Restriktionsenzym
| Restriktionsenzym | ||
|---|---|---|
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— |
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| Bezeichner | ||
| Gen-Name(n) | T2; R. | |
| Enzymklassifikation | ||
| EC, Kategorie | 3.1.21.4 Endonuklease | |
| Reaktionsart | Hydrolyse | |
| Substrat | DNA | |
| Produkte | zwei DNA-Teilstücke | |
| Vorkommen | ||
| Übergeordnetes Taxon | Bakterien | |
Restriktionsenzyme, genauer auch Restriktionsendonukleasen (REN), sind Bakterien-Enzyme, mit denen DNA an bestimmten Positionen geschnitten werden kann.
REN kommen natürlich vor und werden von Bakterien zur Phagenabwehr genutzt. Die Restriktionsenzyme erkennen Fremd-DNA am fehlenden Methylierungsmuster und zerschneiden dann fremde DNA; sie treten daher im Bakterium immer zusammen mit DNA-Methyltransferasen auf, die der bakterieneigenen DNA kennzeichnende Muster aufprägen. Verfügt ein Bakterium über dieses Abwehrsystem an Restriktionsenzymen, so sind dafür mindestens drei funktionell unterscheidbare Proteinbereiche notwendig: die Restriktions-, die Methylierungs- und die Sequenzerkennungsdomäne. Diese drei Domänen können sich entweder auf nur einem Protein befinden oder auf mehrere verteilt sein.[1] In biotechnologischen Verfahren der Molekularbiologie werden die REN verwendet, um DNA-Moleküle definiert zu zerlegen. Daher werden diese Enzyme auch als „molekulare Scheren“ bezeichnet. Um Schnittenden wieder zusammenzufügen, werden Ligasen benutzt.
Jede Restriktionsendonuklease erkennt eine spezifische DNA-Basensequenz. Die Spezifizität ist jedoch nicht in jedem Fall perfekt, Aktivitäten außerhalb der Spezifikation nennt man Star-Aktivität.
Die Positionen der Schnittstellen einzelner Restriktionsenzyme lassen sich in Restriktionskarten einer DNA darstellen. Solche Karten gibt es beispielsweise für Genome und Plasmide. Über die Länge der DNA-Fragmente, die beim Schneiden der DNA durch Restriktionsenzyme entstehen, können DNA-Abschnitte im Vergleich mit einer Restriktionskarte identifiziert werden.
Inhaltsverzeichnis |
[Bearbeiten] Geschichte
Mit der Entdeckung der Restriktionsenzyme begann die Entwicklung der Molekularbiologie. Sie ermöglichen die gezielte Herstellung von DNA-Fragmenten, die dann isoliert und zu neuen Konstruktionen zusammengesetzt werden können. Enzyme, die klebrige Enden erzeugen, sind dabei besonders hilfreich, da sich die überlappenden Enden leicht miteinander verbinden lassen. Für ihre grundlegenden Arbeiten zur „Entdeckung der Restriktionsenzyme und ihre Anwendung in der Molekulargenetik“ bekamen Werner Arber, Daniel Nathans und Hamilton Othanel Smith 1978 den Nobelpreis für Physiologie oder Medizin.[2]
Der Name „Restriktionsenzym“ stammt von dem bakteriellen Restriktions-Modifikationssystem, das der Abwehr fremder (viraler) DNA dient. Viele Bakterien besitzen stammspezifische Restriktionsendonukleasen. In der eigenen DNA sind die entsprechenden Erkennungssequenzen modifiziert (methyliert) und werden daher nicht geschnitten. Wenn Viren, die sich in den Bakterien vermehren (Bakteriophagen), ihre DNA in die Zellen injizieren, ist diese nicht methyliert und wird abgebaut. Nur Viren, die aus Bakterien desselben Stammes kommen, besitzen das richtige Methylierungsmuster und können sich weiter vermehren. Die Vermehrung der Viren ist damit auf diesen Stamm eingeschränkt oder restringiert. (Restriktion = Beschränkung).
[Bearbeiten] Klassifizierung
Nach ihren Eigenschaften unterscheidet man drei Typen:[3]
- Typ I schneidet die DNA an einer zufälligen Stelle weit von der Erkennungssequenz entfernt. Benötigt ATP und transferiert eine Methylgruppe von S-Adenosyl-Methionin.
- Typ II schneidet die DNA innerhalb oder in unmittelbarer Nähe der Erkennungssequenz. Benötigt kein ATP und hat keine Methyltransferase-Aktivität.
- Typ III schneidet die DNA etwa 20 bis 25 Basenpaare von der Erkennungssequenz entfernt. Benötigt ATP und transferiert eine Methylgruppe von S-Adenosyl-Methionin.
Im allgemeinen Sprachgebrauch wird der Begriff Restriktionsenzym meist mit den Restriktionsendonukleasen vom Typ II gleichgesetzt, da die Enzyme der Typen I und III in der Molekularbiologie nur eine geringe Bedeutung besitzen. Die Namen der Restriktionsenzyme geben ihre Herkunft an. Der erste Buchstabe steht für die Gattung, der zweite und dritte für die Art, erweitert wird es durch Namenszusätze und die chronologische Abfolge der Entdeckung. Das Enzym EcoRI ist beispielsweise das erste Enzym, das in dem Stamm Escherichia coli R(rough) gefunden wurde und SmaI das erste Enzym aus Serratia marcescens. Restriktionsenzyme unterschiedlicher Herkunft mit identischer Erkennungssequenz und gleichem Schnittmuster werden Isoschizomere genannt. Schneiden sie innerhalb derselben Sequenz, hinterlassen aber unterschiedliche Schnittenden, bezeichnet man sie als Neoschizomere.
Die Erkennungssequenzen der Restriktionsendonukleasen vom Typ II bestehen meist aus palindromischen Sequenzen von vier, sechs oder acht Basenpaaren. Der Schnitt kann gerade sein (engl. blunt ends, deut. stumpfe Enden oder glatte Enden, z. B. SmaI). Die Erkennungssequenz von SmaI lautet: 5'-CCCGGG-3'. Der Schnitt erfolgt zwischen dem C und dem G:
Der Schnitt kann auch versetzt sein (englisch sticky ends, deutsch klebrige Enden, z. B. EcoRI). Die Erkennungssequenz von EcoRI lautet: 5'-GAATTC-3'. Der Schnitt erfolgt zwischen dem G und dem A:
Klebrige Enden sind leichter ligierbar.
[Bearbeiten] Beispiele
| Enzym | Quelle | Erkennungssequenz | Schnitt | Enden |
|---|---|---|---|---|
| EcoRI | Escherichia coli |
5'-GAATTC-3' 3'-CTTAAG-5' |
5'-G AATTC-3' 3'-CTTAA G-5' |
5'–Überhang mit vier Basen (klebrige Enden) |
| BamHI | Bacillus amyloliquefaciens |
5'GGATCC 3'CCTAGG |
5'---G GATCC---3' 3'---CCTAG G---5' |
5'–Überhang mit vier Basen (klebrige Enden) |
| HindIII | Haemophilus influenzae |
5'AAGCTT 3'TTCGAA |
5'---A AGCTT---3' 3'---TTCGA A---5' |
5'–Überhang mit vier Basen (klebrige Enden) |
| HaeIII | Haemophilus aegyptius |
5'GGCC 3'CCGG |
5'---GG CC---3' 3'---CC GG---5' |
kein Überhang (glatte Enden) |
| NdeI | Neisseria denitrificans |
5'-CATATG-3' 3'-GTATAC-5' |
5'-CA TATG-3' 3'-GTAT AC-5' |
5'–Überhang mit zwei Basen (klebrige Enden) |
| SmaI | Serratia marcescens |
5'-CCCGGG-3' 3'-GGGCCC-5' |
5'-CCC GGG-3' 3'-GGG CCC-5' |
kein Überhang (glatte Enden) |
| PvuI | Proteus vulgaris |
5'-CGATCG-3' 3'-GCTAGC-5' |
5'-CGAT CG-3' 3'-GC TAGC-5' |
3'–Überhang mit zwei Basen (klebrige Enden) |
| SphI | Streptomyces phaeochromogenes |
5'-GCATGC-3' 3'-CGTACG-5' |
5'-GCATG C-3' 3'-C GTACG-5' |
3'–Überhang mit vier Basen (klebrige Enden) |
[Bearbeiten] Siehe auch
- Zinkfingernukleasen, das sind künstlich hergestellte Restriktionsenzyme
[Bearbeiten] Einzelnachweise
- ↑ http://books.google.com/books?id=vW07qhAzdfcC&lpg=PA48&ots=nC1Chnf7At&dq=restriktionsenzym%20restriktionsdom%C3%A4ne&pg=PA48#v=onepage&q&f=false Der Experimentator: Molekularbiologie/ Genomics, Cornel Mülhardt, Springer, 2008, ISBN 3827420369, Seite 48
- ↑ Informationen der Nobelstiftung zur Preisverleihung 1978 an Werner Arber, Daniel Nathans und Hamilton O. Smith (englisch)
- ↑ Roberts, R.J. et al. (2003): A nomenclature for restriction enzymes, DNA methyltransferases, homing endonucleases and their genes. In: Nucleic Acids Res. Bd. 31, S. 1805–1812. PMID 12654995 PDF
[Bearbeiten] Weblinks
- Restriktionsenzyme – Die besondere Biologie-Seite
- REBASE – umfassendste Datenbank aller bekannten Restriktionsenzyme, einschließlich Verfügbarkeit durch alle kommerziellen Hersteller (englisch)
- NEBCutter – Web-basiertes Programm zum Schneiden von DNA mit sämtlichen verfügbaren Restriktionsenzymen; beachtet Methylierungssensitivitäten; Simulation von Gelen (englisch)
- WatCut – Web-basiertes Programm zum Schneiden von DNA mit Restriktionsenzymen (englisch)
- NEB – Seite des weltweit größten kommerziellen Angebots an Restriktionsenzymen mit ausführlichen Informationen zu allen Enzymen (englisch)
- Fermentas – Seite eines kommerziellen Anbieters von Restriktionsenzymen mit detaillierten Angaben zu vielen Enzymen (englisch)
