„Molekülmarkierung“ – Versionsunterschied

aus Wikipedia, der freien Enzyklopädie
Zur Navigation springen Zur Suche springen
Versionsgeschichte interaktiv durchsuchen
[gesichtete Version][gesichtete Version]
← Zum vorherigen VersionsunterschiedZum nächsten Versionsunterschied →
Inhalt gelöscht Inhalt hinzugefügt
VisuellWikitext
→‎DNA: + RNA
Zeile 17: Zeile 17:
Bei einem [[Label-Transfer]] wird eine spaltbare Quervernetzung mit einem Reporter zwischen zwei benachbarten Molekülen verwendet, um eine Markierung zwischen diesen Molekülen zu übertragen und dadurch deren Nachbarschaft nachzuweisen.
Bei einem [[Label-Transfer]] wird eine spaltbare Quervernetzung mit einem Reporter zwischen zwei benachbarten Molekülen verwendet, um eine Markierung zwischen diesen Molekülen zu übertragen und dadurch deren Nachbarschaft nachzuweisen.


=== DNA ===
=== Nukleinsäuren ===
[[DNA]] besitzt im Vergleich zu Proteinen eine geringere Anzahl verfügbarer funktioneller Gruppen. Die Phosphatgruppe kann durch radioaktives Phosphat mit einem <sup>32</sup>Phosphoratom im Zuge eines [[Random Priming]], einer [[Nick translation]], einer [[DNA-Synthese]] (per Phosphoramidit-Synthese) oder durch [[Biosynthese]] mit radioaktivem Phosphat markiert werden. Durch eine [[Polymerasekettenreaktion]] kann DNA mit unnatürlichen [[Nukleotid]]analoga markiert werden (z. B. [[BrdU]]). Die Aminogruppe des Adenins kann mit Succinimidylestern oder PITC reagieren. Im Zuge einer [[In-situ-Hybridisierung]] wird DNA mit [[Hybridisierungssonde]]n markiert.
[[DNA]] besitzt im Vergleich zu Proteinen eine geringere Anzahl verfügbarer funktioneller Gruppen aufgrund der vier verwendeten [[Nukleotid]]e. Die Phosphatgruppe kann durch radioaktives Phosphat mit einem <sup>32</sup>Phosphoratom im Zuge eines [[Random Priming]], einer [[Nick translation]], einer [[DNA-Synthese]] (per Phosphoramidit-Synthese) oder durch [[Biosynthese]] mit radioaktivem Phosphat markiert werden. Durch eine [[Polymerasekettenreaktion]] kann DNA mit unnatürlichen [[Nukleotid]]analoga markiert werden (z. B. [[BrdU]], [[Digoxigenin]]-[[dUTP]], Hydroxymethyl-[[dCTP]], fluoreszente Nukleotide in der [[DNA-Sequenzierung]] nach Sänger). Die Aminogruppe des Adenins kann mit Succinimidylestern oder Isothiocyanaten reagieren. Im Zuge einer [[In-situ-Hybridisierung]] wird DNA mit [[Hybridisierungssonde]]n markiert.

[[RNA]] kann biosynthetisch mit RNA-Tags versehen werden. Hierbei werden meist DNA-Sequenzen von [[Aptamer]]en in das [[Offenes Leseraster|offene Leseraster]] [[Klonierung|kloniert]]. Nach einer Erzeugung der RNA mit dem RNA-Tag durch [[Transkription (Biologie)|Transkription]] bilden sich [[Sekundärstruktur]]en, die selektiv an [[Dextran]], [[Streptavidin]] oder [[Farbstoff]]e binden.<ref>S. C. Walker, F. H. Scott, C. Srisawat, D. R. Engelke: ''RNA affinity tags for the rapid purification and investigation of RNAs and RNA-protein complexes.'' In: ''Methods in molecular biology (Clifton, N.J.).'' Band 488, 2008, S.&nbsp;23–40, {{ISSN|1064-3745}}. {{DOI|10.1007/978-1-60327-475-3_3}}. PMID 18982282. {{PMC|2807123}}.</ref><ref>J. S. Paige, K. Y. Wu, S. R. Jaffrey: ''RNA mimics of green fluorescent protein.'' In: ''Science (New York, N.Y.).'' Band 333, Nummer 6042, Juli 2011, S.&nbsp;642–646, {{ISSN|1095-9203}}. {{DOI|10.1126/science.1207339}}. PMID 21798953. {{PMC|3314379}}.</ref>


=== Kohlenhydrate ===
=== Kohlenhydrate ===

Version vom 19. Januar 2014, 01:57 Uhr

Die Molekülmarkierung (englisch labelling, labeling, tagging) ist eine biochemische Methode zur selektiven Bindung eines Atoms oder Moleküls an ein Molekül. Die Markierung wird zur weiteren Verfolgung des markierten Moleküls verwendet.

Eigenschaften

Moleküle können je nach ihren charakteristischen funktionellen Gruppen mit einer selektiv bindenden Markierung versehen werden. Die Markierung kann dabei kovalent oder ionisch (über Chelatoren wie DTPA oder chelierende Peptide wie das His-Tag)[1] gebunden sein. Als Signalmoleküle (Reportermoleküle) innerhalb der Markierungen werden Nuklide (radioaktive und nicht radioaktive), Biotin, Reporterenzyme, Oligonukleotide, Fluorophore oder bei Proteinen auch Protein-Tags eingesetzt.[2][3][4][5] Nuklide können direkt an das zu markierende Molekül gekoppelt werden oder in einer Biosynthese durch Umbau markierter Vorläufersubstanzen erzeugt werden (metabolische Markierung), während Protein-Tags als Fusionsprotein während der Translation N-terminal oder C-terminal an das Protein angehängt werden. Die übrigen Reporter werden meist über selektiv reaktive Kopplungsgruppen an das zu markierende Molekül gekoppelt.

Die Markierung kann auch teilweise metabolisch und teilweise synthetisch erfolgen, wie bei der bioorthogonalen Markierung.[6][7] Dabei werden Vorläufersubstanzen mit einer reaktiven Gruppe für eine metabolische Markierung verwendet, die anschließend nach einer Proteinreinigung zur nachträglichen chemischen Kopplung des Reporters verwendet wird, z. B. per Click-Chemie,[8] per Snap-Tag oder per Staudinger-Reaktion.[9][10]

Zur Verfolgung des zeitlichen Verlaufs eines markierten Moleküls im Kontext des Metabolismus wird die Puls-Markierung (englisch pulse labeling) verwendet. Bei der Puls-Markierung wird der Markierungszeitraum zeitlich begrenzt, wodurch die Markierung des Moleküls und seiner Metaboliten genauer eingrenzbar ist und der Wechsel der Markierung auf einzelne nachfolgende Stoffe in einem Stoffwechselweg beobachtet werden kann. Die Verfolgung mehrerer Metabolite gleichzeitig wird auch als metabolische Fluxanalyse (englisch metabolic flux analysis) bezeichnet.[11][12][13][14]

Proteine

Im Gegensatz zu Kohlenhydraten und Nukleinsäuren kommen unter den Biomolekülen manche Strukturmotive aufgrund der verschiedenen enthaltenen Aminosäuren nur bei Proteinen vor, z. B. Sulfhydryl-enthaltende Cysteine oder Phenolreste in Tyrosinen. Diese können mit entsprechenden Kopplungsreagenzien selektiv markiert werden. Cysteine können mit Maleimidestern, Disulfiden oder Iodacetamid selektiv reagieren. Aminosäuren mit primären Aminen an der Seitenkette wie Lysin können durch Succinimidester (N-Hydroxysuccinimid-, Sulfosuccinimid- oder andere Succinimidylester) oder bestimmte Isothiocyanate wie PITC oder FITC markiert werden. Einige Proteaseinhibitoren führen zu einer selektiven Markierung von Proteinen. Auf dem gleichen Prinzip wie die Markierung basiert auch die Vernetzung. Fixierungsmittel führen meist zu einer Quervernetzung verschiedener Aminosäuren. Bei einer Immunmarkierung mit Immunkonjugaten basiert die selektive Bindung der Markierung auf Antikörpern, daneben ist der Antikörper selbst mit einem Reporter markiert. In der DIGE werden unterschiedlich markierte Proben gemeinsam per SDS-PAGE oder 2D-Gelelektrophorese aufgetrennt.[15][16][17]

Im Zuge einer Isotopenmarkierung werden Moleküle mit radioaktiven Isotopen (z. B. 3H, 11C, 14C, 13N, 15O, 18F, 32P, 33P, 35S, 125I, 131I) markiert. Die Markierungen mit Isotopen (oder Isobaren) besitzen unter den Markierungen die kleinsten Änderungen der Molmasse und führen daher zu einer vergleichsweise geringeren Änderung der Proteinstruktur und der biologischen Aktivität, sind jedoch von erhöhten Sicherheitsmaßnahmen und Anforderungen an das Sicherheitslabor begleitet. Die Isotopenmarkierung erfolgt entweder chemisch oder biosynthetisch durch Fütterung von Zellkulturen oder Versuchstieren mit markierten Vorläufermolekülen. Durch eine Radioiodierung können Tyrosine mit radioaktivem Iod markiert werden.[18] Phosphorylierungen von Serin, Threonin und Tyrosin werden meist enzymatisch mit geeigneten Proteinkinasen und radioaktivem Phosphor-haltigem Adenosintriphosphat durchgeführt.[19] Eine radioaktiv markierte Prenylierung kann mit 3H-Mevalonsäure durchgeführt werden.[20] Daneben wird im Zuge einer Prenylierung der C-Terminus methyliert, der durch 3H-markiertes S-Adenosyl-Methionin reversibel radioaktiv markiert werden kann.[20] Sulfatierungen können mit 35S-markiertem Sulfat nachgewiesen werden.[20] Wasserstoffatome können durch eine Deuterierung mit Deuterium ausgetauscht werden. Die Markierung mit radioaktiven Isotopen erlaubt eine Verfolgung per Autoradiographie, per Szintillationszähler oder per Positronen-Emissions-Tomographie.[21][22] In der Massenspektrometrie wird die Isobarenmarkierung zur Unterscheidung verschiedener Proben verwendet.[23][24] Neben den üblicherweise verwendeten Nukliden 1Wasserstoff oder 15Stickstoff werden in der NMR-Spektroskopie Markierungen mit 13Kohlenstoff oder 19Fluor verwendet.[25][26]

Auch photoreaktive Moleküle (z. B. Arylazide, Diazirine) können als reaktive Gruppe einer Markierung bei Proteinen verwendet werden, um den Zeitpunkt der Vernetzung besser steuern zu können, da die Vernetzung erst mit UV-Bestrahlung ausgelöst wird. Aufgrund der geringeren Selektivität der radikalischen Vernetzer wird oftmals die Funktionsfähigkeit des Proteins durch Reaktion des radikalischen Vernetzers mit wichtigen Funktionen (z. B. ein aktives Zentrum oder eine Bindungsstelle) gemindert.[27] Daher werden photoreaktive Markierungen meistens eingesetzt, wenn keine oder nur eine Amin- oder Sulfhydrylgruppe zur selektiven Vernetzung zur Verfügung steht oder eine anschließende Funktionsfähigkeit unerheblich ist. Es existieren auch photoreaktive Diazirin-enthaltende Analoga der Aminosäuren Leucin, Methionin und p-Benzoyl-Phenylalanin, die bereits während der Translation in vivo in das Protein eingebaut werden können.[28]

Bei einem Label-Transfer wird eine spaltbare Quervernetzung mit einem Reporter zwischen zwei benachbarten Molekülen verwendet, um eine Markierung zwischen diesen Molekülen zu übertragen und dadurch deren Nachbarschaft nachzuweisen.

Nukleinsäuren

DNA besitzt im Vergleich zu Proteinen eine geringere Anzahl verfügbarer funktioneller Gruppen aufgrund der vier verwendeten Nukleotide. Die Phosphatgruppe kann durch radioaktives Phosphat mit einem 32Phosphoratom im Zuge eines Random Priming, einer Nick translation, einer DNA-Synthese (per Phosphoramidit-Synthese) oder durch Biosynthese mit radioaktivem Phosphat markiert werden. Durch eine Polymerasekettenreaktion kann DNA mit unnatürlichen Nukleotidanaloga markiert werden (z. B. BrdU, Digoxigenin-dUTP, Hydroxymethyl-dCTP, fluoreszente Nukleotide in der DNA-Sequenzierung nach Sänger). Die Aminogruppe des Adenins kann mit Succinimidylestern oder Isothiocyanaten reagieren. Im Zuge einer In-situ-Hybridisierung wird DNA mit Hybridisierungssonden markiert.

RNA kann biosynthetisch mit RNA-Tags versehen werden. Hierbei werden meist DNA-Sequenzen von Aptameren in das offene Leseraster kloniert. Nach einer Erzeugung der RNA mit dem RNA-Tag durch Transkription bilden sich Sekundärstrukturen, die selektiv an Dextran, Streptavidin oder Farbstoffe binden.[29][30]

Kohlenhydrate

Markierte Kohlenhydrate werden meist durch bioorthogonale Markierung erzeugt oder die Kohlenhydrate werden indirekt über Lektine markiert.[31]

Literatur

Einzelnachweise

  1. ↑ G. Licini, P. Scrimin: Metal-ion-binding peptides: from catalysis to protein tagging. In: Angewandte Chemie (International ed. in English). Band 42, Nummer 38, Oktober 2003, S. 4572–4575, ISSN 1433-7851. doi:10.1002/anie.200301668. PMID 14533147.
  2. ↑ M. J. Hinner, K. Johnsson: How to obtain labeled proteins and what to do with them. In: Current opinion in biotechnology. Band 21, Nummer 6, Dezember 2010, S. 766–776, ISSN 1879-0429. doi:10.1016/j.copbio.2010.09.011. PMID 21030243.
  3. ↑ R. Wombacher, V. W. Cornish: Chemical tags: applications in live cell fluorescence imaging. In: Journal of biophotonics. Band 4, Nummer 6, Juni 2011, S. 391–402, ISSN 1864-0648. doi:10.1002/jbio.201100018. PMID 21567974.
  4. ↑ H. M. O'Hare, K. Johnsson, A. Gautier: Chemical probes shed light on protein function. In: Current opinion in structural biology. Band 17, Nummer 4, August 2007, S. 488–494, ISSN 0959-440X. doi:10.1016/j.sbi.2007.07.005. PMID 17851069.
  5. ↑ L. W. Miller, V. W. Cornish: Selective chemical labeling of proteins in living cells. In: Current opinion in chemical biology. Band 9, Nummer 1, Februar 2005, S. 56–61, ISSN 1367-5931. doi:10.1016/j.cbpa.2004.12.007. PMID 15701454.
  6. ↑ J. A. Prescher, D. H. Dube, C. R. Bertozzi: Chemical remodelling of cell surfaces in living animals. In: Nature. Band 430, Nummer 7002, August 2004, S. 873–877, ISSN 1476-4687. doi:10.1038/nature02791. PMID 15318217.
  7. ↑ J. A. Prescher, C. R. Bertozzi: Chemistry in living systems. In: Nature chemical biology. Band 1, Nummer 1, Juni 2005, S. 13–21, ISSN 1552-4450. doi:10.1038/nchembio0605-13. PMID 16407987.
  8. ↑ H. C. Kolb, M. G. Finn, K. B. Sharpless: Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions. In: Angewandte Chemie (International ed. in English). Band 40, Nummer 11, Juni 2001, S. 2004–2021, ISSN 1521-3773. PMID 11433435.
  9. ↑ E. Saxon, C. R. Bertozzi: Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction. In: Science (New York, N.Y.). Band 287, Nummer 5460, März 2000, S. 2007–2010, ISSN 0036-8075. PMID 10720325.
  10. ↑ N. J. Agard, J. M. Baskin, J. A. Prescher, A. Lo, C. R. Bertozzi: A comparative study of bioorthogonal reactions with azides. In: ACS chemical biology. Band 1, Nummer 10, November 2006, S. 644–648, ISSN 1554-8937. PMID 17175580.
  11. ↑ J. O'Grady, J. Schwender, Y. Shachar-Hill, J. A. Morgan: Metabolic cartography: experimental quantification of metabolic fluxes from isotopic labelling studies. In: Journal of experimental botany. Band 63, Nummer 6, März 2012, S. 2293–2308, ISSN 1460-2431. doi:10.1093/jxb/ers032. PMID 22371075. PDF.
  12. ↑ M. A. Orman, F. Berthiaume, I. P. Androulakis, M. G. Ierapetritou: Advanced stoichiometric analysis of metabolic networks of mammalian systems. In: Critical reviews in biomedical engineering. Band 39, Nummer 6, 2011, S. 511–534, ISSN 0278-940X. PMID 22196224. PMC 3634616 (freier Volltext).
  13. ↑ S. B. Crown, M. R. Antoniewicz: Parallel labeling experiments and metabolic flux analysis: Past, present and future methodologies. In: Metabolic engineering. Band 16, März 2013, S. 21–32, ISSN 1096-7184. doi:10.1016/j.ymben.2012.11.010. PMID 23246523.
  14. ↑ X. Chen, Y. Shachar-Hill: Insights into metabolic efficiency from flux analysis. In: Journal of experimental botany. Band 63, Nummer 6, März 2012, S. 2343–2351, ISSN 1460-2431. doi:10.1093/jxb/ers057. PMID 22378949. PDF.
  15. ↑ M. M. Shaw, B. M. Riederer: Sample preparation for two-dimensional gel electrophoresis. In: Proteomics. Band 3, Nummer 8, August 2003, S. 1408–1417, ISSN 1615-9853. doi:10.1002/pmic.200300471. PMID 12923765.
  16. ↑ J. F. Timms, R. Cramer: Difference gel electrophoresis. In: Proteomics. Band 8, Nummer 23–24, Dezember 2008, S. 4886–4897, ISSN 1615-9861. doi:10.1002/pmic.200800298. PMID 19003860.
  17. ↑ B. M. Riederer: Non-covalent and covalent protein labeling in two-dimensional gel electrophoresis. In: Journal of proteomics. Band 71, Nummer 2, Juli 2008, S. 231–244, ISSN 1874-3919. doi:10.1016/j.jprot.2008.05.001. PMID 18556257.
  18. ↑ S. Caplan, M. Baniyash: Radioiodination of cellular proteins. In: Current protocols in cell biology / editorial board, Juan S. Bonifacino ... [et al.]. Chapter 7, August 2002, S. Unit 7.10, ISSN 1934-2616. doi:10.1002/0471143030.cb0710s15. PMID 18228409.
  19. ↑ M. Sunbul, J. Yin: Site specific protein labeling by enzymatic posttranslational modification. In: Organic & biomolecular chemistry. Band 7, Nummer 17, September 2009, S. 3361–3371, ISSN 1477-0539. doi:10.1039/b908687k. PMID 19675886.
  20. ↑ a b c s. Bonifacino
  21. ↑ V. Tolmachev, A. Orlova: Influence of labelling methods on biodistribution and imaging properties of radiolabelled peptides for visualisation of molecular therapeutic targets. In: Current medicinal chemistry. Band 17, Nummer 24, 2010, S. 2636–2655, ISSN 1875-533X. PMID 20491631.
  22. ↑ V. Tolmachev, S. Stone-Elander: Radiolabelled proteins for positron emission tomography: Pros and cons of labelling methods. In: Biochimica et biophysica acta. Band 1800, Nummer 5, Mai 2010, S. 487–510, ISSN 0006-3002. doi:10.1016/j.bbagen.2010.02.002. PMID 20153401.
  23. ↑ K. M. Coombs: Quantitative proteomics of complex mixtures. In: Expert review of proteomics. Band 8, Nummer 5, Oktober 2011, S. 659–677, ISSN 1744-8387. doi:10.1586/epr.11.55. PMID 21999835.
  24. ↑ Y. Xu, S. Matthews: TROSY NMR spectroscopy of large soluble proteins. In: Topics in current chemistry. Band 335, 2013, S. 97–119, ISSN 0340-1022. doi:10.1007/128_2011_228. PMID 21928013.
  25. ↑ A. Audhya, A. Desai: Proteomics in Caenorhabditis elegans. In: Briefings in functional genomics & proteomics. Band 7, Nummer 3, Mai 2008, S. 205–210, ISSN 1477-4062. doi:10.1093/bfgp/eln014. PMID 18372286.
  26. ↑ S. Mizukami: Development of molecular imaging tools to investigate protein functions by chemical probe design. In: Chemical & pharmaceutical bulletin. Band 59, Nummer 12, 2011, S. 1435–1446, ISSN 1347-5223. PMID 22130363.
  27. ↑ J. Roeser, R. Bischoff, A. P. Bruins, H. P. Permentier: Oxidative protein labeling in mass-spectrometry-based proteomics. In: Analytical and bioanalytical chemistry. Band 397, Nummer 8, August 2010, S. 3441–3455, ISSN 1618-2650. doi:10.1007/s00216-010-3471-8. PMID 20155254. PMC 2911539 (freier Volltext).
  28. ↑ M. Suchanek, A. Radzikowska, C. Thiele: Photo-leucine and photo-methionine allow identification of protein–protein interactions in living cells. In: Nature Methods. 2. Jahrgang, Nr. 4, 2005, S. 261–268, doi:10.1038/nmeth752, PMID 15782218.
  29. ↑ S. C. Walker, F. H. Scott, C. Srisawat, D. R. Engelke: RNA affinity tags for the rapid purification and investigation of RNAs and RNA-protein complexes. In: Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). Band 488, 2008, S. 23–40, ISSN 1064-3745. doi:10.1007/978-1-60327-475-3_3. PMID 18982282. PMC 2807123 (freier Volltext).
  30. ↑ J. S. Paige, K. Y. Wu, S. R. Jaffrey: RNA mimics of green fluorescent protein. In: Science (New York, N.Y.). Band 333, Nummer 6042, Juli 2011, S. 642–646, ISSN 1095-9203. doi:10.1126/science.1207339. PMID 21798953. PMC 3314379 (freier Volltext).
  31. ↑ J. A. Prescher, C. R. Bertozzi: Chemical technologies for probing glycans. In: Cell. Band 126, Nummer 5, September 2006, S. 851–854, ISSN 0092-8674. doi:10.1016/j.cell.2006.08.017. PMID 16959565.
Abgerufen von „https://de.wikipedia.org/w/index.php?title=Molekülmarkierung&oldid=126618754“