Denaturierung (Biochemie)
Denaturierung bezeichnet eine strukturelle Veränderung von Biomolekülen wie Proteinen (Eiweiße) oder Desoxyribonukleinsäure (DNS), die in den meisten Fällen mit einem Verlust der biologischen Funktion dieser Moleküle verbunden ist, obgleich deren Primärstruktur unverändert bleibt. Eine Denaturierung kann auf physikalische oder auf chemische Einflüsse zurückzuführen sein.
Prinzip
Äußere Einflüsse können Strukturveränderungen in Biopolymeren wie Proteinen oder Nukleinsäuren hervorrufen. Bei der Denaturierung eines Proteins verändert sich die Sekundär- und die Tertiärstruktur (und damit eventuell auch die Quartärstruktur), ohne dass sich die Reihenfolge der Aminosäuren ändert, dessen Primärstruktur. Das Protein verliert jedoch dabei seine ursprüngliche Faltungsform, die auch als native Konfiguration oder Konformation der Polypeptidkette bezeichnet wird. Dieser Vorgang kann irreversibel (unumkehrbar) oder reversibel (umkehrbar) sein. Der Umkehrvorgang einer Denaturierung heißt auch Renaturierung.[1]
Solche reversiblen Veränderungen der Molekülstruktur liegen beispielsweise bei der Hitzedenaturierung von DNA vor, wenn diese durch Erhitzen in Einzelstränge aufgebrochen wird – etwa für eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) – und anschließend wieder abkühlt. Dagegen kann nach einer irreversiblen Veränderung der Molekülstruktur der ursprüngliche räumliche Aufbau des Moleküls nicht wiederhergestellt werden. Solche Veränderungen erfährt zum Beispiel ein Frühstücksei beim Kochen, das weder durch Abkühlen in den Vorzustand überführbar ist, wenn es erst einmal ein „hartes Ei“ geworden ist, noch durch weiteres Kochen. Die Denaturierung von Proteinen führt in der Regel dazu, dass das Molekül inaktiviert wird, was heißt, dass es seine biologische Funktion kaum noch oder gar nicht mehr erfüllen kann.
Allen Denaturierungsvorgängen ist gemeinsam, dass kovalente Bindungen nicht gespalten werden (außer den Disulfid-Brücken in Proteinen). Die Kettenstruktur und damit die Abfolge der Bausteine als Primärstruktur bleibt also erhalten.
Doch werden durch Energiezufuhr einzelne Bausteine, Nukleotide und Aminosäuren oder auch die ganze Molekülkette so sehr ins Schwingen gebracht, dass andere bindend wirkende Kräfte (ionische, polare und Van-der-Waals-Wechselwirkungen, Wasserstoffbrückenbindungen, hydrophobe Effekte) zwischen verschiedenen Bereichen der Molekülkette aufgehoben und solche Bindungen gelöst werden. Disulfidbrücken werden meistens durch Reduktion mit Sulfhydrylen gespalten.
Denaturierung durch physikalische Einflüsse
Die häufigsten Denaturierungen unter physikalischem Einfluss sind die Hitzedenaturierung und die Strahlungsdenaturierung. Physikalisch kann Denaturierung daneben auch durch hohen Druck, starkes Rühren, Schütteln, durch Ultraschalleinwirkung und durch Grenzflächenabsorption hervorgerufen werden.[2]
Hitzedenaturierung
Die Wärme- oder Hitzedenaturierung ist eine Art der Denaturierung, bei der eine Veränderung der Molekülstruktur durch eine Erhöhung der Temperatur herbeigeführt wird. Dabei werden durch die Hitzeeinwirkung meist keine kovalenten chemischen Bindungen gebrochen oder gebildet, die Primärstruktur bleibt also unverändert. Stattdessen werden Wasserstoffbrückenbindungen gebrochen oder neu gebildet, das sind in der Regel Bindungen zwischen Kettenabschnitten, wodurch häufig eine Veränderung der Tertiärstruktur bei Enzymen und anderen Proteinen eintritt. Dies hat meist einen Verlust der biologischen Aktivität sowie eine Abnahme der Löslichkeit zur Folge. Letzteres macht sich dann als „Ausflocken“ oder „Gerinnung“ bemerkbar. Da bei der Proteinfaltung auch hydrophobe Effekte eine Rolle spielen, wird die Denaturierung auch von der Abnahme des hydrophoben Effektes mit zunehmender Temperatur erzeugt. Eine Hitzedenaturierung kann (wie andere Denaturierungen) reversibel sein, wenn die strukturellen Veränderungen noch nicht zu tiefgreifend sind, häufig ist sie aber irreversibel (unumkehrbar). Eine Umkehrung ist jedoch unter Laborbedingungen mit Hilfe von Zentrifugen und der Zugabe von Harnstoff möglich. Durch die Auftretenden Scherkräfte können sogar Hühnereier „entkocht“ werden.[3] Die Temperatur, bei der die Denaturierung der Proteine beginnt, ist je nach Aufbau und Organismus recht unterschiedlich. Die Enzyme hyper-thermophiler Archaeen müssen Temperaturen weit über 80 °C aushalten.
Durch Autoklavieren werden Krankheitserreger auf Gegenständen mittels Denaturieren lebenswichtiger Biopolymere inaktiviert. Beim Autoklavieren muss eine Temperatur deutlich über 100 °C bei erhöhtem Druck über eine vorgegebene Zeit eingehalten werden, um sicher zu sterilisieren.
Nukleinsäuren denaturieren innerhalb eines recht engen Temperaturintervalls, auch „Schmelzpunkt“ genannt, der meist oberhalb von 80 °C liegt. Die Denaturierung ist reversibel. Durch ein Abkühlen der Nukleinsäuren lagern sich die Einzelstränge wieder zusammen. Diesen Vorgang macht man sich in der Molekularbiologie bei der Durchführung von PCR zunutze, um bestimmte Gene aus einem Organismus in vitro zu vervielfältigen: extrahierte DNA wird bei hohen Temperaturen von etwa 95 °C in einem Reaktionsgefäß geschmolzen (Denaturierung). Anschließend wird die Temperatur wieder bis zu einer bestimmten Temperatur abgesenkt. Diese Annealing-Temperatur hängt von den Primern ab und liegt normalerweise 2–3 °C unter ihrem jeweiligen Schmelzpunkt (meistens 50 bis 65 °C). Die in der Lösung enthaltenen Primer lagern sich an die DNA-Einzelstränge an (Annealing oder auch Primerhybridisierung genannt). Nun werden mit Hilfe einer Taq-Polymerase die Stränge bei einer Temperatur von 68 bis 72 °C wieder vervollständigt (Elongation). Der Zyklus von Denaturierung, Annealing und Elongation beginnt von vorn. Es werden etwa 25 bis 50 Zyklen durchgeführt. Man macht sich also die reversible Denaturierung der DNA bis zu 50-mal zunutze, um ein gesuchtes Gen eines Organismus zu vervielfältigen.
Denaturierung durch Druck
Da die Reaktionsvolumina bei der Proteinfaltung sehr klein sind, muss man in der Regel Druck von mehreren 1000 bar aufwenden um Proteine zu entfalten. Trotzdem wird in der Praxis die Hochdruckbehandlung von Lebensmitteln[4] immer bedeutsamer. Dazu werden die Lebensmittel, zumeist in Folien verpackt, in ein Druckmedium, wie z. B. Wasser, gegeben und der Druck wird auf dieses Medium ausgeübt. In diesem „nichtthermischen Verfahren“, einer Hochdruckpasteurisierung, werden unerwünschte Mikroorganismen und Enzyme inaktiviert und die Lebensmittel haltbar gemacht. Qualitätsverluste, wie bei der Anwendung von Hitze, werden dabei vermieden.
Generell gilt, dass durch Druck die Tertiär- und Quartärstruktur der Proteine beeinflusst wird, während die Sekundärstruktur kaum verändert werden kann.
Denaturierung durch energiereiche Strahlung
Wie die Übertragung von Energie mittels Infrarotlicht kann auch jede andere Energieübertragung, zum Beispiel durch UV-Licht, Mikrowellen oder andere Strahlung, denaturierend wirken. Allerdings können energiereiche Strahlen wie UV-Licht, Gamma- und Röntgenstrahlen insbesondere auch mit kovalenten Bindungen besonders von Nukleinsäuren interagieren und zu DNA-Schäden wie Kettenbrüchen (Depolymerisationen) führen. Umgekehrt kann energiereiche Strahlung auch zusätzliche kovalente Bindungen (zum Beispiel Dimerisierung in Nukleinsäuren) bewirken.
Denaturierung durch chemische Einflüsse
Ursachen der Proteindenaturierung können zum Beispiel chemische Substanzen wie einige Säuren, Basen, Salze (z. B. Guanidiniumsalze), Detergentien oder Harnstoff sein.[5] Proteinstrukturen können auch durch Schwermetalle beeinflusst werden, da die Ionen Komplexstrukturen mit den Aminosäureresten bilden und so die biologisch aktive Struktur des Proteins verändern.
Säure- und Lauge-Denaturierung
Die Säuredenaturierung führt zu Ladungsverschiebungen zwischen den Molekülen und letzten Endes zum gleichen Ergebnis wie die Hitzedenaturierung, einer Umfaltung des Proteins in den unter den jeweiligen Bedingungen energetisch günstigsten Zustand. Die Säure gibt Protonen (H+) ab und verursacht damit die Ladungsänderung in der Proteinstruktur, sodass die Wasserstoffbrückenbindungen teilweise zerstört werden und die gleichen positiven Ladungen sich gegenseitig abstoßen. Zusätzlich gibt die Säure Protonen (H+) an die Carboxylatgruppe (COO−) der Aminosäuren Aspartat und Glutamat ab, sodass Carboxygruppen –COOH entstehen und deren vorherigen negativen Ladungen verschwinden. Dies führt dazu, dass keine ionischen Wechselwirkungen zwischen der Carboxygruppe und den positiven Ladungen im Protein mehr möglich sind.
Entsprechendes können Laugen bewirken, auch sie ändern die Zusammensetzung der Ionen über den pH-Wert, jedoch werden Aminogruppen von Lysin oder Arginin deprotoniert, wodurch weniger positive Ladungen im Protein vorkommen, die mit negativ geladenen Gruppen wechselwirken könnten. Zusätzlich werden Carbonsäuregruppen zu Carboxylaten deprotoniert, wodurch Wasserstoffbrückenbindungen zerstört werden können und mehr negative Ladungen im Protein auftreten, die sich gegenseitig abstoßen.
Bei der Säure- oder Laugendenaturierung kann gleichzeitig eine Hydrolyse des Proteins auftreten.
Denaturierung durch Chaotrope
Auch Salze und andere Chaotrope haben einen Einfluss auf hydrophobe Effekte und können daher eine Denaturierung hervorrufen, wobei je nach Stoff, der Einfluss auch in Richtung Renaturierung gehen kann. Man spricht dann, bezüglich der Ausfällung, auch von „Einsalzen“ und „Aussalzen“. Der relative Einfluss der die Salze bildenden Anionen und Kationen wird durch die „Hofmeister-Reihe“ beschrieben.
Denaturierung durch Detergentien
Manche ionische Tenside führen zur Denaturierung, z. B. eine einprozentige Lösung von Natriumlaurylsulfat (SDS). Bei Raumtemperatur werden bereits die meisten Proteine denaturiert. Daneben werden auch Membranlipide aus den Zellmembranen gelöst. Die SDS-Denaturierung wird z. B. in der Probenvorbereitung zur SDS-PAGE verwendet.
Denaturierung durch Ethanol
Entsprechend der Säuredenaturierung kann Ethanol oder andere wasserlösliche, organische Lösungsmittel die in Biopolymeren zur Aufrechterhaltung der Struktur erforderlichen Wasserstoffbrücken und hydrophoben Wechselwirkungen stören, indem es als polares organisches Lösungsmittel interferiert. 50- bis 70-prozentiges Ethanol denaturiert die meisten Proteine und Nukleinsäuren. Da durch das Herauslösen der Membranlipide sowie durch die Denaturierung der Raumstruktur auch die Membranproteine ihre Funktion verlieren und die betreffenden Zellen seifenblasenartig platzen, kann so mit höherprozentigen Alkoholen (z. B. Ethanol, Isopropanol) desinfiziert werden: Bakterien- und Pilzzellen werden über die Denaturierung ihrer Membranproteine und der Durchlöcherung ihrer Zellmembran irreversibel inaktiviert, entsprechend werden behüllte Viren gleichzeitig zur Denaturierung der Proteine auch ihrer Lipidhülle beraubt, in der die Andockproteine sitzen.
Denaturierung durch reines Wasser
Proteine liegen in ihrer natürlichen Umgebung in Gegenwart von anderen Proteinen, gelösten Salzen, Cofaktoren oder Metaboliten vor, die auf mehr oder weniger komplexe Weise die natürliche Proteinstruktur stabilisieren. Entfernt man Salze und andere kleinere Moleküle durch Dialyse einer Proteinlösung gegen bidestilliertes Wasser – vorzugsweise in der Kälte –, kann man oft selektive (und reversible) Denaturierung vor allem von großen Proteinen erreichen, die unter diesen Bedingungen ausgefällt werden (präzipitieren).
Denaturierung durch Modifikation und Vernetzung
Auch durch die Verwendung von Molekülmarkierungen, Fixierungsslösungen und Gerbstoffen, kovalenten Vernetzern (z. B. Formaldehyd, Paraformaldehyd oder Glutaraldehyd) und Lösungen von stabile Komplexe ausbildenden Schwermetallionen wird gelegentlich das katalytische Zentrum oder eine Bindungsstelle eines Proteins so verändert, dass manche Funktionen nicht mehr erfüllt werden. Das Protein wird hierbei nicht (wie bei der chaotropen oder pH-abhängigen Denaturierung) entfaltet, es kann dabei jedoch verändert oder in einer nicht-nativen Konformation fixiert werden und Funktionen verlieren. Bleiben notwendige Funktionen des Proteins von der Fixierung unberührt, so können durch eine Vernetzung auch andere Eigenschaften wie die biologische Halbwertszeit verändert werden. Im Zuge einer Antigendemaskierung wird versucht, die Effekte der Fixierung rückgängig zu machen.
Renaturierung
Nach der Denaturierung eines Proteins (z. B. eines Enzyms) während der Aufreinigung aus einem Proteingemisch ist zur Messung der biologischen Aktivität eine Rückkehr des Proteins in die native Form notwendig. Dies geht jedoch nur bei Proteinen, deren native Konformation zugleich den energetisch günstigsten Zustand unter isotonischen Bedingungen darstellt, nicht aber bei metastabilen Proteinen. Eine Renaturierung kann durch langsame Verdünnung des Denaturierungsmittels erreicht werden, begleitet von einer Wiederherstellung der Cofaktoren und der isotonischen Umgebung. Eine Rekonstitution kann im Anschluss erfolgen.
Abgrenzung zu anderen Veränderungen
Nicht als Denaturierung bezeichnet werden die durch Eiweiße vermittelten Strukturänderungen:
- durch Enzyme synthetisierte, umgewandelte oder abgebaute Moleküle, Aktivierungs- und Deaktivierungsreaktionen;
- Konformationsänderungen durch Chaperone oder Prionen.
Bei sehr hoher Temperatur kann es auch zur Spaltung kovalenter Bindungen und damit zu Kettenbrüchen (Depolymerisation) kommen. Solche Änderungen der Primärstruktur werden nicht zu den Denaturierungen gezählt. Ebenso können Säuren wie Laugen bei hohen Konzentrationen und Reaktionstemperaturen zur Spaltung kovalenter Bindungen führen. Durch Hydrolyse ändert sich dann die Primärstruktur. Solche Veränderungen der Primärstruktur sind gewöhnliche chemische Reaktionen und werden nicht zu den Denaturierungen gerechnet.
Ein Grenzfall ist die Spaltung von Disulfidbrücken zwischen zwei Proteinsträngen. Dabei wird zwar eine kovalente chemische Bindung gelöst, die Aminosäuresequenz in jedem einzelnen Strang bleibt jedoch erhalten, deshalb zählt eine solche reduktive Spaltung von Disulfidbrücken, welche prinzipiell reversibel ist, zu den Denaturierungen.[6]
Anwendungen
Bei Tieren findet eine Denaturierung von Proteinen im Magen statt. Die Denaturierung wird unter anderem bei der Herstellung von proteinhaltigen Lebensmitteln verwendet, z. B. beim Garen sowie bei der Herstellung von Panir oder Tofu.
In der Biochemie wird die Denaturierung zur Entfaltung von Proteinen eingesetzt, z. B. bei der SDS-PAGE oder einer Proteinsequenzierung. Weiterhin wird sie zur Inaktivierung von Enzymen bei einer DNA-Extraktion verwendet. Bei einer Bindung von Molekülen an ein Protein kann die Thermostabilität des Proteins erhöht werden. Die Veränderung der Denaturierungstemperatur eines Proteins bei einer Bindung eines anderen Moleküls kann mit einem Thermal Shift Assay gemessen werden und somit die Bindung nachgewiesen werden.
Literatur
- Friedrich Lottspeich, Haralabos Zorbas: Bioanalytik. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg 1998, ISBN 978-3827400413.
- Hubert Rehm, Thomas Letzel: Der Experimentator: Proteinbiochemie / Proteomics. 6. Auflage, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg 2009, ISBN 978-3827423122.
Weblinks
- Animation: Protein-Denaturierung
- DFG Senatskommission SKLM: Sicherheitsbewertung des Hochdruckverfahrens (PDF; 188 kB)
Einzelnachweise
- ↑ Hans-Dieter Jakubke, Hans Jeschkeit: Aminosäuren, Peptide, Proteine, Verlag Chemie, Weinheim, 402, 1982, ISBN 3-527-25892-2.
- ↑ Hans-Dieter Jakubke, Hans Jeschkeit: Aminosäuren, Peptide, Proteine, Verlag Chemie, Weinheim, 403, 1982, ISBN 3-527-25892-2.
- ↑ Yuan et al: Shear-Stress-Mediated Refolding of Proteins from Aggregates and Inclusion Bodies. In: ChemBioChem. Nr. 16, 2015, S. 393–396.
- ↑ E. Palou, A. Lopet-Malo, G. V. Barbosa-Canovas und B. G. Swanson: High Pressure Treatment in Food Preservation, Marcel Dekker, New York, 1999.
- ↑ Hans-Dieter Jakubke, Hans Jeschkeit: Aminosäuren, Peptide, Proteine, Verlag Chemie, Weinheim, 403–404, 1982, ISBN 3-527-25892-2.
- ↑ Brockhaus ABC Chemie, VEB F. A. Brockhaus Verlag Leipzig 1965, S. 274.