Lichtmikroskop

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„Großes Mikroskop“ von Carl Zeiss von 1879 mit Optiken berechnet von Ernst Abbe.

Lichtmikroskope sind Geräte, die stark vergrößerte Bilder von kleinen (oft für das Auge nicht sichtbaren) Strukturen oder Objekten durch die Ausnutzung optischer Effekte erzeugen.

Neben der konventionellen Lichtmikroskopie gibt es eine Vielzahl von lichtmikroskopischen Spezialverfahren, wie Phasenkontrast-, Interferenzkontrast-, Fluoreszenz-, Polarisations- und Konfokalmikroskopie.

Geschichte[Bearbeiten]

Die älteste überlieferte Zeichnung, die mit Hilfe eines Mikroskops angefertigt wurde: Bienen. Franceso Stelluti, 1630.
Das zusammengesetzte Mikroskop von Robert Hooke, das er für die Arbeiten an seiner Micrographia (1665) benutzte und mit dem er die Zellen entdeckte, ist ein Auflichtmikroskop. Links die Beleuchtungseinrichtung, die auf das Objekt strahlt.

Das Prinzip der Vergrößerung durch mit Wasser gefüllte Glasschalen wurde bereits von den Römern beschrieben (Seneca) und Vergrößerungslinsen waren schon im 16. Jahrhundert bekannt.

Der niederländische Brillenschleifer Hans Janssen und sein Sohn Zacharias Janssen werden oft als die Erfinder des ersten zusammengesetzten Mikroskopes im Jahr 1590 angesehen. Dies basiert jedoch auf einer Erklärung von Zacharias Janssen selbst aus der Mitte des 17. Jahrhunderts. Das Datum ist dabei fragwürdig, da Zacharias Janssen selbst erst 1590 geboren wurde. Galileo Galilei entwickelte 1609 das Occhiolino, ein zusammengesetztes Mikroskop mit einer konvexen und einer konkaven Linse. Allerdings hatte Zacharias Janssen ein Gerät mit dem gleichen Funktionsprinzip bereits ein Jahr zuvor auf der Frankfurter Messe vorgeführt. Galileis Mikroskop wurde von der „Akademie der Luchse“ in Rom gefeiert, die im Jahr 1603 von Federico Cesi gegründet worden war. Eine Zeichnung des Akademiemitglieds Francesco Stelluti von 1630 gilt als älteste Zeichnung, die mit Hilfe eines Mikroskops angefertigt wurde. Auf ihr sind drei Ansichten von Bienen (von oben, unten und von der Seite) sowie Detailvergrößerungen zu sehen. Die Biene kam im Wappen der Familie Barberini vor, zu der Papst Urban VIII. gehörte. Stelluti schrieb in ein Banner oberhalb der Abbildung: „Für Urban VIII. Pontifex Optimus Maximus […] von der Akademie der Luchse, und in ewiger Verehrung widmen wir Euch dieses Symbol“.[1]

Christiaan Huygens (1629–1695), ebenfalls Niederländer, entwickelte im späten 17. Jahrhundert ein einfaches Zwei-Linsen-Okularsystem. Es war achromatisch korrigiert, hatte also weniger Farbfehler und war deshalb ein großer Fortschritt bei der Verbesserung der Optik im Mikroskop. Okulare nach Huygens werden bis heute produziert, sind jedoch im Vergleich zu modernen Weitfeldokularen optisch deutlich unterlegen.

Auch Robert Hooke benutzte für die Zeichnungen seiner 1665 publizierten „Micrographia“ ein zusammengesetztes Mikroskop (siehe Abbildung). Die stärksten Vergrößerungen, die er in seinem Buch darstellte, waren 50-fach. Stärkere Vergrößerungen waren nicht möglich, da sich die Abbildungsfehler, die in der Frontlinse (Objektiv) und im Okular entstanden, vervielfachten, so dass keine feineren Details zu erkennen waren.

Einlinsiges Mikroskop, genannt Wilsons Schraubrohrmikroskop. Um 1760. Ausführlichere Legende verfügbar.

Antoni van Leeuwenhoek (1632–1723) verfolgte daher einen anderen Ansatz. Die Vergrößerung einer Linse ist umso stärker, je stärker sie gewölbt ist. Kleine, annähernd kugelförmige Linsen haben daher die stärkste Vergrößerung. Leeuwenhoek war brillant im exakten Schleifen kleinster Linsen, eine Technik, die zuvor nur unzureichend gemeistert worden war. Seine einfachen Mikroskope mit nur einer Linse waren zwar unhandlich zu benutzen, doch da er nur mit einer Linse mikroskopierte, entfiel die Multiplikation der Abbildungsfehler. Seine Mikroskope hatten eine bis zu 270-fache Vergrößerung[Beleg?]. So entdeckte Leeuwenhoek die von ihm so genannten „Animalkulen“, einzellige Bakterien und Protozoen.

Im Jahre 1768 beschrieb der Michel Ferdinand d'Albert d'Ailly, Duc de Chaulnes (1714–1769) das erste eigens für Messzwecke konzipierte Messmikroskop.

Robert Brown benutzte noch 1830 ein einfaches Mikroskop und entdeckte damit den Zellkern und die Brownsche Molekularbewegung. Es dauerte 160 Jahre, bevor zusammengesetzte Mikroskope dieselbe Abbildungsqualität erzeugten, wie Leeuwenhoeks einfaches Mikroskop.

Bis weit ins 19. Jahrhundert hinein wurden gute zusammengesetzte Mikroskope durch Ausprobieren und anhand von Erfahrungswerten hergestellt. Ernst Abbe erarbeitete um 1873 die zum Bau besserer Mikroskope erforderlichen, noch heute gültigen physikalischen Grundlagen. Als Folge gelang es zum ersten Mal, ein Objektiv herzustellen, dessen Auflösungsgrenze nicht mehr durch die Materialgüte, sondern durch die physikalischen Beugungsgesetze limitiert wurde. Diese physikalische Auflösungsgrenze wird als das Abbe-Limit bezeichnet. Produziert wurden die entsprechenden Mikroskope zusammen mit Carl Zeiss in dessen optischen Werkstätten. Dabei profitierten sie von den von Otto Schott entwickelten optischen Gläsern und dem von August Köhler entwickelten Beleuchtungsapparat zur Köhlerschen Beleuchtung.

Lichtmikroskop-Typen[Bearbeiten]

Unterteilung nach Bauweise beziehungsweise Anwendung – Übersicht[Bearbeiten]

  • Beim Auflichtmikroskop wird das Licht von der gleichen Seite eingestrahlt, von der auch beobachtet wird. Verwendung findet es bei undurchsichtigen Präparaten und in der Fluoreszenzmikroskopie. In Abgrenzung wird die üblichere Anordnung, bei der das Präparat durchstrahlt wird, als Durchlichtmikroskop bezeichnet.
  • Ein Stereomikroskop hat für beide Augen getrennte Strahlengänge, die das Präparat aus verschiedenen Winkeln zeigen, so dass ein dreidimensionaler Eindruck entsteht.
  • Ein Strichmikroskop ist eine Ablesevorrichtung an einem Theodolit, einem Winkelmessgerät in der Vermessungskunde.
  • Ein Operationsmikroskop wird von Ärzten im Operationssaal eingesetzt.
  • Ein Trichinoskop wird bei der Fleischbeschau zum Nachweis von Trichinen (Fadenwürmer) eingesetzt.
  • Ein Vibrationsmikroskop dient zur Untersuchung der Schwingung von Saiten bei Saiteninstrumenten.
  • Ein Messmikroskop hat eine Zusatzeinrichtung, die eine Vermessung des Präparats erlaubt.
  • Ein Computer-Mikroskop lässt sich zum Beispiel per USB-Kabel an einen Computer anschließen, der zur Anzeige der Abbildung benutzt wird.[2]

Einfache und zusammengesetzte Mikroskope[Bearbeiten]

Als einfache Mikroskope werden optische Linsen bezeichnet, die eine starke Vergrößerung ermöglichen. Der Übergang zu einer im Prinzip genauso funktionierenden aber schwächer vergrößernden Lupe ist dabei fließend. Die heute üblichen Mikroskope sind dagegen zusammengesetzte Mikroskope, die so heißen, weil sie aus zwei Linsensystemen zusammengesetzt sind: Das vorderste optische Element, das Objektiv (siehe auch Abbildung), erzeugt ein Zwischenbild, welches vom Okular erneut vergrößert wird.

Durchlicht- oder Auflichtmikroskopie[Bearbeiten]

Je nach angewendeter Beleuchtungstechnik kann ein Mikroskop für Durchlicht- oder Auflichtmikroskopie verwendet werden. Bei der Durchlichtmikroskopie wird das Licht durch das Präparat hindurchgeleitet, bevor es vom Objektiv des Mikroskops aufgefangen wird. Daher sind durchsichtige oder dünn geschnittene Präparate erforderlich. Bei der Auflichtmikroskopie wird das Licht entweder vom Mikroskop kommend durch das Objektiv auf das Präparat geleitet oder von der Seite eingestrahlt (schräge Beleuchtung). Das am Präparat reflektierte Licht wird wiederum vom Objektiv aufgefangen. Bei der Auflichtmikroskopie werden in der Regel undurchsichtige Präparate verwendet. Solche Präparate sind etwa in den Materialwissenschaften häufig, wo Probestücke eines Materials geschliffene und polierte oder auch angeätzte Oberflächen erhalten, die dann mikroskopisch untersucht werden.

Bau eines Durchlicht-Mikroskops[Bearbeiten]

Bestandteile eines zusammengesetzten Durchlichtmikroskops einfacher Bauart: A) Okular, B) Objektiv, C) Objektträger, D) Kondensor, E) Objekttisch, F) Beleuchtungsspiegel

Die Baugruppen eines typischen Durchlicht-Mikroskops wirken wie folgt zusammen: Die dem Auge zugewandte Augenlinse (Okular, A) vergrößert ein Bild des Objekts (1. Vergrößerungsstufe, (z.B. 10-fach)). Das vom Okular vergrößerte Bild wird von der dem Objekt zugewandten Feldlinse, dem Objektiv, erzeugt (B). Das Objektiv bildet die 2. Vergrößerungsstufe. Moderne Mikroskope sind meist mit mehreren Objektiven ausgestattet, zwischen denen mit einem Revolver-Mechanismus gewechselt werden kann. Die Objektive haben typischerweise Vergrößerungen zwischen 2- und 12-fach. Die Gesamt-Vergrößerung des Mikroskops errechnet sich durch Multiplikation der Vergrößerungen der 1. und der 2. Vergrößerungsstufe.

Das Objekt ist bei Durchlicht-Mikroskopen üblicherweise auf dem gläsernen Objektträger (C) aufgebracht. Damit das Licht der unterhalb des Objektträgers angebrachten Lichtquelle (F) das Objekt optimal ausleuchtet, haben Durchlicht-Mikroskope ein gesondertes Linsensystem (D), den sogenannten Kondensor (siehe auch Köhler-Beleuchtung). Der Objektträger ist am Objekttisch (E) befestigt. Kondensor und Objekttisch können gemeinsam zum Scharfstellen des Objekts in senkrechter Richtung verschoben werden. Als Lichtquelle alter und sehr einfacher neuer Mikroskope dient ein Spiegel (F). Sonst wird eine elektrische Lichtquelle eingesetzt.

Aufrechte, umgekehrte oder inverse Mikroskope[Bearbeiten]

Ein inverses Mikroskop lässt zwischen Kondensor und Tisch viel Raum für das Präparat

Aufrechtes Mikroskop ist eine allgemeine Bezeichnung für Mikroskope, bei denen das Objektiv von oben auf das Präparat schaut (wie in der Abbildung). Im Gegensatz dazu ist bei einem umgekehrten oder inversen Mikroskop das Objektiv unter dem Tisch angebracht, der vergrößerte Raum zwischen Beleuchtungseinheit und Tisch erlaubt das Mikroskopieren von Präparaten mit größerer Dicke (einige bis über 10 Zentimeter) und durch die Wände von Laborgefäßen hindurch. Mikroskope mit dieser Bauform sind ein unerlässliches Instrument für Untersuchungen an lebenden Zellen in Kulturgefäßen (Zellkultur), z.B. in der Patch-Clamp-Technik sowie bei Einsatz von Mikromanipulatoren, die von oben an das Präparat herangeführt werden.

Leistungsfähigkeit[Bearbeiten]

Bei optimaler Gerätebeschaffenheit und der Verwendung von Ölimmersion lassen sich mit klassischer Lichtmikroskopie, wie sie im Wesentlichen im 19. Jahrhundert entwickelt wurde, bestenfalls Objekte voneinander unterscheiden, die 0,2 bis 0,3 µm oder weiter voneinander entfernt sind.[3] Die erzielbare Auflösung ist dabei nicht durch die verfügbare Qualität der Geräte, sondern durch physikalische Gesetze bestimmt. Sie hängt unter anderem von der Wellenlänge des verwendeten Lichts ab.

Verfahren, die seit den 1990er Jahren entwickelt wurden und auf nicht-linearen Farbstoffeigenschaften beruhen, erlauben auch eine Auflösung unter diesem so genannten Abbe-Limit.

Physikalische Prinzipien der Lichtmikroskopie – Übersicht[Bearbeiten]

Die folgenden neueren lichtmikroskopischen Entwicklungen erlauben eine Auflösung jenseits des klassischen Abbe-Limits

Durchlichtmikroskop[Bearbeiten]

Vereinfachter Strahlengang im Mikroskop

Das grundlegende Ziel eines Lichtmikroskopes (griechisch: μικρόν (micron) = klein+ σκοπεῖν (skopein) = etwas ansehen) ist die Erhöhung der Vergrößerung bzw. der Auflösung von Details die mit dem bloßen Auge nicht wahrgenommen werden können. Der Grund hierfür sind physiologische Begrenzungen des menschlichen Sehapparates, welcher nur über einen begrenzten Brechkraft-Bereich verfügt und deshalb nicht in beliebig kleinen Abständen zum Objekt scharf abbilden kann. Weitere Beschränkung sind die unterschiedlichen Aberrationen, die das kleinste abbildbare Volumen begrenzen. Im Prinzip wird das Objekt vergrößert abgebildet (Bildvergrößerung) und dieses dann mit einer Lupe betrachtet, um dieses aus einer größeren „Nähe“ als es mit dem Auge möglich wäre betrachten zu können. Im letzten Schritt werden die Winkel vergrößert (Winkelvergrößerung). Lichtmikroskope werden häufig nur mit den Abkürzungsbuchstaben „LM“ angegeben.

Prinzip des zusammengesetzten Mikroskops[Bearbeiten]

Das vom Objekt kommende Licht wird durch eine Kombination von mindestens zwei Linsensystemen, dem Objektiv (3) und dem Okular (1), optisch abgebildet. Dabei wird vom Objekt durch das Objektiv ein reelles Zwischenbild erzeugt, welches durch das Okular analog zur Lupe vergrößert betrachtet wird. Die Vergrößerung des Mikroskops ist das Produkt aus Objektivvergrößerung und Okularvergrößerung. Die Objektive sind in der Regel wechselbar, so dass die Vergrößerung der jeweiligen Aufgabenstellung angepasst wird. Der Objektivrevolver (2) ermöglicht den schnellen Objektivwechsel durch Drehen des jeweils gewünschten Objektivs in den Strahlengang. Die Fokussierung erfolgt durch Höhenverstellung des Tubus oder des Objekttischs. Dieser ist häufig auch mit einem verschiebbaren Objekthalter ausgestattet, um das beobachtete Objekt vor dem Objektiv zu positionieren.

Man unterscheidet die Durchlichtmikroskopie, bei der das Objekt transparent oder sehr dünn ist und von der dem Objektiv abgewandten Seite beleuchtet wird, und die Auflichtmikroskopie. Bei dieser wird durch Beleuchtung von der dem Objektiv zugewandten Seite die Oberfläche des Objekts untersucht. Bei der Auf- und Durchlichtmikroskopie unterscheidet man außer der normalen Hellfeldmikroskopie die Dunkelfeldmikroskopie und die Phasenkontrastmikroskopie.

Beleuchtungsoptik[Bearbeiten]

Die Köhlersche Beleuchtung ist die übliche Methode einer Durchlichtanordnung. Sie besteht aus folgenden Elementen:

Zum Erreichen der optimalen Leistungsfähigkeit eines Mikroskops ist eine korrekte Abstimmung der Blendenabbildung und der Objektabbildung mit einem verketteten Strahlengang nötig. Das Einstellen dieser Abstimmung wird auch als Köhlern bezeichnet. Bei der Köhlerschen Beleuchtung bildet der Kollektor die Lichtquelle in die Aperturblende ab und gleichzeitig der Kondensor die Leuchtfeldblende in das Objekt.

Auflösung[Bearbeiten]

Hauptartikel: Auflösung (Mikroskopie)

Zur Vergrößerung des Mikroskops siehe: Vergrößerung (Optik)

Mikroskopobjektiv: Achromat mit Numerischer Apertur 0,8 und 60-facher Vergrößerung
Mikroskopobjektiv im Querschnitt: Achromat mit Numerischer Apertur 0,65 und 40-facher Vergrößerung

Entscheidend für die Fähigkeit eines Mikroskops, Strukturen kleiner Objekte unterscheidbar abzubilden, ist (neben dem Kontrast) nicht die Vergrößerung, sondern die Auflösung. Dieser Zusammenhang ist nicht allein durch strahlenoptische Überlegung zu verstehen, sondern ergibt sich aus der Wellennatur des Lichts. Ernst Abbe erkannte als erster den entscheidenden Einfluss der Numerischen Apertur auf die Auflösung. Er gab als förderliche Vergrößerung

V_{\rm M} = 500 \ldots 1000 \cdot \mathrm{NA}

an. Dies bedeutet, dass die kleinsten vom Objektiv aufgelösten Strukturen nach der Abbildung durch das Okular im Auge noch aufgelöst werden können, also etwa unter einem Winkel von 2′ (Bogenminuten) erscheinen. Wird die Vergrößerung höher gewählt (z. B. durch ein Okular mit hoher Vergrößerung), wird das Bild des Objekts zwar noch größer dargestellt, aber es sind keine weiteren Objektdetails erkennbar. Objektive und Okulare müssen also aufeinander abgestimmt sein.

Nach den Gesetzen der Wellenoptik ist die Auflösung des Lichtmikroskops durch die Größe der Wellenlänge der Beleuchtung beschränkt, siehe Numerische Apertur.

Auflösungen jenseits des Abbe-Limits[Bearbeiten]

Vergleich des Auflösungsvermögens von konfokaler Laser-Scanning Mikroskopie (oben) und 3D-SIM-Mikroskopie (unten). Zellkernporen (anti-NPC, rot), Zellkernhülle (anti-Lamin B, grün), sowie Chromatin (DAPI, blau) wurden in einer Mauszelle simultan angefärbt. Der Maßstabsbalken entspricht 1 µm.

1971 veröffentlichten Thomas Cremer und Christoph Cremer theoretische Berechnungen über die Erzeugung eines idealen Holograms zur Überwindung der Beugungsgrenze, das ein Interferenzfeld in allen Raumrichtungen festhält, ein sogenanntes 4\pi Hologram.[4][5] Seit den 90er Jahren des 20. Jahrhunderts wurden weitere Methoden entwickelt, die eine optische Auflösung jenseits des Abbe-Limits ermöglichen. Sie basieren alle darauf, dass Abbes Theorie zwar die Größe eines mit Linsen fokussierbaren Lichtflecks begrenzt, nicht aber die möglicherweise nichtlineare Antwort von Molekülen darauf (STED und PALM). Ebenfalls gibt es die Möglichkeit, ganz auf die Fokussierung von Licht zu verzichten und sehr nah an den zu beobachtenden Objekten optische Effekte zu erzeugen. (SNOM und TIRF) Man spricht dann auch von Superauflösung.

Lokalisationsmikroskopie SPDMphymod mit Vertico-SMI[Bearbeiten]

Hauptartikel: Vertico-SMI

Die Vertico SMI/SPDMphymod-Technologie wurde von Christoph Cremer an der Universität Heidelberg entwickelt und basiert auf einer Kombination von lichtoptischen Techniken der Lokalisationsmikroskopie (SPDM, Spectral Precision Distance Microscopy) und strukturierter Beleuchtung (SMI, Spatially Modulated Illumination). Eine Besonderheit im Unterschied zu fokussierenden Techniken wie der 4Pi-Mikroskopie sind die Weitfeldaufnahmen, mit denen man ganze Zellen nanoskopisch aufnehmen kann.[6][7][8] Unter den photophysikalischen Bedingungen der Lokalisationmikroskopie SPDMphymd ist die Superauflösende Lichtmikroskopie für viele „ganz gewöhnliche“ Farbstoffmoleküle wie GFP, Fluorescein oder Alexa-Farbstoffe anwendbar. Dies erweitert die Anwendbarkeit der SPDM-Methode auf zahlreiche Gebiete der biophysikalischen, zellbiologischen und medizinischen Forschung.[9]

Stimulated emission depletion[Bearbeiten]

Hauptartikel: STED-Mikroskop

Stimulated emission depletion (STED) wurde vom Göttinger Physiker Stefan Hell und seinen Mitarbeitern entwickelt. Er erhielt für seine entsprechenden Arbeiten 2006 den Deutschen Zukunftspreis. Diese fluoreszenzbasierte Technik begrenzt die Auflösung nicht mehr durch die Lichtwellenlänge, sondern nur noch durch die Helligkeit des auf das Präparat eingestrahlten Lichts. Leica Microsystems bietet seit Oktober 2007 ein kommerzielles Gerät mit dieser Technik an.

Da die Größe von Proteinkomplexen im Bereich von 10 bis 200 nm liegt, wird diese Technik es möglicherweise erlauben, lichtmikroskopisch in molekulare Größenordnungen vorzudringen. So konnten mit STED-Mikroskopie etwa einzelne Bläschen mit Nervenbotenstoffen (synaptische Vesikel) aufgelöst werden. Anders als bei einem Elektronenmikroskop können mit diesem Verfahren theoretisch auch intakte, lebende Zellen untersucht werden.

Auch für die Herstellung kleinster elektronischer Schaltkreise ist STED möglicherweise interessant. Mit geeigneten schaltbaren Molekülen ließe sich das STED-Prinzip zum Herstellen feinster Nanostrukturen verwenden. Obwohl das Verfahren vermutlich für Massenspeicher zu langsam wäre, könnte man beliebig kleine Strukturen mit sichtbarem Licht anfertigen.

Siehe auch[Bearbeiten]

 Wikibooks: Lichtmikroskopie – Lern- und Lehrmaterialien

Weblinks[Bearbeiten]

Einzelnachweise[Bearbeiten]

  1.  Stephen Jay Gould: Die Lügensteine von Marrakesch: Vorletzte Erkundungen der Naturgeschichte. S. Fischer, Frankfurt 2003, ISBN 3-100-27813-5, S. 52–53.
  2. Computermikroskop: Die bessere Webcam, test.de, 23. Januar 2003 (online abgerufen am 26. Februar 2013).
  3. Ernst Abbe: Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der Mikroskopischen Wahrnehmung. In: Archiv für Mikroskopische Anatomie 9, 1873, S. 413-468.
  4. Deutsche Patentschrift DE 2116521.
  5. Konstruktionsplan 1978: Konfokales Laser Scanning Fluoreszenzmikroskop mit hoher Auflösung und Schärfentiefe/4Pi Point Hologram (PDF; 83 kB).
  6.  Jürgen Reymann, David Baddeley, Manuel Gunkel, Paul Lemmer, Werner Stadter, Thibaud Jegou, Karsten Rippe, Christoph Cremer, Udo Birk: High-precision structural analysis of subnuclear complexes in fixed and live cells via spatially modulated illumination (SMI) microscopy. In: Chromosome Research. 16, Nr. 3, 2008, S. 367-382, doi:10.1007/s10577-008-1238-2, PMID 18461478.
  7.  P. Lemmer, M. Gunkel, D. Baddeley, R. Kaufmann, A. Urich, Y. Weiland, J. Reymann, P. Müller, M. Hausmann, C. Cremer: SPDM: light microscopy with single-molecule resolution at the nanoscale. In: Applied Physics B. 93, Nr. 1, 2008, S. 1–12, doi:10.1007/s00340-008-3152-x.
  8.  David Baddeley, Claudia Batram, Yanina Weiland, Christoph Cremer, Udo J. Birk: Nanostructure analysis using spatially modulated illumination microscopy. In: Nat. Protocols. 2, Nr. 10, September 2007, S. 2640–2646, doi:10.1038/nprot.2007.399.
  9.  Manuel Gunkel, Fabian Erdel, Karsten Rippe, Paul Lemmer, Rainer Kaufmann, Christoph Hörmann, Roman Amberger, Christoph Cremer: Dual color localization microscopy of cellular nanostructures. In: Biotechnology Journal. 4, Nr. 6, 2009, ISSN 1860-6768, S. 927–938, doi:10.1002/biot.200900005.