur Emission eines Photons kommt. Dies hat für die Fluoreszenzmikroskopie mehrere wichtige Konsequenzen:[2]

  • Die emittierten Photonen sind im Mittel deutlich energieärmer und daher zum roten Ende des Lichtspektrums verschoben. Dieser Effekt wird als Stokes-Verschiebung bezeichnet. Der Energieunterschied verbleibt als Schwingungsenergie, also Wärme im Präparat.
  • Die Fluoreszenz eines Stoffes ist immer identisch, egal mit welcher Wellenlänge er angeregt wurde.
  • Die Zeitdauer von der Absorption über das Erreichen des niedrigsten angeregten Zustands bis zur Abgabe des Photons ist für einen fluoreszierenden Stoff charakteristisch. Sie wird als Fluoreszenzlebensdauer bezeichnet und ist die Grundlage der Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie.

Autofluoreszenz und Fluorochrome[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

Querschnitt durch die Sprossachse eines Sämlings der Gemeinen Fichte mit starker Autofluoreszenz.

Wenn ein Präparat von selbst fluoresziert wird dies als Autofluoreszenz, Eigenfluoreszenz oder Primärfluoreszenz bezeichnet. Viele Pflanzen haben in verschiedenen Teilen sehr starke Autofluoreszenz, zum Beispiel im Holz. Das Chlorophyll in den Chloroplasten ist stark rot fluoreszierend. Tierische Zellen fluoreszieren im Vergleich dazu nur schwach, jedoch noch stark genug um Fluoreszenzmarkierungen unter Umständen zu verschleiern. Die Hauptquellen hier sind Flavine, die in den Mitochondrien vorkommen, und Lipofuscin in den Lysosomen.[3] NADPH zeigt ebenfalls Autofluoreszenz[4].

Fluorophore sind Stoffe, die fluoreszieren. Fluorophore, die verwendet werden um Fluoreszenz in einem Präparat zu erzeugen sind Fluoreszenzfarbstoffe oder Fluorochrome. Eine in einem Präparat künstlich erzeugte Fluoreszenz ist eine Sekundärfluoreszenz. Der Prozess, der dazu führt heißt Fluoreszenzmarkierung.

Gute Fluorochrome vereinigen mehrere Eigenschaften: Sie haben absorbieren viele Photonen, das heißt sie haben einen hohen Absorptionskoeffizienten. Nur ein kleiner Anteil der absorbierten Photonen führt nicht zur Emission eines Flureszenzphotons (hohe Quanteneffizienz). Beides zusammen führt zu einer großen Helligkeit. Fluorochrome sollten ein geringes Bleichen aufweisen, das heißt dass sie sich oft anregen lassen, ohne zerstört zu werden. Außerdem sollten Fluorochrome in einem möglichst schmalen Bereich des Lichtspektrums fluoreszieren, damit möglichst viele Fluorochrome mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarben gleichzeitig verwendet werden können um unterschiedliche Strukturen anzufärben.[2]

Farbkanäle[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

Markierung von menschlichen Chromosomen in einem Zellkern mit sieben verschiedenen Fluorochromen.

Wenn sich die Anregungs- und Emissionsspektren zweier Fluorochrome stark überlappen, dann können diese nicht voneinander unterschieden werden. Beispielsweise haben Fluorescein, Grün fluoreszierendes Protein, Spectrum Green und eine Reihe weiterer kommerziell erhältlicher Farbstoffe sehr ähnliche Spektren, so dass sie anhand Ihrer Fluoreszenzfarbe nicht unterschieden werden können. Typischerweise regt UV-Licht blau fluoreszierende Fluorochrome an, blaues Licht grüne Fluorochrome und grünes Licht rote Fluorochrome. Diese drei Farbkanäle lassen sich also gleichzeitig verwenden, um unterschiedliche Strukturen darzustellen.

Damit ist die Zahl der gleichzeitig nachweisbaren Farben jedoch nicht erschöpft. Acht verschiedene Fluorochrome wurden bereits eingesetzt. DAPI als Gegenfärbung für DNA, fluoresziert blau, außerdem sieben Farbstoffe, die an Sonden für Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung gekoppelt wurden: Diethylaminocoumarin (Deac), Spectrum Green und die Cyanin-Farbstoffe, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5 und Cy7.[5][6] Die meisten Fluoreszenzmikrsokope haben drei bis fünf Farbkanäle.

Aufbau von Fluoreszenzmikroskopen[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

Bei der ‚normalen‘ Lichtmikroskopie, der Durchlicht-Hellfeldmikroskopie, wird das Bild durch Licht erzeugt, welches das Präparat durchstrahlt. Dies ist bei der Fluoreszenzmikroskopie nicht der Fall. Hier wird das Bild durch Fluoreszenzlicht erzeugt, das erst im Präparat entsteht. Das Anregungslicht, das das Präparat bestrahlt wird dagegen durch spezielle Filter von der Bilderzeugung ausgeschlossen. Da sich Fluoreszenzlicht unter normalen Bedingungen gleichmäßig in allen Raumrichtungen ausbreitet, ist es daher grundsätzlich egal, ob das Anregungslicht von oben, von unten, oder von der Seite kommt. Tatsächlich wurden alle drei Varianten gebaut.

Zu Beginn der Fluoreszenzmikroskopie, in der ersten Hälfte des 20. Jahrhunderts, wurden Durchlicht-Fluoreszenzmikroskope gebaut. Sie sind heute nur noch von historischem Interesse (siehe Abschnitt Geschichte unten). Durch die Verfügbarkeit Dichroitischer Spiegel (auch: dichroitischer Strahlteiler) wurde es ab etwa 1970 möglich Auflicht-Fluoreszenzmikroskope zu bauen, bei denen das Anregungslicht über das Objektiv in das Präparat eingestrahlt wird. Sie werden auch Epifluoreszenzmikroskope genannt, nach griechisch έπί für ‚auf‘. Seit Ende des 20. Jahrhunderts wird dieser Bautyp fast ausschließlich verwendet. Die seitliche Beleuchtung findet bei einem spezialisierten Fluoreszenzmikroskop Anwendung, dem Lichtscheibenmikroskop (siehe unten).

Das Epifluoreszenzmikroskop: das typische Fluoreszenzmikroskop[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

Im Vergleich zu Durchlicht-Hellfeldmikroskopen haben Epifluoreszenzmikroskope eine zusätzliche Auflicht-Beleuchtungsachse für das Fluoreszenz-Anregungslicht. Das zu beobachtende Objekt wird durch das Objektiv beleuchtet. Die Zahlen beziehen sich auf die Schemazeichnung.

  1. Durch einen passend ausgewählten optischen Filter, den Anregungsfilter, wird von der verwendeten Lampe nur der Teil des erzeugten Lichts durchgelassen, der die für die Anregung des Fluoreszenzfarbstoffes notwendige Wellenlängen enthält. Der Bereich des Spektrums, in welchem der Fluoreszenzfarbstoff leuchtet, darf vom Anregungsfilter nicht durchgelassen werden.
  2. Ein Strahlteiler spiegelt das Anregungslicht zum Objektiv, worauf im Präparat die Fluoreszenz entsteht. Das Objektiv ist also zugleich auch der Kondensor. Die Fluoreszenz ist längerwelliger als das Anregungslicht.
  3. Der Anteil des Fluoreszenzlichts, der vom Objektiv gesammelt wird, gelangt wiederum zum Strahlteiler. Durch dessen besondere Eigenschaften wird dieses längerwellige Licht in Richtung Okular oder Detektor durchgelassen (und nicht gespiegelt). Anregungslicht, das im Präparat reflektiert wird, wird dagegen weitgehend wieder zur Lampe gelenkt.
  4. Da Strahlteiler nicht ganz perfekt arbeiten, gelangt ein geringer Teil des im Präparat reflektierten Anregungslichts trotzdem Richtung Okular bzw. Detektor. Da die Intensität der Fluoreszenz im Vergleich zur Anregung sehr schwach ist, ist deshalb ein weiterer optischer Filter, genannt Sperrfilter oder Emissionsfilter, erforderlich, um dieses restliche Anregungslicht zu eliminieren.[1][2]

Die drei genannten Filter sind in heutigen Fluoreszenzmikroskopen oft in einen gemeinsamen Block eingebaut. Dieser befindet sich bei aufrechten Mikroskopen in der optischen Achse über dem Objektiv. Bei inversen Fluoreszenzmikroskopen befindet er sich entsprechend unter dem Objektiv. Bei Geräten mit Unendlich-Optik liegt er im Unendlichraum zwischen Objektiv und Tubuslinse.

Lichtquellen[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

Die Erzeugung der Fluoreszenz im Präparat ist kein effektiver Prozess: Nur ein Bruchteil des Anregungslichts wird von den Fluoreszenzfarbstoffen absorbiert. Um trotzdem helle, mit dem Auge sichtbare Signale erzeugen zu können, sind daher sehr hohe Leuchtstärken erforderlich.[2]

Typischerweise sind Fluoreszenzmikroskope mit Quecksilberdampflampen, Halogenmetalldampflampen, Xenon-Gasentladungslampen oder, seit dem 21. Jahrhundert, mit LED-Lampen ausgestattet. Die meisten Lichtquellen leuchten über das gesamte sichtbare Spektrum sowie im ultravioletten Bereich. Die für das jeweils zu untersuchende Fluorochrom erforderlichen Wellenlängen werden durch einen entsprechenden Filter ausgewählt und alle anderen unterdrückt.[2]

Filter[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

Filterwürfel für grüne Fluoreszenzfarbstoffe. Links unten Blick durch den Anregungsfilter, rechts unten durch den Emissionsfilter.
Schieber mit Filtern für drei Farbkanäle

Während früher Farbfilter aus gefärbtem Glas zum Einsatz kamen, werden heute oft Interferenzfilter verwendet. Interferenzfilter sind jedoch deutlich teurer, so dass gefärbtes Glas immer noch zur Anwendung kommt. Für Anregungs- und Emissionsfilter können beide Typen verwendet werden. Der dichroitische Strahlteiler kann nur als Interferenzfilter hergestellt werden.[2]

Interferenzfilter bestehen aus einer Glasscheibe, auf die mehrere dünne Materialschichten aufgetragen werden. Zwischen den Schichten entstehen Interferenzen, so dass bestimmte Wellenlängen durchgelassen werden, andere aber gespiegelt werden. Im Gegensatz zu farbigem Glas wird das Licht also nicht absorbiert. Durch die Wahl geeigneter Materialien und Schichtdicken können Filter für unterschiedliche Wellenlängen hergestellt werden. Licht, das in unterschiedlichen Winkeln auf Interferenzfilter auftrifft, legt unterschiedlich lange Strecken in den jeweiligen Schichten zurück. Daher ändern sich die Filtereigenschaften in Abhängigkeit vom Einfallswinkel des Lichts. Ein Interferenzfilter muss deswegen im vorgesehenen Winkel im Mikroskop eingebaut werden, um richtig zu funktionieren.[7]

Von der Funktionsweise her werden Kurzpass-, Langpass- und Bandpass-Filter unterschieden. Kurzpassfilter lassen Licht bis zu einer bestimmten Wellenlänge durch. Ein KP480 würde also Licht bis zu 480 nm durch lassen und Licht längerer Wellenlängen blockieren. Im Gegensatz dazu lassen Langpass-Filter Licht ab einer bestimmten Wellenlänge durch, ein LP520 also Licht mit Wellenlängen länger als 520 nm. Bandpass-Filter lassen nur einen bestimmten Abschnitt des Spektrums durch. Ein Bandpassfilter mit der Bezeichnung 525/50 lässt ein spektrales Fenster von 50 nm passieren, dessen Mitte bei 525 nm liegt, also ein Fenster von 500-550 nm. Die Eigenschaften eines Filters werden meist nur auf den sichtbaren Bereich und direkt angrenzende spektrale Bereiche bezogen. Es kann daher sein, dass zum Beispiel ein Bandpassfilter für den sichtbaren Bereich im Infrarot wieder durchlässig wird. Dies kann bei Zwei-Photonen-Fluoreszenzanregung (siehe unten) zu Problemen führen.[7]

Mit Interferenzfiltern lassen sich auch komplexere spektrale Eigenschaften realisieren. Beispielsweise kann ein Filter mehrere spektrale Fenster durchlassen, die Bereiche dazwischen aber blockieren (Multi-Bandpass). Auch dichroitische Strahlteiler, die mehrere spektrale Bereiche spiegeln und dazwischen liegende Bereiche durchlassen sind machbar (Multi-Dichroic). Dadurch wird es möglich, mehrere Fluoreszenzkanäle gleichzeitig zu sehen. Manche Lichtquellen können sehr schnell zwischen verschiedenen Anregunswellenlängen hin und her schalten, zum Beispiel einige LED-Geräte. Unter Verwendung eines Multi-Dichroics und eines Multi-Bandpassfilters als Emissionsfilter können verschiedene Fluoreszenzkanäle sehr schnell abwechselnd verwendet werden, da keine Filter ausgetauscht werden müssen.[2]

In klassischen Fluoreszenzmikroskopen sind Anregungsfilter, Strahlteiler und Emissionsfilter meist zu Filterblöcken zusammengefasst. Von einem Kanal zum anderen werden dabei alle drei Filter gemeinsam ausgetauscht, indem man entweder einen Schieber verschiebt, in dem Kombinationen für drei bis vier Farben enthalten sind, oder indem ein Rad gedreht wird, auf dem mehrere Filterwürfel für jeweils einen Kanal montiert sind.

In manchen Laserscanningmikroskopen, die mit Fluoreszenz funktionieren, wird die Funktion von Anregungsfiltern oder Strahlteilern durch Akustooptische Modulatoren (AOM, auch: acousto-optical tunable filter (AOTF) oder acousto-optical beam splitter (AOBS)) ersetzt. Der Emissionsfilter kann ersetzt werden, in dem das Fluoreszenzlicht, das in diesen Geräten nur von einem Punkt kommt, vor der Detektion spektral aufgetrennt wird und dann nur gewünschte Teile des Spektrums detektiert werden.[8]

Detektoren[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

Präparate mit heller Fluoreszenz im für das menschliche Auge gut sichtbaren Bereich bis etwa 620 nm Wellenlänge können direkt durch das Okular betrachtet werden. Zur Dokumententation werden Kameras verwendet. Während früher Fotografischer Film verwendet wurde, fand Ende des 20. Jahrhunderts eine Umstellung auf elektronische Kameras statt. Häufig werden CCD-Kameras verwendet, die Schwarzweißbilder aufnehmen. Durch den Verzicht auf Farbfilter in der Kamera können alle Pixel jede Farbe aufnehmen, das Bild wird heller als es bei Farbkameras der Fall wäre. Welche Farbe von der Kamera tatsächlich aufgenommen wird, wird durch den vorgeschalteten Emissionsfilter festgelegt. Verschiedenfarbige Fluoreszenzfarbstoffe in einem Präparat werden nacheinander aufgenommen und können im Computer übereinander gelegt werden. Dabei kann einem jeweiligen Farbstoff seine natürliche Farbe zugeordnet werden, oder auch eine andere, etwa um Farben besser zu kontrastieren.[9]

Ausbleichen der Fluoreszenz[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

Ein Molekül im angeregten Zustand kann nicht nur durch Fluoreszenz wieder in den Grundzustand übergehen. Eine Möglichkeit ist die Innere Umwandlung, bei der die Energie beim Übergang in den Grundzustand in Wärme umgewandelt wird. Eine weitere, bei der es zur Zerstörung des Farbstoffs kommen kann, hängt mit den Spin-Zuständen der Elektronen zusammen.

Die Elektronen eines Fluorochroms befinden sich normalerweise in einem Singulett-Zustand, in dem alle Elektronen des Moleküls Spin-gepaart sind. Daher wird der Grundzustand auch als S0, der 'normale' angeregte Zustand als S1 bezeichnet. Außer S1 gibt es noch weitere, energiereichere angeregte Zustände, die als S2, S3 und so weiter bezeichnet werden. Durch ein energiereiches Photon kann ein Molekül aus dem Grundzustand auch in einen dieser Zustände befördert werden. Das Anregungsspektrum zeigt dann bei der Wellenlänge mit dem entsprechenden Energiegehalt ein lokales Maximum. Das Fluoreszenzspektrum bleibt aber gleich, da das Fluoreszenz-Photon immer vom niedrigsten angeregten Zustand ausgesandt wird (siehe auch oben).[2]

Neben den Singulett-Zuständen kommen auch Triplett-Zustände vor. Der Übergang von einem Singulett- in einen Triplett-Zustand wird als Intersystem Crossing bezeichnet. Um einen solchen zu erreichen, muss sich der Spin eines Elektrons umdrehen, so dass dann ein ungepaartes Set von Elektronenspins vorliegt. Die Wahrscheinlichkeit hierfür ist normalerweise gering, aber deutlich höher, wenn sich das Molekül in einem der höheren angeregten Zustände befindet. Um die Wahrscheinlichkeit für einen Übergang zu den Triplett-Zuständen zu minimieren, sollte die Anregung in S2 oder höher nach Möglichkeit vermieden werden, denn aus Triplett-Zuständen kann keine Fluoreszenz entstehen, und diese Zustände sind langlebig.[2]

Aus dem Triplett-Zustand kann das Elektron seine Energie entweder als Wärme abgeben, um wieder in den Grundzustand zu gelangen, oder es gibt ein Photon ab. Dieses Photon entsteht deutlich länger nach der Anregung als Fluoreszenz, es handelt sich um Phosphoreszenz. Aus dem Triplett-Zustand heraus kann das Fluorochrom aber auch zerstört werden, man spricht dann von Ausbleichen. Im Gegensatz zu den angeregten Singulett-Zuständen ist die Verweildauer im Triplett-Zustand deutlich länger, daher ergibt sich hier eher die Möglichkeit mit anderen Molekülen der Umgebung chemisch zu reagieren.[2]

Hat der Fluoreszenzfarbstoff chemisch reagiert, ist das Reaktionsprodukt in der Regel nicht fluoreszierend und der Farbstoff ist ausgebleicht. Von besonderer Bedeutung ist die Reaktion mit molekularem Sauerstoff, O2, da dieser einen Triplett-Grundzustand hat und Triplett-Triplett-Reaktionen sehr effektiv ablaufen. Bleichen kann daher reduziert werden, wenn Sauerstoff aus dem Präparat entfernt wird. Dies kann durch sogenannte Antifade-Substanzen (englisch für Antibleichmittel) erreicht werden, die reduzierende Wirkung haben. Zum Einsatz kommen Antioxidantien, zum Beispiel para-Phenylamin-Diamin, DABCO oder Gallate.[2]

Ganz lässt sich das Bleichen jedoch nicht verhindert, daher ist es wichtig, für die Fluoreszenzmarkierung Fuorochrome auszuwählen, die möglichst stabil sind.

Spezielle fluoreszenzmikroskopische Verfahren[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

Lichtscheibenmikroskopie[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

Hauptartikel: Lichtscheibenmikroskopie

Bei der Lichtscheibenmikroskopie (englisch light sheet microscopy. Auch: Lichtblattmikroskopie oder Single Plane Illumination Microscopy, SPIM) wird das Anregungslicht von der Seite als Lichtscheibe bzw. Lichtblatt eingestrahlt. Dieses kann durch ein zweites Objektiv hindurch geschehen, das senkrecht zum Beobachtungsobjektiv steht und eine eng begrenzte Schicht der Probe ausleuchtet. Nur in dieser ausgeleuchteten Scheibe wird Fluoreszenz erzeugt und diese Ebene wird im Beobachtungsobjektiv scharf gestellt. In anderen Ebenen wird also keine unscharfe Hintergrundfluoreszenz erzeugt, die bei normaler Fluoreszenzmikroskopie zu einer Verminderung des Kontrasts führt. Das Verfahren erlaubt es, die axiale Auflösung eines normalen Fluoreszenzmikroskops zu verbessern, wenn das Lichtblatt dünner als die Schärfentiefe des Mikroskops ist. Die seitliche Beleuchtung des Untersuchungsobjekts ähnelt der Anordnung im Spaltultramikroskop.[10]

Konfokale und Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

Ein konfokales Bild (links) zeigt deutlich weniger Hintergrund-Fluoreszenz aus Ebenen über und unter der Schärfeebene als ein nicht-konfokales Bild des gleichen Objekts.

Bei konfokalen wie bei Zwei-Photonen-Mikroskopen wird das Präparat abgerastert: Das Anregungslicht wird auf einen Punkt fokussiert, die Fluoreszenz von diesem Punkt gelangt zum Detektor. Der Punkt wird über das Präparat bewegt und die jeweils gemessenen Fluoreszenzintensitäten werden in einem Steuerungscomputer zu einem Bild zusammengesetzt.

Bei der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie entsteht im Beleuchtungskegel über und unter der Schärfeebene ebenfalls Fluoreszenz. Diese gelangt jedoch nicht zum Detektor, da sie von einer Lochblende (englisch Pinhole) in der Zwischenbild-Ebene blockiert wird. Durch das blockieren dieser Hintergrundfluoreszenz tritt das Signal in der Schärfeebene gegenüber dem Hintergrund deutlich kontrastreicher hervor als in der klassischen Fluoreszenz. Auf Grund dieser deutlich kontrastreicheren Bilder sind konfokale Mikroskope in der biologischen Forschung weit verbreitet.[11]

Ein Fluoreszenzfarbstoff kann statt durch Absorption eines Photons auch durch eine Zwei-Photonen-Absorption angeregt werden. Voraussetzung dafür ist, dass diese beiden Photonen quasi gleichzeitig am Fluoreszenzfarbstoff eintreffen, und das beide zusammen den richtigen Energiegehalt haben, um ein Elektron des Farbstoffes auf ein angeregtes Energieniveau zu heben. Beide Bedingungen sind erfüllt, wenn zur Anregung ein gepulster Laser verwendet wird, der, je nach anzuregendem Fluoreszenzfarbstoff, Wellenlängen zwischen 700 und 1200 nm erzeugt. Im Gegensatz zur Konfokalmikroskopie, wo das Auslesevolumen beschränkt wird, ist hier das Anregungsvolumen limitiert. Längerwelliges Licht hat eine höhere Eindringtiefe in biologische Gewebe, da es von diesen weniger stark absorbiert und auch weniger stark gestreut wird. Zwei-Photonen-Fluoreszenz-Mikroskopie wird daher eingesetzt, um tiefer in Gewebe einzudringen, als dies mit anderen Verfahren möglich ist. Zusammen mit Methoden, die nicht auf Fluoreszenz beruhen, wird dieses Verfahren als Multiphotonenmikroskopie oder Nicht-lineare Mikroskopie bezeichnet.[12]

Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

Mit FCS wird die Wanderungsgeschwindigkeit von fluoreszierenden Partikeln durch das Beobachtungsvolumen bestimmt.

Die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (abgekürzt FCS nach englisch fluorescence correlation spectroscopy) ist zwar eine fluoreszenzmikroskopische Methode, bei ihr wird jedoch kein Bild erzeugt. In einem Konfokalmikroskop wird der Anregungslaser nicht über das Präparat gerastert, sondern auf einer Stelle geparkt. Es wird somit ein sehr kleines Volumen über einen längeren Zeitraum beobachtet. Bewegen sich fluoreszierende Moleküle in dieses Volumen hinein oder hinaus, so ändert sich die gemessene Helligkeit. Anhand einer solchen Messreihe kann beispielsweise bestimmt werden, wie schnell Moleküle in einer Lösung diffundieren. Da die Diffusionsgeschwindigkeit unter anderem von der Größe abhängt, lässt sich beispielsweise untersuchen, ob ein fluoreszenzmarkiertes Protein an ein zweites, ebenfalls in der Lösung vorhandenes Protein bindet.[13]

Verfahren mit erhöhter Auflösung[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

Als Auflösung wird in der Mikroskopie der Abstand bezeichnet, den zwei Strukturen haben müssen, um als getrennte Strukturen wahr genommen zu werden. Ernst Abbe hat im 19. Jahrhundert als erster verstanden, dass diese Auflösung fundamental durch Beugung begrenzt ist. Diese Grenze wird daher als Abbe-Limit bezeichnet. Sie kann mit entsprechenden Formeln genau berechnet werden und liegt für gute Mikroskope bei Verwendung von Ölimmersion und in Abhängigkeit von der Wellenlänge bei etwa 200 nm.

Das Abbe-Limit galt lange als unüberwindbar. Ab der zweiten Hälfte wurden jedoch einige mikroskopische Verfahren entwickelt, deren Auflösung besser ist als vom Abbe-Limit vorhergesagt. Das mit Abstand älteste dieser Verfahren ist die Konfokalmikroskopie (siehe auch den Abschnitt Auflösung im Artikel Konfokalmikroskop.) Die theoretische Verbesserung liegt jedoch nur beim Faktor Wurzel von 2 = 1,44. Aus praktischen Gründen kann auch dieser nicht erreicht werden.

Funktionsschema der TIRF-Mikroskopie

In den 1980er Jahren wurde TIRF-Mikroskopie (englisch Total internal reflection fluorescence microscopy) vorgeschlagen. Mit ihr werden ausschließlich Fluoreszenzfarbstoffe im Präparat angeregt, die sich sehr nah am Deckglas befinden. Ist das Präparat, zum Beispiel lebende Zellen, in wässrigem Medium liegt die Eindringtiefe der Anregung bei 100-200  nm und ist damit deutlich geringer als nach den Beugungsgesetzen zu erwarten wäre. Dadurch ergibt sich ein deutlich höherer Kontrast, da nur wenig Material zur Fluoreszenz angeregt wird. Dies erreicht man, indem der Objektträger in einem Winkel bestrahlt wird, der groß genug ist, damit Totalreflexion auftritt. Da die Strahlung dennoch teilweise in den Objektträger eindringt, aber dabei gleichzeitig mit zunehmendem Weg immer stärker abgeschwächt wird (sog. evaneszente Welle), erreicht sie nur wenige Schichten fluoreszierenden Materials.[10]

Während „Auflösung“ per Definition den Mindestabstand zwischen zwei Strukturen bezeichnet, kann man die genaue Position eines Objekts sehr genau messen. Fluoreszenzmikroskopisch kann man daher das Abbe-Limit umgehen, wenn man die genaue Position von Objekten in verschiedenen Farbkanälen bestimmt und danach den Abstand zwischen diesen misst. Diese Technik wurde in den 1990er Jahren entwickelt und später als Spektrale Präzisions-Distanz-Mikroskopie (SPDM) bezeichnet. Zwar ließen sich mit ihr Abstände von kleinen fluoreszierenden Strukturen bis auf etwa 70 nm genau messen. Sie führt jedoch nicht zu einer generellen Auflösungverbesserung, da jeder der aufgenommenen Farbkanäle für sich der Beugung unterliegt.

Ende des letzten und Anfang dieses Jahrhunderts sind jedoch einige Methoden entwickelt worden, mit denen eine generelle Verbesserung möglich ist. Sie werden gemeinschaftlich im Englischen als Superresolution Microscopy, manchmal auch als Nanoscopy bezeichnet. Ihnen allen ist gemeinsam, dass sie auf Fluoreszenzmikroskopie beruhen. Drei dieser Verfahren haben eine gewisse Verbreitung erfahren und sind kommerziell erhältlich: STED, strukturierte Beleuchtung und Lokalisationsmikroskopie. Daneben gibt es weitere Verfahren, die sich nicht gegen die genannten behaupten konnten, oder die bisher nur von einzelnen Gruppen angewendet werden. Einige Verfahren werden auf Grund von gemeinsamen Eigenschaften als RESOLFT-Mikroskopie zusammengefasst.

Die hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie wurde von der Zeitschrift Nature Methods zur Methode des Jahres 2008 gekürt.[14] William Moerner, Eric Betzig und Stefan Hell erhielten 2014 den Nobelpreis für Chemie für die Entwicklung einiger dieser Methoden.

STED-Mikroskopie[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

Vergleich einer konfokalen (links) mit einer STED-Aufnahme von Vimentin-Fasern in einer Zelle.
Hauptartikel: STED-Mikroskop

Bei der STED-Mikroskopie (STED steht für englisch Stimulated Emission Depletion) wird die Beugungsgrenze deutlich überwunden. Der Anregung eines beugungsbegrenzten Volumens im Präparat folgt eine ringförmige Abregung durch Licht längerer Wellenlänge. Dabei fallen die angeregten Moleküle im Bereich der Abregung über stimulierte Emission wieder in den Grundzustand. Das Fluoreszenz emittierende Volumen verkleinert sich dadurch wesentlich und die Auflösung des Mikroskops erhöht sich.[15][10]

Strukturierte Beleuchtung[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

Vergleich der Auflösung von konfokaler (oben) und 3D-SIM-Mikroskopie (unten).
Hauptartikel: 3D-SIM-Mikroskop

Bei der strukturierten Beleuchtung oder 3D-SIM-Mikroskopie werden nicht alle Fluorochrome angeregt, sondern nur ein Teil des Präparats in Form einer bestimmten ‚Struktur‘, einem Streifenmuster. Bei der Überlagerung des bekannten Beleuchtungsmusters mit der unbekannten Fluorochrom-Verteilung im Präparat entstehen Moiré-Effekte, deren Größe über der Auflösungsgrenze liegt, selbst wenn die unbekannte Struktur kleiner ist. Durch Verschiebung und Verdrehung des Beleuchtungsmusters lässt sich durch die zusätzliche Information aus den Moiré-Mustern der jeweiligen Bilder durch Computerberechnung ein endgültiges Bild mit bis zu zweifach erhöhter Auflösung erzeugen.[16]

Lokalisationsmikroskopie[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

Als Lokalisationsmikroskopie (englisch localization microscopy) werden mikroskopische Verfahren zusammengefasst, die auf einem gemeinsamen Grundprinzip beruhen: Während bei klassischer Fluoreszenzmikroskopie alle Fluorochrome gleichzeitig angeregt werden, werden sie hier zeitlich nacheinander angeregt, so dass immer nur ein kleiner Teil von ihnen leuchtet. Von einer Schärfeebene werden viele Bilder hintereinander gemacht, oft über Tausend. In jedem dieser Bilder wird nun die genaue Position der jeweils leuchtenden Fluorochrome bestimmt und diese Position wird in das endgültige Bild übertragen. Die Verfahren unterscheiden sich in der Methode, wie die einzelnen Farbstoffmoleküle ein- und ausgeschaltet werden, also zum Blinken gebracht werden.

Die Photoactivated Localization Microscopy (PALM) beruht auf Varianten des Grün Fluoreszierenden Proteins, die sich mit Licht bestimmter Wellenlängen ein und ausschalten lassen. STORM und dSTORM verwenden geeignete Fluoreszenzfarbstoffe, die in bestimmten Pufferlösungen nur selten fluoreszieren. Ground State Depletion (GSD) beruht darauf, das sich die Mehrzahl der Fluorochrome in einem nicht fluoreszierenden Zustand befindet, der durch starke Lichtanregung erzeugt werden kann. DNA-Paint beruht auf einer vorübergehenden Bindung von kurzen, einsträngigen DNA-Molekülen an komplementäre Zielmoleküle.[10]

weitere Verfahren zur Auflösungsverbesserung[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

4Pi-Mikroskopie war die erste kommerziell verfügbare Superresolution-Technik, ist jedoch heute nicht mehr verfügbar.[10] Eine weitere Technik ist Vertico-SMI, die in Heidelberg entwickelt wurde.

Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

Nach der Anregung verbleibt ein fluoreszenter Stoff eine kurze Zeitspanne im angeregten Zustand, bevor er das Fluoreszenzlicht abstrahlt. Die Dauer dieser Zeitspanne variiert für einen konkreten Stoff in einem bestimmten Bereich, so dass eine mittlere Fluoreszenzlebensdauer für einen jeweiligen Stoff bestimmt werden kann. Sie liegt im Nanosekundenbereich, beispielsweise für Fluorescein bei 3,25 ns, für Texas Red bei 3,41 ns und für Eosin bei 1,1 ns. Wenn die Fluoreszenzanregung im mikroskopischen Präparat mit einem gepulsten Laser erfolgt und spezielle Detektoren verwendet werden, dann lässt sich die Zeitspanne messen, wie lange nach der Anregung die Fluoreszenz am Detektor eintrifft. Nicht nur durch ihre Farbe, sondern auch durch ihre Lebenszeit können daher Fluoreszenzfarbstoffe voneinander unterschieden werden. Dies wird in der Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie (englisch fluorescence lifetime imaging microscopy, FLIM) ausgenutzt.[17][18]

Präparateerstellung und Anwendungen in den Lebenswissenschaften[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

In den Biowissenschaften wird Fluoreszenzmikroskopie vielfältig eingesetzt. Manche zu untersuchende Objekte sind von selbst fluoreszierend. Dies wird als Autofluoreszenz bezeichnet. Beispielsweise haben Pflanzen Chlorophylle und andere Pigmente, die natürlicherweise fluoreszieren. Autofluoreszenz ist aber häufig unerwünscht, da sie als Hintergrundfluoreszenz das Erkennen von künstlichen Fluoreszenzen erschwert.

Für biomedizinische Anwendungen ist eine Vielzahl von Methoden für die Fluoreszenzmarkierung entwickelt worden. Manche Fluoreszenzfarbstoffe (Fluorochrome) binden auf Grund ihrer chemischen Eigenschaften direkt an die zu untersuchende Struktur. In diese Gruppe fallen beispielsweise DNA-Farbstoffe wie Dapi, Acridinorange und Hoechst 33342 oder Membranfarbstoffe wie Nilrot oder DiI. Einige solcher Farbstoffe können auch lebende Zellen anfärben.[19]

In anderen Fällen wird ein nicht-fluoreszierendes Molekül, das an die zu untersuchende Struktur bindet, chemisch mit einem Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt. Beispiele für diesen Ansatz sind die Immunfluoreszenz, bei der Fluoreszenz-markierte Antikörper verwendet werden, die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, eine Technik zum mikroskopischen Nachweis von größeren DNA-Abschnitten, oder die Färbung von Aktin mit fluoreszenzmarkiertem Phalloidin.[19]

Proteine können genetisch mit einem fluoreszierenden Protein wie GFP fusioniert werden. Aus dem fluoreszenzmikroskopischen Bild können anschließend Rückschlüsse auf die Verteilung und Anordnung des untersuchten Proteins in der lebenden oder fixierten Zelle gezogen werden, (z. B. im Kern, im Cytoplasma, membrangebunden oder nach außen exportiert) bzw. Zellbestandteile durch ihre spezifischen Proteine visualisiert werden (z. B. Cytoskelett durch Aktin, Mikrotubuli durch Tubulin). Auch Interaktionen von Proteinen untereinander sind beobachtbar. Fluoreszierende Proteine können auch unter Kontrolle eines Zelltyp-spezifischen Promotors exprimiert werden, um bestimmte Zelltypen zu identifizieren.[20]

Außerdem gibt es Sonden, deren Fluoreszenzverhalten sich in Abhängigkeit vom Zustand Ihrer Umgebung ändert. Calcium-abhängige Farbstoffe wie Aequorin, Fura-2, Furaptra, Calcein und Indo-1 können Schwankungen der Konzentration an Calciumionen in einer Zelle anzeigen. Mit spannungsabhängigen Farbstoffen oder den Reporterproteinen VSFP oder PROPS können Spannungsänderungen in einer Zelle dargestellt werden. Mit Redox-sensitiven Reporterproteinen wie roGFP, rxYFP oder HyPer können Redox-Potentiale verfolgt werden. Fluoreszierende pH-Indikatoren können unterschiedliche pH-Werte in einer Zelle sichtbar machen.[21]

Geschichte[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

Köhlers Entdeckung[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

Die ersten fluoreszenzmikroskopischen Beobachtungen waren zufällig und ein Ärgernis. August Köhler, Mitarbeiter beim Mikroskophersteller Carl Zeiss, wollte die lichtmikroskopische Auflösung steigern. Die Auflösung hängt von der Wellenlänge ab, daher baute er ein Mikroskop für UV-Licht um dessen kürzere Wellenlänge zu nutzen. Das damit erzeugte Bild war zwar für die Augen nicht sichtbar, konnte aber fotografisch aufgefangen werden. Er stellte dabei fest, dass

„das Objekt selbst unter dem Einfluß der es treffenden ultravioletten Strahlung fluoresziert. Eine derartige Fluoreszenz tritt aber bei der Mehrzahl der Präparate auf. ... Das Fluoreszenzlicht ... liegt jedenfalls zum Teil im sichtbaren Bereich des Spektrums;... Daß dadurch die Wahrnehmung des durch die ulravioletten Strahlen erzeugten Bildes, auf die es eigentlich ankommt, erschwert, wenn nicht gar unmöglich gemacht wird, liegt auf der Hand. ... Unter Umständen könnte selbstverständlich auch die Beobachtung dieses direkten Bildes Interesse bieten ...“

August Köhler: Mikrophotographische Untersuchungen mit ultraviolettem Licht. 1904. Zeitschrift für Wissenschaftliche Mikroskopie 21:128-165 und 273-304.[22]

Bereits früh war Köhler also bewusst, dass die bei der UV-Mikroskopie störende Fluoreszenz auch nützliche Anwendungen ermöglichen könnte.

Erste Fluoreszenzmikroskope und Anwendungen[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

Zeitgenössische Darstellung des ersten Fluoreszenzmikroskops der Firma Reichert. Links die große Beleuchtungseinrichtung, rechts das eigentliche Mikroskop. Dazwischen eine Quarzlinse mit 70 mm Durchmesser und 150 mm Brennweite sowie die Filterküvette.

Das erste kommerziell erhältliche Fluoreszenzmikroskop wurde von Oskar Heimstädt entwickelt, der beim Wiener Mikroskopbauer Karl Reichert das Rechen- und Konstruktionsbüro leitete. Es wurde von Reichert persönlich 1911 auf der Versammlung der Deutschen Naturforscher und Ärzte vorgestellt. Im gleichen Jahr veröffentlichte Heimstädt eine Arbeit mit dem Titel „Das Fluoreszenzmikroskop“ in der Zeitschrift für wissenschaftliche Mikroskopie.[22][23]

UV-Licht war für die Fluoreszenzanregung gut geeignet, da es für das Auge nicht sichtbar und somit kein Sperrfilter erforderlich war. Eine gute Anregung erforderte, dass von der Lichtquelle kein sichtbares, aber möglichst viel UV-Licht zum Präparat gelangte. Ein geeigneter Anregungsfilter wurde kurz zuvor, 1910, von Hans Lehmann bei Zeiss entwickelt. Er bestand aus einer Filterküvette, die entlang der optischen Achse aus zwei Kammern bestand. Die drei Wände waren aus Jenaer Blau-Uviolglas, eine Kammer wurde mit gesättigter Kupfersulfat-Lösung, die andere mit verdünnter Nitrosodimethylanilin-Lösung gefüllt. Das so erzeugte Anregungslicht wurde als „gefiltertes Ultraviolett“ bezeichnet[24]. Da normales Glas UV-Licht absorbiert wurde wenig später ein Kondensor aus Quarz eingesetzt um hohe Beleuchtungsstärken zu erhalten. Es entstand jedoch ein neues Problem: Die Glaslinsen im Objektiv fingen an zu fluoreszieren. Daher setzte Lehmann einen Dunkelfeldkondensor ein: So wurde das Anregungslicht am Objektiv vorbei geleitet und auch Reste von sichtbarem Licht aus der Lichtquelle im mikroskopischen Bild wurden vermieden.[22][23]

Über die Möglichkeiten und Zukunftsaussichten der Fluoreszenzmikroskopie schrieb Heimstädt

„Es ist z.B. ein leichtes, die Anwesenheit sehr kleiner Mengen von Mutterkorn im Mehl ... festzustellen, da Stärke intensiv violett fluoresziert, während Mutterkorn ein gelblich weißes Licht aussendet. ...
Ob und wie weit das Fluoreszenzmikroskop ... eine Möglichkeit der Erweiterung des mikroskopischen Abbildungsgebietes in sich [schließt], muss die Zukunft lehren.“

Oskar Heimstädt: Das Fluoreszenzmikroskop, 1911.[23]

Ebenfalls 1911 wurde von Michail Tswett die Fluoreszenz der Chloroplasten beschrieben.[25] Stanislaus von Prowazek veröffentlichte 1913 die erste Arbeit, in der mit Fluoreszenzfarbstoffen gearbeitet wurde, namentlich mit Eosin und Neutralrot.[26]

Ein Jahr nach dem Reichert'schen Fluoreszenzmikroskop wurde auf der Versammlung deutscher Naturforscher und Ärzte 1912 das von Lehmann entwickelte Zeiss'sche „Lumineszenzmikroskop“ vorgestellt. Eine Dunkelfeld-Beleuchtung führt zu einer verringerten Numerischen Apertur und somit zu einer verringerten Auflösung. Daher setzte Lehmann auf eine normale Hellfeldbeleuchtung mit UV-Licht. Um zu verhindern, dass UV-Licht ins Auge drang setze er auf einen UV-blockierenden Glasfilter aus Euphosglas, der als Deckglas verwendet wurde. Der Filter musste zwischen Präparat und Objektiv liegen, um Fluoreszenzanregung im Objektiv zu vermeiden, daher war keine andere Position für den Filter möglich. Der Kondensor hatte Quarz-Linsen, die verwendeten Objektträger waren aus Bergkristall, um UV-Durchlässigkeit zu gewährleisten. Die empfohlene Standardvergrößerung lag bei 62x (inklusive Okularvergrößerung), 300x sollte nicht überschritten werden. Die Fluoreszenz-Zusatzaustattung, also ohne das eigentliche Mikroskop kostete mit der billigsten Anregungslichtquelle, eine von Hand regulierbare Bogenlampe, etwa 500 Mark. Hinzu kamen 4,50 für einen 0,5 mm Dicken 30x25 mm Bergkristall-Objektträger und 1 Mark pro Euphosglas-Deckglas. Neben Schwarzweiß-Fotografien konnten auch Farbbilder mit dem Autochromverfahren erstellt werden.[22]

Max Haitinger und die Fluorochromierung[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

Abbildung aus Haitinger, 1938. „Wurzelspitze von Allium cepa, längs, mit Coriphosphin O; ... 10 Minuten Belichtungszeit, scharfe Differenzierung zwischen Kern und Protoplasma“.

In der Anfangszeit der Fluoreszenzmikroskopie wurden fast ausschließlich autofluoreszente Objekte betrachtet. Auch Max Haitinger, zunächst Privatforscher in Weidling bei Wien, später an der Universität Wien, begann mit der Untersuchung der Fluoreszenz von Wein und Obstweinen. Ab 1933 entwickelte er jedoch Fluoreszenzfärbungen, die er als „Fluorochromierungen“ bezeichnete. Von ihm stammen die Begriffe Sekundärfluorszenz für zu erzeugende Signale und Primärfluoreszenz für im Präparat von selbst vorhandene. Auch die Bezeichnung Fluorochrom für einen Fluoreszenzfarbstoff wurde von ihm eingeführt. Als Fluorochrome setzte er erst Pflanzenextrakte ein und später eine Reihe von Chemikalien. Dadurch gelang es ihm, Dünnschnitte von tierischen und menschlichen Geweben anzufärben, so dass sich auch Histologen für die Fluoreszenzmikroskopie zu interessieren begannen. Da nur sehr geringe Konzentrationen der Fluorochrome benötigt wurden, waren auch Lebendfärbungen möglich, die hauptsächlich in der Botanik angewendet wurden. Mit Auramin O gelang die Färbung von Tuberkulose-Bakterien. Auch Mehrfachfärbungen waren möglich. Eine erste Abhandlung veröffentlichte Haitinger 1934, sein Buch „Fluorescenzmikrosokopie-Ihre Anwendung in der Histologie und Chemie“ erschien 1938.[22][24][27]

Haitinger arbeitete eng mit der Firma Reichert zusammen, um deren Fluoreszenzmikroskop zu verbessern. Das neue Modell „Kam F“ wurde ab 1931 verkauft. Auch dieses hatte eine Bogenlampe mit Eisenelektroden als Lichtquelle, da diese einen vergleichsweise hohen UV-Anteil zwischen 300 und 400 nm hat. Trotzdem benötigte er bis zu 20 Minuten Belichtungszeit für seine Fotografien. Für schwache Vergrößerungen nennt er Belichtungszeiten mit Kohlebogenlampen von 1-10 Minuten. Die Nitrosyldimethylanilin-Lösung in der Anregungsfilter-Küvette konnte durch Nickeloxid-haltige Schwarzglasfilter ersetzt werden. Die Kupfersulfat-Lösung, die den verbleibenden Rotanteil im Anregungslicht filterte, wurde erst Anfang der 1940er Jahre durch blaue Glasfilter ersetzt. Die Beleuchtung erfolgte durch einen Hellfeldkondensor mit normalem Glas; es hatte sich gezeigt, dass Quarzglas hierfür nicht erforderlich ist. Zum Blockieren von verbleibendem Anregungslicht wurde auf das Okular ein Sperrfilter aus 1 mm dickem gelben Glas oder, falls ein farbloser Sperrfilter benötigt wurde, eine Küvette mit einer 5 mm dicken Schicht Natriumnitrit-Lösung. Deckgläser aus Euphosglas waren dank des gelben Sperrfilters nicht mehr nötig, auch zeigte sich, dass normale Objektträger geeignet waren. Dadurch sanken die laufenden Kosten erheblich.[22][27]

Der Strahlengang im Epilum von Reichert verlief wie in dieser Schemazeichnung. (1) Einfallendes Licht. (2) Ringspiegel mit hoher UV-Reflexion. (3) an dieser Stelle war ein Ringkondensor (nicht eingezeichnet) um das Licht auf das Objekt (4) zu leiten. Der Fluoreszenzlicht-Strahlengang (5) verlief durch das Objektiv Richtung Okular.[27]

In seinem Buch von 1938 beschreibt Haitinger auch Auflicht-Beleuchtungen für die Fluoreszenzmikroskopie von undurchsichtigen Gegenständen (Epikondensor von Zeiss-Jena, Epilum der Optischen Werke C. Reichert-Wien (siehe Schemazeichnung), Ultropak von E. Leitz-Wetzlar und Univertor von E. Busch-Rathenow). Sie sind jedoch nicht mit heutiger Auflichfluoreszenzanregung mit Hilfe eines dichroitischen Strahlteilers vergleichbar. Als Anwendungsbeispiele nennt er die Untersuchung von Nahrungsmitteln, Drogen und Farbstoffen sowie Erstuntersuchungen von Präparaten, von denen Dünnschliffe hergestellt werden sollen. Als „ganz besonders wertvoll“ bezeichnet er Auflichtbeleuchtungen für Studien am lebenden Tier.[27]

Um 1940 brachte Osram Quecksilberhöchstdrucklampen auf den Markt, für die bald bei Zeiss und unter Mitentwicklung von Haitinger bei Reichert (Lux UV und Lux UW) Beleuchtungseinrichtungen ins Programm genommen wurden. Neben der wesentlich vereinfachten Handhabung und einer größeren Helligkeit gaben diese Lampen nicht nur einzelne Linien ab, sondern ein kontinuierliches Spektrum, mit der sich alle fluoreszierenden Stoffe anregen ließen. Auch produzierten sie keine unangenehmen Dämpfe wie Eisenbogenlampen. Vergleichbare Lampen sind auch heute noch in Betrieb.[22][24][28]

Die 1940er Jahre[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

In den 1940er Jahren begann sich Farbdiafilm zur Dokumentation durchzusetzen. Trotz aller Fortschritte konnten Belichtungszeiten noch im zweistelligen Minutenbereich liegen.[22]

Siegfried Strugger stellte fest, dass manche bekannten herkömmlichen Farbstoffe auch fluoreszieren, so etwa Neutralrot und Rhodamin B. Auch Acridinorange führte er in die Fluoreszenzmikroskopie ein. In seinem Buch von 1949 beschreibt er detailliert die Möglichkeiten der Fluoreszenzanregung mit blauem Licht. Strugger nutzte Auflichtbeleuchtung, um den Fluss von Wasser in Pflanzen zu verfolgen.[22]

Ein Durchbruch für die Fluoreszenzmikroskopie war die Einführung der Immunfluoreszenz. 1942 veröffentlichten Albert Hewett Coons und Kollegen die Kopplung von Fluorescein-Isocyanat an Antikörper. Mit seiner hellen grünen Fluoreszenz hob sich dieses Flurochrom besser von der bläulichen Autofluoreszenz vieler Gewebe ab, als das zuvor probierte Anthracen-Isocyanat. Die Antikörper waren gegen Pneumokokken gerichtet, die so in Mausgeweben fluoreszenzmikroskopisch nachgewiesen werden konnten.[29] Die Kopplung der Antikörper war jedoch technisch anspruchsvoll und die Konjugate waren instabil. Eine wesentliche Verbesserung der Technik gelang 1958 J. L. Riggs und Kollegen, indem sie Isothiocyanate verwendete. Einer anderen Arbeitsgruppe war zwischenzeitlich ein Zwei-Farben-Nachweis mit Fluorescein-Isocyanat und dem orange fluoreszierenden Rhodamin B-Isocyanat gelungen. Riggs und seinen Mitstreitern gelang nun die Markierung von Antikörpern mit den deutlich stabileren Fluoresceinisothiocyanat (FITC) und Rhodamin B-isothiocyanat[30].[22]

Johan Sebastian Ploem und die Einführung der Interferenzfilter[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

Noch in den 1950er Jahren wurde Fluoreszenzmikroskopie ausschließlich mit UV, violettem oder blauem Anregungslicht durchgeführt.[31][32] Dies änderte sich erst mit der durch den Niederländer Johan Sebastian Ploem vorangetriebenen Einführung von Interferenzfiltern in den 1960er Jahren. Die ersten, die einen dichroitischen Strahlteiler in der Mikroskopie einsetzten waren die Russen Brumberg und Krylova im Jahr 1953.[33] Die auf russisch veröffentlichte Arbeit blieb jedoch im Westen unbekannt und wurde erst später „wiederentdeckt“.

Angetrieben durch die Entwicklung zahlreicher Antikörper für Immunfluoreszenzen entstand ein Bedarf für Fluorochrome mit unterschiedlichen Farben. Diese ließen sich jedoch durch die herkömmliche Anregung mit UV-Licht oft nur schlecht anregen. Um 1962 begann Ploem eine Zusammenarbeit mit den Schott-Werken in Mainz zur Entwicklung dichroitischer Strahlteiler, die blaues oder grünes Licht reflektierten. Schott stellte zuvor schon viele der in der Fluoreszenzmikroskopie gebräuchlichen Glasfilter her. Die Firma Leitz lieferte Ploem eine Opak-Auflichtbeleuchtung mit einem halbdurchlässigen, farbunabhängigen Spiegel. Diese wurde an der Universiteit van Amsterdam umgebaut und erhielt einen Schieber mit vier Positionen für dichroitische Strahlteiler zur Anregung mit UV, Violett, Blau und grünem Licht, so dass die jeweilige Anregungswellenlänge bequem ausgewählt werden konnte. Erstmals erfolgte die Anregung damit wie heute üblich durch das Objektiv. Durch die Wahl von schmalbandigen Interferenzfiltern für blaues beziehungsweise grünes Anregungslicht konnten außerdem die in der Immunfluoreszenz häufig verwendeten Farbstoffe FITC (grün fluoreszierend) und Tetramethylrhodamin-Isothiocyanat (TRITC; orange fluoreszierend) nahe an ihrem Anregungsmaximum angeregt werden, ohne gleichzeitig große Mengen Autofluoreszenz mit überflüssigen Anregungswellenlängen auszulösen. Seine Ergebnisse veröffentlichte Ploem in mehreren Arbeiten ab 1965.[22][34]

Im Anschluss entwickelte Leitz den PLOEMOPAK, eine Einrichtung, auf der vier Strahlteiler durch Rotation abwechselnd in den Strahlengang eingeschwenkt werden konnten. Spätere Versionen wurden um Sperrfilter und Anregungsfilter ergänzt bis schließlich um 1972 eine Variante auf den Markt kam, die vier Fluoreszenzfilterwürfel mit je einem Anregungsfilter, Strahlteiler und Sperrfilter enthielt. Die Würfel konnten durch den Anwender ausgetauscht werden, um sie den jeweils verwendeten Fluorochromen anzupassen.[34]

Damit war die Entwicklung des Epifluoreszenzmikroskops wie es heute noch verwendet wird im Prinzip abgeschlossen. Es sollte jedoch noch etliche Jahre dauern, bis sich dieser Bautyp allgemein durchsetzte. Britische Mikroskopie-Lehrbücher von 1975 und 1977 erwähnen ausschließlich die Möglichkeit der UV-Anregung und Durchlichtbeleuchtung.[35][36] Ein späteres von 1982 meinte, dass die Beleuchtung für gewöhnlich mit einem Dunkelfeldkondensor erfolge, beschrieb aber auch die Auflichtbeleuchtung mit dichroitischem Strahlteiler und stellte diese als die lichtempfindlichere vor. Die Möglichkeit, durch den Austausch aller Filter Fluorochrome wie FITC und Rhodamin nacheinander nachweisen zu können wurde ebenfalls erwähnt.[37] Ein westdeutsches Lehrbuch von 1985 beschrieb alle drei Möglichkeiten, Durchlicht-Hell- und -Dunkelfeld sowie Auflicht-Hellfelderregung durch das Objektiv, schrieb letzterer besonders einfache Einstellung (da kein Kondensor benötigt wird), hohe Anregungsintensität bei ausgezeichnetem Kontrast zu und erwähnte die Möglichkeit Filterblöcke schnell auszutauschen. Als Hersteller solcher Systeme wurden genannt Leitz, Olympus, Reichert, Zeiss und Jena, gemeint ist wohl der VEB Carl Zeiss Jena.[38] Ein Lehrbuch von 1988 erwähnte zwar die älteren Methoden, stellte dann aber fest „Moderne Fluoreszenzmikroskope arbeiten nach dem Prinzip der Auflicht-Hellfeldanregung“ mit dichroitischer Teilerplatte. Im weiteren hieß es: „Die meisten Mikroskophersteller bieten Einrichtungen für die Durchlicht- und Auflicht-Fluoreszenzmikroskopie an“.[39]

Weblinks[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

Einzelnachweise[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]

  1. a b Jörg Haus: Optische Mikroskopie. Wiley-VCH, Weinheim 2014, ISBN 978-3-527-41127-6, S. 163–173.
  2. a b c d e f g h i j k l m Guy Cox: Optical Imaging Techniques in Cell Biology. Second ed. CRC Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton, FL, USA 2012, ISBN 978-1-4398-4825-8, S. 35–48.
  3. Markus Axmann, Josef Madl, Gerhard J. Schütz: Single-Molecule Microscopy in the Life Sciences. In: Ulrich Kubitscheck (Hrsg.): Fluorescence Microscopy. Wiley-Blackwell, Weinheim 2013, ISBN 978-3-527-32922-9, S. 293–343, hier: S. 309.
  4. I. Georgakoudi, B. C. Jacobson, M. G. Müller, E. E. Sheets, K. Badizadegan, D. L. Carr-Locke, C. P. Crum, C. W. Boone, R. R. Dasari, J. Van Dam, M. S. Feld: NAD(P)H and collagen as in vivo quantitative fluorescent biomarkers of epithelial precancerous changes. In: Cancer research. Band 62, Nummer 3, Februar 2002, S. 682–687, PMID 11830520.
  5. M. R. Speicher, S. Gwyn Ballard, D. C. Ward: Karyotyping human chromosomes by combinatorial multi-fluor FISH. In: Nature genetics. Band 12, Nummer 4, April 1996, S. 368–375, doi:10.1038/ng0496-368. PMID 8630489.
  6. A. Bolzer, G. Kreth, I. Solovei, D. Koehler, K. Saracoglu, C. Fauth, S. Müller, R. Eils, C. Cremer, M. R. Speicher, T. Cremer: Three-dimensional maps of all chromosomes in human male fibroblast nuclei and prometaphase rosettes. In: PLoS biology. Band 3, Nummer 5, Mai 2005, S. e157, doi:10.1371/journal.pbio.0030157. PMID 15839726, PMC 1084335 (freier Volltext).
  7. a b Douglas B. Murphy, Michael W. Davidson: Fundamentals of Light Microscopy and Electronic Imaging. Second ed. Wiley-Blackwell, Hoboken, NJ, USA 2013, ISBN 978-0-471-69214-0, S. 45–50.
  8. Guy Cox: Optical Imaging Techniques in Cell Biology. Second ed. CRC Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton, FL, USA 2012, ISBN 978-1-4398-4825-8, S. 75–81.
  9. Douglas B. Murphy, Michael W. Davidson: Fundamentals of Light Microscopy and Electronic Imaging. Second ed. Wiley-Blackwell, Hoboken, NJ, USA 2013, ISBN 978-0-471-69214-0, S. 389–413.
  10. a b c d e Jörg Haus: Optische Mikroskopie. Wiley-VCH, Weinheim 2014, ISBN 978-3-527-41127-6, S. 189–200.
  11. Guy Cox: Optical Imaging Techniques in Cell Biology. Second ed. CRC Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton, FL, USA 2012, ISBN 978-1-4398-4825-8, S. 63 ff.
  12. Guy Cox: Optical Imaging Techniques in Cell Biology. Second ed. CRC Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton, FL, USA 2012, ISBN 978-1-4398-4825-8, S. 109 ff.
  13. Guy Cox: Optical Imaging Techniques in Cell Biology. Second ed. CRC Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton, FL, USA 2012, ISBN 978-1-4398-4825-8, S. 1223 ff.
  14. Anonym: Method of the Year 2008. In: Nature Methods. 6, 2009, S. 1–1, doi:10.1038/nmeth.f.244.
  15. Volker Westphal, Silvio O. Rizzoli, Marcel A. Lauterbach, Dirk Kamin, Reinhard Jahn, Stefan W. Hell: Video-Rate Far-Field Optical Nanoscopy Dissects Synaptic Vesicle Movement. In: Science. Band 320, Nr. 5873, 11. April 2008, S. 246–249, doi:10.1126/science.1154228.
  16. Guy Cox: Optical Imaging Techniques in Cell Biology. Second ed. CRC Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton, FL, USA 2012, ISBN 978-1-4398-4825-8, S. 245–247.
  17. Guy Cox: Optical Imaging Techniques in Cell Biology. Second ed. CRC Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton, FL, USA 2012, ISBN 978-1-4398-4825-8, S. 207 ff.
  18. Douglas B. Murphy, Michael W. Davidson: Fundamentals of Light Microscopy and Electronic Imaging. Second ed. Wiley-Blackwell, Hoboken, NJ, USA 2013, ISBN 978-0-471-69214-0, S. 280 ff.
  19. a b Guy Cox: Optical Imaging Techniques in Cell Biology. Second ed. CRC Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton, FL, USA 2012, ISBN 978-1-4398-4825-8, S. 181–190.
  20. Guy Cox: Optical Imaging Techniques in Cell Biology. Second ed. CRC Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton, FL, USA 2012, ISBN 978-1-4398-4825-8, S. 169–180.
  21. Douglas B. Murphy, Michael W. Davidson: Fundamentals of Light Microscopy and Electronic Imaging. Second ed. Wiley-Blackwell, Hoboken, NJ, USA 2013, ISBN 978-0-471-69214-0, S. 167.
  22. a b c d e f g h i j k Dieter Gerlach: Geschichte der Mikroskopie. Verlag Harri Deutsch, Frankfurt am Main 2009, ISBN 978-3-8171-1781-9, S. 625–657.
  23. a b c Oskar Heimstädt: Das Fluoreszenzmikroskop. In: Zeitschrift für wissenschaftliche Mikroskopie. Band 28, 1911, S. 330–337 (online).
  24. a b c Fritz Bräutigam, Alfred Grabner: Fluoreszenzmikroskopie. In: Fritz Bräutigam, Alfred Grabner (Hrsg.): Beiträge zur Fluoreszenzmikroskopie (= 1. Sonderband der Zeitschrift „Mikroskopie“). Verlag Georg Fromme & Co., Wien 1949, S. 25–34.
  25. Michail Tswett: Über Reicherts Fluoreszenz-Mikroskop und einigen damit angestellten Beobachtungen über Chlorophyll und Cyanophyll. In: Berichte der Deutschen Botanischen Gesellschaft. 29, 1911, S. 744–746. (Zitiert nach Gerlach, 2009.)
  26. Stanislaus von Prowazek: Fluoreszenz der Zellen.-Reicherts Fluoreszenzmikroskop. In: Zoologischer Anzeiger. 42, 1913, S. 374–380. (Zitiert nach Gerlach, 2009.)
  27. a b c d Max Haitinger: Fluorescenzmikrosokopie-Ihre Anwendung in der Histologie und Chemie. Akademische Verlagsgesellschaft, Leipzig 1938.
  28. Karl Höfler: Max Haitinger 1868-1946. In: Hugo Freund, Alexander Berg (Hrsg.): Angewandte Naturwissenschaften und Technik (= Geschichte der Mikroskopie Leben und Werk großer Forscher. Band III). Umschau Verlag, Frankfurt am Main 1966, S. 187–194.
  29. Albert H. Coons, Hugh J. Creech, R. Norman Jones, Ernst Berliner: The Demonstration of Pneumococcal Antigen in Tissues by the Use of Fluorescent Antibody. In: J Immunol. Band 45, Nr. 3, 1. November 1942, S. 159–170 (online).
  30. J. L. Riggs, R. J. Seiwald, J. H. Burckhalter, C. M. Downs, T. G. Metcalf: Isothiocyanate compounds as fluorescent labeling agents for immune serum. In: The American journal of pathology. Band 34, Nummer 6, Nov-Dez 1958, S. 1081–1097. PMID 13583098, PMC 1934794 (freier Volltext).
  31. E. S. Perner: Die Methoden der Fluoreszenzmikroskopie. In: Hugo Freund (Hrsg.): Die optischen Grundlagen, die Instrumente und Nebenapparate für die Mikroskopie in der Technik. Teil 1: Allgemeines Instrumentarium der Durchlichtmikroskopie (= Handbuch der Mikroskopie in der Technik. Band 1, Teil 1). Umschau Verlag, Frankfurt am Main 1957, S. 357–431. Hier, S. 371.
  32. Heinz Appelt: Einführung in die mikroskopischen Untersuchungsmethoden. 4. Auflage. Akademische Verlagsgesellschaft Geest & Portig, Leipzig 1959, S. 283.
  33. E. M. Brumberg, T. N. Krylova: O fluoreschentnykh mikroskopopak. In: Zh. obshch. biol. 14, 1953, S. 461.
  34. a b Johan Sebastiaan Ploem, Friedrich Walter: Multi-Wavelength Epi-Illumination in Fluorescence Microscopy. In: Leica Microsystems (Hrsg.): Scientific and Technical Information CDR. Band 5, 2001, S. 1–16 (online beim Leica Science Lab).
  35. H. N. Southworth: Introduction to Modern Microscopy. Wykeham Publications LTD, a member of the Taylor & Francis Group, London 1975, ISBN 0-85109-470-8, S. 84–85.
  36. W. Burrels: Microscope Technique. A Comprehensive Handbook for General and Applied Microscopy. New revised ed. Fountain Press, London 1977, ISBN 0-85242-511-2, S. 481–483.
  37. Michael Spencer: Fundamentals of light microscopy (= IUPAB Biophysics Series. Band 6). Cambridge University Press, Cambridge, England 1982, ISBN 0-521-28967-X, S. 40–45.
  38. Dieter Gerlach: Das Lichtmikroskop. Eine Einführung in Funktion und Anwendung in Biologie und Medizin. 2. Auflage. Thieme Verlag, Stuttgart 1985, ISBN 3-13-530302-0, S. 210–224.
  39. Gerhard Göke: Moderne Methoden der Lichtmikroskopie: vom Durchlicht-Hellfeld- bis zum Lasermikroskop. Franckh'sche Verlagshandlung, Stuttgart 1988, ISBN 3-440-05765-8, S. 211–212.
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