Elektrophorese

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Elektrophorese mit über PCR gewonnenen DNA-Fragmenten, wobei (1) der Vater, (2) das Kind und (3) die Mutter ist.

Elektrophorese (veraltet Kataphorese) bezeichnet die Wanderung geladener kolloidaler Teilchen durch ein elektrisches Feld.[1]

Beschreibung[Bearbeiten]

Die Driftgeschwindigkeit (auch „Wanderungsgeschwindigkeit”) v der kolloidalen Teilchen, typischerweise Proteine oder Nukleinsäuren, ist bei der Elektrophorese proportional zur Feldstärke E und zur Ionenladung Q, umgekehrt proportional zum Teilchenradius r und zur Viskosität η des Stoffes. Außerdem spielt das Ionenmilieu der Lösung, in dem elektrischer Strom fließt, eine wesentliche Rolle. Physikalische Ursache der Bewegung ist die Scherkraft in der elektrischen Doppelschicht, die das Kolloid umgibt (Stern-Doppelschicht) und die geladene Flüssigkeit in relative Bewegung zum Makromolekül setzt. Bei der Gelelektrophorese spielt auch das Verhältnis zwischen dem Teilchenradius und der Porenweite des als Trägermedium dienenden Gels eine Rolle, weil das Gel als Molekularsieb wirkt, so dass sich ein größerer Teilchenradius stärker hemmend auf die Wanderungsgeschwindigkeit auswirkt, als nur durch die Viskosität allein zu erwarten wäre. Durch die unterschiedliche Ionenladung und den Teilchenradius bewegen sich die einzelnen Stoffe (Moleküle) unterschiedlich schnell durch das Trägermaterial und erreichen eine Auftrennung entsprechend ihrer elektrophoretischen Mobilität. Damit eignet sich die Elektrophorese sehr gut zur Trennung von Stoffgemischen (insbesondere Molekülgemischen). Als Trägermaterial können Flüssigkeiten, Gele (siehe Gelelektrophorese, meistens mit Polyacrylamid oder Agarose) oder Feststoffe zum Einsatz kommen.

Agarose-Gele kommen vor allem bei der Auftrennung von DNA-Fragmenten zum Einsatz, während Proteine meist in Polyacrylamid-Gelen aufgetrennt werden. Als Verfahren kommen bei Proteinen SDS-PAGE und Western Blot zum Einsatz. Proteine müssen als Zwitterionen mit zusätzlichen Ladungen durch ein Detergens wie Natriumdodecylsulfat (englisch sodium dodecyl sulfate, SDS) beladen werden, um von einer Auftrennung nach den heterogenen Ladungsdichten zu einer Auftrennung nach der Molekülmasse zu kommen. Durch Zugabe von SDS und Aufkochen (Denaturieren) adsorbieren die Proteine proportional zu ihrer aufgefalteten Länge (und auch proportional zur Molekülmasse) das aliphatische Ende des negativ-geladenen Natriumlaurylsulfats. Dabei binden circa 1,4 Gramm SDS pro Gramm Protein in einprozentigen SDS-Lösungen. Die negativ geladenen Sulfatgruppen der SDS-Moleküle stoßen sich gegenseitig ab, was die Auffaltung (Linearisierung) der Proteine fördert, sofern das Protein keine Disulfidbrücken aufweist. Daher werden bei der Molmassenbestimmung zusätzlich Reduktionsmittel zur Überführung der Disulfide in Thiole hinzugegeben. Da mehrere hundert negativ geladene SDS-Moleküle an die Proteinmoleküle binden, kann die Eigenladung der Proteine im basischen pH des Gels vernachlässigt werden.

Elektrophoretische Mobilität[Bearbeiten]

Zwei SDS-Gele nach dem Ende des Probenlaufs und Färbung der Proteinbanden mit Coomassie

Die elektrophoretische Mobilität von zwei zu trennenden Teilchen muss unterschiedlich sein, um eine Trennung mittels Elektrophorese zu erreichen. Die elektrophoretische Mobilität ist die Summe vieler physikalischer Faktoren, die letztendlich die Wanderungsgeschwindigkeit eines Teilchens während der Elektrophorese beeinflussen. Die generell treibende Kraft, die die Bewegung der Teilchen hervorruft, ist die Kraft F, die auf ein Teilchen mit bestimmter Ladung q innerhalb eines elektrischen Feldes mit gegebener Feldstärke E wirkt.

F = q \cdot E

Dem entgegen wirkt zunächst eine Kraft, die sich durch die Viskosität \eta und die Größe des Teilchens (idealisiert für sphärische Teilchen: 6 \cdot \pi \cdot r) ergibt, und nach dem Gesetz von Stokes berechnet werden kann.

F = 6 \cdot \pi \cdot r \cdot \eta \cdot v

Aus diesen beiden Gleichungen ergibt sich die theoretische elektrophoretische Mobilität \mu_{e,p}^0. Theoretisch aus dem Grund, da diese beiden Gleichungen nur für einen idealisierten, trägerfreien Zustand mit unendlich verdünntem (praktisch salzfreien, was jedoch dem Prinzip der Elektrophorese widerspricht, da Salzionen als bewegliche Ladungsträger benötigt werden) Elektrolyten gelten. Weiterhin wird dabei angenommen, dass die beschleunigende Kraft der Reibungskraft entspricht und daher eine konstante Wanderungsgeschwindigkeit vorherrscht. Daher ergibt sich in diesem Modell die Ionenbeweglichkeit wie folgt:

\mu_{e,p}^0 = \frac{v}{E} = \frac{q}{6 \cdot \pi \cdot r \cdot \eta}

In realen Systemen kommen weitere Faktoren wie die Reibung zwischen den Hydrathüllen (elektrophoretischer Effekt), die Deformation der Ladungsverteilung als Relaxation im elektrischen Feld (dissipativer Effekt, siehe Ionenatmosphäre), der Dissoziationsgrad des Elektrolyten und Effekte durch das Trägermaterial (Molekularsieb-, Elektroosmose- und Adsorptionseffekte) zum Tragen.

Während traditionelle Theorien davon ausgehen, dass elektrophoretische Aktivität eines Teilchens eine Nettoladung des Teilchens voraussetzt, legen neue Ergebnisse aus Molekulardynamiksimulationen nahe, dass aufgrund der molekularen Struktur des Wassers an der Oberfläche auch ungeladene Teilchen elektrophoretische Aktivität zeigen können.[2]

Arten[Bearbeiten]

Anwendung[Bearbeiten]

Angewandt wird die Elektrophorese vor allem als Analyseverfahren in der Biologie und Medizin. Zu den wichtigsten Anwendungen gehören die Serumelektrophorese, sowie die DNA-Analyse in Form von Fragmenten und DNA-Sequenzierung. Hierbei wird die Möglichkeit genutzt, Moleküle unterschiedlicher Länge voneinander zu trennen. Zur Bestimmung der Messwerte eines Geles wie z. B. Laufweiten, Molmassen, Quantifizierungen oder Normalisierung wird eine spezialisierte Auswertesoftware genutzt. Auch zur Trennung von Proteinen und für die hochtechnologischen Verfahren der Proteomforschung bildet die Elektrophorese die Grundlage. Die graphische Darstellung der Ergebnisse ist ein Elektropherogramm. Neben den analytischen Verfahren werden zur Gewinnung von Milligramm-Mengen gereinigter Proteine auch präparative Elektrophoreseverfahren eingesetzt (u. a. Free-Flow-Elektrophorese).

Weitere, technische Anwendungen:

Geschichte[Bearbeiten]

Die Elektrophorese wurde 1937 von Arne Tiselius entwickelt,[3] als Methode mit der Kolloide in einer Trägerflüssigkeit in einem elektrischen Feld getrennt werden konnten (englisch moving boundary electrophoresis ‚Elektrophorese mit beweglicher Grenzschicht‘). Tiselius erhielt dafür 1948 den Nobelpreis für Chemie. In den vierziger Jahren des 20. Jahrhunderts wurden zunehmend feste Phasen zur besseren Trennung verwendet (englisch zone electrophoresis ‚Zonenelektrophorese‘), wie das Stärkegel von Oliver Smithies oder auch Filterpapier. Da diese zur mikrobiellen Zersetzung neigen, wurden in Folge auch andere Hydrogele verwendet, z. B. Agarose oder Polyacrylamid. Während in den fünfziger Jahren oftmals noch eine radiale Elektrophorese auf runden Scheiben durchgeführt wurde (englisch radial electrophoresis ‚Scheiben-Elektrophorese‘), werden heute fast ausschließlich rechteckige Gele verwendet (englisch slab gel electrophoresis ‚Gelplatten-Elektrophorese‘).

Weblinks[Bearbeiten]

  • Oliver Ratajczak: Elektrophorese. Abgerufen am 5. Januar 2010 (Kurzbeschreibung zur Elektrophorese).

Einzelnachweise[Bearbeiten]

  1.  Eintrag: electrophoresis. In: IUPAC Compendium of Chemical Terminology (the “Gold Book”). doi:10.1351/goldbook.E02022.
  2.  V. Knecht, H. J. Risselada, A. E. Mark, S. J. Marrink: Electrophoretic mobility does not always reflect the charge on an oil droplet. In: Journal of Colloid and Interface Science. 318, Nr. 2, 15. Januar 2008, S. 477–486, doi:10.1016/j.jcis.2007.10.035 (PDF, abgerufen am 5. Januar 2010).
  3. Arne Tiselius: A new apparatus for electrophoretic analysis of colloidal mixtures. In: Transactions of the Faraday Society. 33, 1937, S. 524–531. doi:10.1039/TF9373300524. Abgerufen am 4. August 2009.