„Molekülmarkierung“ – Versionsunterschied
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Im Gegensatz zu Kohlenhydraten und Nukleinsäuren kommen manche Strukturmotive durch die verschiedenen enthaltenen Aminosäuren nur bei Proteinen vor, z. B. Sulfhydryl-enthaltende [[Cystein]]e oder [[Phenol]]reste in [[Tyrosin]]en. Diese können mit entsprechenden Reagenzien selektiv markiert werden. Cysteine können mit [[Maleimid]]estern, [[Disulfidbindung|Disulfide]] oder [[Iodacetamid]] selektiv reagieren. Aminosäuren mit primären [[Amin]]en an der Seitenkette wie Lysin können durch [[Succinimid]]ester ([[N-Hydroxysuccinimid|''N''-Hydroxysuccinimid]], Sulfosuccinimid- oder anderen [[Succinimid]]ylester) oder bestimmte [[Isothiocyanat]]e wie [[PITC]] markiert werden. Einige [[Proteaseinhibitor]]en führen zu einer selektiven Markierung von Proteinen. [[Fixierung (Präparationsmethode)|Fixierung]]smittel führen meist zu einer [[Vernetzung (Chemie)|Quervernetzung]] verschiedener Aminosäuren. Auf dem gleichen Prinzip wie die Markierung basiert auch die [[Vernetzung (Chemie)|Vernetzung]]. Bei einer [[Immunmarkierung]] basiert die selektive Bindung der Markierung auf [[Antikörper]]n. |
Im Gegensatz zu Kohlenhydraten und Nukleinsäuren kommen unter den [[Biomolekül]]en manche Strukturmotive durch die verschiedenen enthaltenen Aminosäuren nur bei Proteinen vor, z. B. Sulfhydryl-enthaltende [[Cystein]]e oder [[Phenol]]reste in [[Tyrosin]]en. Diese können mit entsprechenden Reagenzien selektiv markiert werden. Cysteine können mit [[Maleimid]]estern, [[Disulfidbindung|Disulfide]] oder [[Iodacetamid]] selektiv reagieren. Aminosäuren mit primären [[Amin]]en an der Seitenkette wie Lysin können durch [[Succinimid]]ester ([[N-Hydroxysuccinimid|''N''-Hydroxysuccinimid]], Sulfosuccinimid- oder anderen [[Succinimid]]ylester) oder bestimmte [[Isothiocyanat]]e wie [[PITC]] markiert werden. Einige [[Proteaseinhibitor]]en führen zu einer selektiven Markierung von Proteinen. [[Fixierung (Präparationsmethode)|Fixierung]]smittel führen meist zu einer [[Vernetzung (Chemie)|Quervernetzung]] verschiedener Aminosäuren. Auf dem gleichen Prinzip wie die Markierung basiert auch die [[Vernetzung (Chemie)|Vernetzung]]. Bei einer [[Immunmarkierung]] basiert die selektive Bindung der Markierung auf [[Antikörper]]n. In der [[DIGE]] werden unterschiedlich markierte Proben gemeinsam per [[SDS-PAGE]] oder [[2D-Gelelektrophorese]] aufgetrennt.<ref>M. M. Shaw, B. M. Riederer: ''Sample preparation for two-dimensional gel electrophoresis.'' In: ''Proteomics.'' Band 3, Nummer 8, August 2003, S. 1408–1417, {{ISSN|1615-9853}}. {{DOI|10.1002/pmic.200300471}}. PMID 12923765.</ref><ref>J. F. Timms, R. Cramer: ''Difference gel electrophoresis.'' In: ''Proteomics.'' Band 8, Nummer 23–24, Dezember 2008, S. 4886–4897, {{ISSN|1615-9861}}. {{DOI|10.1002/pmic.200800298}}. PMID 19003860.</ref> |
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Im Zuge einer Radioiodierung können Tyrosine mit radioaktivem [[Iod]] markiert werden. [[Phosphorylierung]]en von [[Serin]], [[Threonin]] und Tyrosin werden meist enzymatisch mit geeigneten [[Proteinkinase]]n und radioaktivem Phosphor durchgeführt. Die Markierung mit radioaktiven [[Isotop]]en erlaubt eine Verfolgung per [[Autoradiographie]] |
Im Zuge einer Radioiodierung können Tyrosine mit radioaktivem [[Iod]] markiert werden. [[Phosphorylierung]]en von [[Serin]], [[Threonin]] und Tyrosin werden meist enzymatisch mit geeigneten [[Proteinkinase]]n und radioaktivem Phosphor durchgeführt. Die Markierung mit radioaktiven [[Isotop]]en erlaubt eine Verfolgung per [[Autoradiographie]], per [[Szintillationszähler]] oder per [[Positronen-Emissions-Tomographie]].<ref>V. Tolmachev, A. Orlova: ''Influence of labelling methods on biodistribution and imaging properties of radiolabelled peptides for visualisation of molecular therapeutic targets.'' In: ''Current medicinal chemistry.'' Band 17, Nummer 24, 2010, S. 2636–2655, {{ISSN|1875-533X}}. PMID 20491631.</ref><ref>V. Tolmachev, S. Stone-Elander: ''Radiolabelled proteins for positron emission tomography: Pros and cons of labelling methods.'' In: ''Biochimica et biophysica acta.'' Band 1800, Nummer 5, Mai 2010, S. 487–510, {{ISSN|0006-3002}}. {{DOI|10.1016/j.bbagen.2010.02.002}}. PMID 20153401.</ref> In der [[Massenspektrometrie]] und der [[NMR-Spektroskopie]] wird die [[Isobarenmarkierung]] zur Unterscheidung verschiedener Proben verwendet.<ref>Y. Xu, S. Matthews: ''TROSY NMR spectroscopy of large soluble proteins.'' In: ''Topics in current chemistry.'' Band 335, 2013, S. 97–119, {{ISSN|0340-1022}}. {{DOI|10.1007/128_2011_228}}. PMID 21928013.</ref> [[Wasserstoff]]atome können durch [[Deuterium]] ausgetauscht werden. Markierungen mit <sup>13</sup>[[Kohlenstoff]] und <sup>15</sup>[[Stickstoff]] wird in der NMR-Spektroskopie verwendet.<ref>A. Audhya, A. Desai: ''Proteomics in Caenorhabditis elegans.'' In: ''Briefings in functional genomics & proteomics.'' Band 7, Nummer 3, Mai 2008, S. 205–210, {{ISSN|1477-4062}}. {{DOI|10.1093/bfgp/eln014}}. PMID 18372286.</ref> |
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Auch photoreaktive Moleküle (z. B. [[Aryl]][[azid]]e, [[Diazirin]]e) können als reaktive Gruppe einer Markierung bei Proteinen verwendet werden, um den Zeitpunkt der Vernetzung besser steuern zu können, da die Vernetzung erst mit [[UV]]-Bestrahlung ausgelöst wird. Aufgrund der geringeren Selektivität der radikalischen Vernetzer wird oftmals die Funktionsfähigkeit des Proteins durch Reaktion des [[Radikale (Chemie)|radikalischen]] Vernetzers mit wichtigen Funktionen (z. B. ein [[aktives Zentrum]] oder eine [[Protein-Protein-Interaktion|Bindungsstelle]]) gemindert. Daher werden photoreaktive Markierungen meistens eingesetzt, wenn keine oder nur eine Amin- oder Sulfhydrylgruppe zur selektiven Vernetzung zur Verfügung steht oder eine anschließende Funktionsfähigkeit unerheblich ist. |
Auch photoreaktive Moleküle (z. B. [[Aryl]][[azid]]e, [[Diazirin]]e) können als reaktive Gruppe einer Markierung bei Proteinen verwendet werden, um den Zeitpunkt der Vernetzung besser steuern zu können, da die Vernetzung erst mit [[UV]]-Bestrahlung ausgelöst wird. Aufgrund der geringeren Selektivität der radikalischen Vernetzer wird oftmals die Funktionsfähigkeit des Proteins durch Reaktion des [[Radikale (Chemie)|radikalischen]] Vernetzers mit wichtigen Funktionen (z. B. ein [[aktives Zentrum]] oder eine [[Protein-Protein-Interaktion|Bindungsstelle]]) gemindert. Daher werden photoreaktive Markierungen meistens eingesetzt, wenn keine oder nur eine Amin- oder Sulfhydrylgruppe zur selektiven Vernetzung zur Verfügung steht oder eine anschließende Funktionsfähigkeit unerheblich ist. |
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Version vom 15. Januar 2014, 09:51 Uhr
Die Molekülmarkierung (englisch labelling) ist eine biochemische Methode zur selektiven Bindung eines Atoms oder Moleküls an ein Molekül. Die Markierung wird zur weiteren Verfolgung des markierten Moleküls verwendet.
Eigenschaften
Moleküle können je nach ihren charakteristischen funktionellen Gruppen mit einer selektiv bindenden Markierung versehen werden. Die Markierung kann dabei kovalent oder ionisch (über Chelatoren) gebunden sein. Als Markierungen werden Nuklide (radioaktive und nicht radioaktive), Biotin, Reporterenzyme, Fluorophore oder Oligonukleotide eingesetzt.
Proteine
Im Gegensatz zu Kohlenhydraten und Nukleinsäuren kommen unter den Biomolekülen manche Strukturmotive durch die verschiedenen enthaltenen Aminosäuren nur bei Proteinen vor, z. B. Sulfhydryl-enthaltende Cysteine oder Phenolreste in Tyrosinen. Diese können mit entsprechenden Reagenzien selektiv markiert werden. Cysteine können mit Maleimidestern, Disulfide oder Iodacetamid selektiv reagieren. Aminosäuren mit primären Aminen an der Seitenkette wie Lysin können durch Succinimidester (N-Hydroxysuccinimid, Sulfosuccinimid- oder anderen Succinimidylester) oder bestimmte Isothiocyanate wie PITC markiert werden. Einige Proteaseinhibitoren führen zu einer selektiven Markierung von Proteinen. Fixierungsmittel führen meist zu einer Quervernetzung verschiedener Aminosäuren. Auf dem gleichen Prinzip wie die Markierung basiert auch die Vernetzung. Bei einer Immunmarkierung basiert die selektive Bindung der Markierung auf Antikörpern. In der DIGE werden unterschiedlich markierte Proben gemeinsam per SDS-PAGE oder 2D-Gelelektrophorese aufgetrennt.[1][2]
Im Zuge einer Radioiodierung können Tyrosine mit radioaktivem Iod markiert werden. Phosphorylierungen von Serin, Threonin und Tyrosin werden meist enzymatisch mit geeigneten Proteinkinasen und radioaktivem Phosphor durchgeführt. Die Markierung mit radioaktiven Isotopen erlaubt eine Verfolgung per Autoradiographie, per Szintillationszähler oder per Positronen-Emissions-Tomographie.[3][4] In der Massenspektrometrie und der NMR-Spektroskopie wird die Isobarenmarkierung zur Unterscheidung verschiedener Proben verwendet.[5] Wasserstoffatome können durch Deuterium ausgetauscht werden. Markierungen mit 13Kohlenstoff und 15Stickstoff wird in der NMR-Spektroskopie verwendet.[6]
Auch photoreaktive Moleküle (z. B. Arylazide, Diazirine) können als reaktive Gruppe einer Markierung bei Proteinen verwendet werden, um den Zeitpunkt der Vernetzung besser steuern zu können, da die Vernetzung erst mit UV-Bestrahlung ausgelöst wird. Aufgrund der geringeren Selektivität der radikalischen Vernetzer wird oftmals die Funktionsfähigkeit des Proteins durch Reaktion des radikalischen Vernetzers mit wichtigen Funktionen (z. B. ein aktives Zentrum oder eine Bindungsstelle) gemindert. Daher werden photoreaktive Markierungen meistens eingesetzt, wenn keine oder nur eine Amin- oder Sulfhydrylgruppe zur selektiven Vernetzung zur Verfügung steht oder eine anschließende Funktionsfähigkeit unerheblich ist.
Es existieren auch photoreaktive Diazirin-enthaltende Analoga der Aminosäuren Leucin, Methionin und p-Benzoyl-Phenylalanin, die bereits während der Translation in vivo in das Protein eingebaut werden können.[7]
Bei einem Label-Transfer wird eine Quervernetzung zwischen zwei benachbarten Molekülen verwendet, um eine Markierung zwischen diesen Molekülen zu übertragen und dadurch deren Nachbarschaft nachzuweisen.
DNA
DNA besitzt vergleich zu Proteinen weniger funktionelle Gruppen. Die Phosphatgruppe kann durch radioaktives Phosphat mit einem 32Phosphoratom im Zuge eines Random Priming oder einer Nick translation markiert werden. Durch eine Polymerasekettenreaktion kann DNA mit unnatürlichen Nukleotidanaloga markiert werden (z. B. BrdU). Die Aminogruppe des Adenins kann mit Succinimidylestern oder bestimmten Isothiocyanaten reagieren. Im Zuge einer In-situ-Hybridisierung wird DNA mit Hybridisierungssonden markiert.
Literatur
- Hubert Rehm: Proteinbiochemie / Proteomics, Der Experimentator. 5. Auflage. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg 2006, ISBN 3-8274-1726-0.
- Friedrich Lottspeich, Haralabos Zorbas: Bioanalytik. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg 1998, ISBN 3-8274-0041-4.
Einzelnachweise
- ↑ M. M. Shaw, B. M. Riederer: Sample preparation for two-dimensional gel electrophoresis. In: Proteomics. Band 3, Nummer 8, August 2003, S. 1408–1417, ISSN 1615-9853. doi:10.1002/pmic.200300471. PMID 12923765.
- ↑ J. F. Timms, R. Cramer: Difference gel electrophoresis. In: Proteomics. Band 8, Nummer 23–24, Dezember 2008, S. 4886–4897, ISSN 1615-9861. doi:10.1002/pmic.200800298. PMID 19003860.
- ↑ V. Tolmachev, A. Orlova: Influence of labelling methods on biodistribution and imaging properties of radiolabelled peptides for visualisation of molecular therapeutic targets. In: Current medicinal chemistry. Band 17, Nummer 24, 2010, S. 2636–2655, ISSN 1875-533X. PMID 20491631.
- ↑ V. Tolmachev, S. Stone-Elander: Radiolabelled proteins for positron emission tomography: Pros and cons of labelling methods. In: Biochimica et biophysica acta. Band 1800, Nummer 5, Mai 2010, S. 487–510, ISSN 0006-3002. doi:10.1016/j.bbagen.2010.02.002. PMID 20153401.
- ↑ Y. Xu, S. Matthews: TROSY NMR spectroscopy of large soluble proteins. In: Topics in current chemistry. Band 335, 2013, S. 97–119, ISSN 0340-1022. doi:10.1007/128_2011_228. PMID 21928013.
- ↑ A. Audhya, A. Desai: Proteomics in Caenorhabditis elegans. In: Briefings in functional genomics & proteomics. Band 7, Nummer 3, Mai 2008, S. 205–210, ISSN 1477-4062. doi:10.1093/bfgp/eln014. PMID 18372286.
- ↑ M. Suchanek, A. Radzikowska, C. Thiele: Photo-leucine and photo-methionine allow identification of protein–protein interactions in living cells. In: Nature Methods. 2. Jahrgang, Nr. 4, 2005, S. 261–268, doi:10.1038/nmeth752, PMID 15782218.