CRISPR/Cas-Methode

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CRISPR/Cas-Komplex mit DNA

Die CRISPR/Cas-Methode (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) ist eine biochemische Methode, um DNA gezielt zu schneiden und zu verändern (Genome Editing). Gene können mit dem CRISPR/Cas-System eingefügt, entfernt oder ausgeschaltet werden,[1] auch Nukleotide in einem Gen können geändert werden.[2]

Die wissenschaftliche Grundlage zur Entwicklung der CRISPR/Cas-Methode wurde durch die Entdeckung und Erforschung der CRISPR-Sequenzen und des damit verbundenen CRISPR/Cas-Systems im Immunsystem verschiedener Bakterien und Archaea gelegt. Die erste wissenschaftliche Dokumentation zur Entwicklung und zum Einsatz der Methode wurde 2012 durch eine Arbeitsgruppe um Emmanuelle Charpentier und Jennifer Doudna veröffentlicht. Die wissenschaftliche Fachzeitschrift Science erklärte die CRISPR-Methode zum Breakthrough of the Year 2015.[3]

Eigenschaften

Die CRISPR/Cas-Methode basiert auf einem adaptiven antiviralen Abwehrmechanismus von Bakterien, dem CRISPR.[4][5] Sie wird verwendet, um DNA an einer bestimmbaren DNA-Sequenz zu schneiden. Dadurch können z. B. DNA-Sequenzen entfernt oder andere DNA-Sequenzen an dieser Stelle eingefügt werden. Das CRISPR/Cas-System kann durch Zugabe eines DNA-Oligonukleotids auch zur Veränderung von RNA verwendet werden.[6]

Cas-Proteine können als Ribonukleoproteine bestimmte RNA-Sequenzen binden. Die Endonuklease Cas9 (von englisch CRISPR-associated, veraltet auch Cas5, Csn1 oder Csx12) kann eine bestimmte RNA-Sequenz (crRNA repeat, Sequenz GUUUUAGAGCU(A/G)UG(C/U)UGUUUUG)[7] binden und in der unmittelbaren Umgebung DNA schneiden. Diese crRNA repeat-Sequenz bildet eine RNA-Sekundärstruktur und wird dann von Cas9 gebunden,[8] wodurch eine Änderung der Proteinfaltung von Cas9 erfolgt und die Ziel-DNA von der RNA gebunden wird.[9] Weiterhin ist das Vorhandensein von einem PAM-Motiv (englisch protospacer adjacent motif ‚Angrenzendes Motiv an den Protospacer‘) mit der Sequenz NGG in der Ziel-DNA für eine Aktivierung von Cas9 notwendig.[10] Der Schnitt der DNA erfolgt drei Nukleotide vor dem PAM. An der crRNA repeat-Sequenz befindet sich anschließend eine an die Ziel-DNA bindende Sequenz (crRNA spacer), beide Sequenzen werden zusammen als crRNA bezeichnet. Als zweiter Teil der crRNA dient die crRNA spacer-Sequenz in der Funktion eines variablen Adapters, welche komplementär zur Ziel-DNA ist und an die Ziel-DNA bindet. Weiterhin ist noch eine zur DNA-Sequenz analoge RNA (tracrRNA, von engl. trans-acting CRISPR RNA) notwendig. Dadurch wird die DNA gebunden und von der Endonukleasefunktion nahe der Bindungsstelle geschnitten. Die DNA-Reparatur des erzeugten Doppelstrangbruchs erfolgt durch homology-directed repair (HDR) oder durch non-homologous end joining (NHEJ).

Anpassung an die Zielsequenz

Wird an eine crRNA repeat-Sequenz anstatt der natürlich vorkommenden crRNA spacer-Sequenz eine andere, zu einer DNA-Zielsequenz komplementäre RNA-Sequenz angefügt und diese crRNA zu einer tracrRNA hinzugegeben, schneidet Cas9 die DNA nahe der geänderten Zielsequenz. Die an die Ziel-DNA bindende Sequenz besteht aus 20 Nukleotiden, von denen vor allem die 12 an das PAM angrenzenden Nukleotide für die Bindungsspezifität entscheidend sind.[11] Die beiden RNA-Stränge der crRNA und der tracrRNA können auch in einem einzelnen, teilweise selbsthybridisierenden RNA-Strang untergebracht werden (sgRNA ‚single guide RNA‘).[1] Durch das Cas9 mit den entsprechenden RNA-Sequenzen kann sequenzspezifisch doppelsträngige, teilweise komplementäre DNA geschnitten werden, wodurch gezielte Deletionen erzeugt werden können. Durch Transformation oder Transfektion von einem Vektor können Lebewesen mit dem CRISPR/Cas-System "ergänzt" werden, die es natürlicherweise nicht besitzen, z. B. manche Bakterienstämme,[12] Bäckerhefe,[13] Taufliegen,[14] Zebrabärblinge,[15] Mäuse[16] und Menschen.[17][18] Für ein Genome Editing in der Keimbahn werden als Methoden zur Einschleusung des CRISPR/Cas9 die Elektroporation und die Mikroinjektion eingesetzt. Die gleichzeitige Änderung mehrerer DNA-Zielsequenzen wird als Multiplex Genome Editing bezeichnet.

Nukleotidsubstitution

Einzelne Cytidine können durch ein Fusionsprotein aus Cas9 ohne doppelsträngige Endonuklease mit einer Cytidindeaminase in Thymidin umgewandelt werden.[19] Dadurch entsteht eine Substitutionsmutation.

Insertionen

Durch Doppelstrangbrüche kann die Häufigkeit einer homologen Rekombination deutlich erhöht werden,[20] wodurch ein sequenzspezifischer Schnitt durch Cas9 auch zum Einfügen von DNA-Sequenzen (z. B. im Zuge der Gentherapie) verwendet werden kann, sofern die anschließend einzufügende DNA an beiden Enden jeweils eine zur jeweiligen Zielsequenz überlappende Sequenz aufweist.[21]

Spezifität

Zur Minimierung unspezifischer DNA-Schnitte und der daraus folgenden Mutagenese werden verschiedene Ansätze zur Erhöhung der Spezifität untersucht, wie Proteindesign der Cas9 oder Ersatz von der Endonukleaseaktivität von Cas9 durch Kombination mit anderen Endonukleasen. Die Mutation von Asparaginsäure zu Alanin an der Position 10 in Cas9 (kurz: D10A) oder von Histidin zu Alanin an der Position 840 (H840A) inaktiviert die doppelsträngige Endonukleasefunktion des gebundenen DNA-Stranges unter Erhalt der RNA-DNA-Bindungsfunktion und einer einzelsträngigen Endonukleasefunktion.[22][23] Weiterhin wird die Spezifität durch die Affinität der RNA-DNA-Bindung an Cas9 bestimmt.[24][25][26] Durch Verwendung zweier verschiedener sgRNA, deren an die Ziel-DNA bindenden Sequenzen geringfügig versetzt sind, kann die Spezifität des Schnitts erhöht werden.[22][27] Dabei werden zwei geringfügig verschiedene Cas9-sgRNA-Komplexe mit unterschiedlicher Spezifität gebildet. Zudem entstehen durch die versetzten Einzelstrangbrüche sticky ends, die eine Insertion einer DNA mit komplementären sticky ends erleichtern. Einzelstrangbrüche werden durch die Basenexzisionsreparatur[22] und die HDR geschlossen,[28] welche weniger Mutationen als die Reparatur per NHEJ erzeugen.[22]

Typen

Es existieren mehr als 40 verschiedene Cas-Proteinfamilien.[29] Die Familien können in drei Typen eingeteilt werden.[30] Typ I, II und IIIa binden und schneiden doppelsträngige DNA, während Typ III-B einzelsträngige RNA bindet und schneidet.[31][30] Bei allen Typen erfolgt die Bildung des spacers in Bakterien durch Cas1 und Cas2.[31] Bei den Typen I-A und I-E erfolgt der DNA-Schnitt durch Cas3, während bei Typ II Cas9, bei Typ III-A Csm6 und bei Typ III-B Cmr4 den Schnitt bewirkt.[31] Die Typen I und III sind strukturell verwandt, was einen gemeinsamen Ursprung nahelegt.[30] Das helikale Protein Cas des Typs III besitzt mehrere β-hairpins, die in Abständen von sechs Nukleotiden die Doppelhelix der crRNA und der Ziel-RNA für den Schnitt auseinanderdrücken.[30]

Das Cas9 stammt meistens entweder aus Streptococcus pyogenes (SpCas9) oder Staphylococcus aureus (SaCas9), wobei die kodierende DNA-Sequenz von SaCas9 etwa 1000 Basenpaare kürzer ist.[32] Cas9 gehört zum Typ II und wird vermehrt eingesetzt, da der Proteinanteil nur aus einem Protein besteht, wodurch die Klonierung und Überexpression weniger aufwändig ist. Cas-Proteine des Typs I sind dagegen Proteinkomplexe aus mehreren kleinen Proteinen.[33]

Eine alternative Methode mit gleicher Spannbreite möglicher DNA-Zielsequenzen ist das CRISPR/Cpf1-System. Alternativ zum CRISPR/Cas-System können teilweise Transcription Activator-like Effector Nucleases und Zinkfingernukleasen verwendet werden.

Anwendungen

Verwendungsbeispiel des CRISPR/Cas-Systems in einem Plasmid
Blockade der Genexpression durch eine Cas9-Mutante (dCas9) im Zuge der CRISPRi

Das CRISPR/Cas-System kann unter anderem zum Genome Editing (Deletionen/Gen-Knockout[34] und Insertionen) und damit auch zur Gentherapie verwendet werden.[35][36] Weiterhin wird das CRISPR/Cas-System zur Entfernung der Genome von Krankheitserregern chronischer Infektionskrankheiten wie des Hepatitis-B-Virus[37] und des HIV eingesetzt.[38] Die gezielte Veränderung einzelner Gene wird bei der Charakterisierung von Onkogenen und somit zur Untersuchung der Tumorentstehung verwendet.[39]

Das CRISPR/Cas-System wird zur Untersuchung der Funktionen von teilweise unbekannten Genen eingesetzt.[40] Weiterhin wird es zur Korrektur von Mutationen bei der Erzeugung induzierter pluripotenter Stammzellen[41] und embryonalen Stammzellen verwendet.[42][43] Weitere Anwendungen werden untersucht.[44]

Mit dem CRISPR/Cas-System wurden unter anderem Bakteriophagen-resistente Bakterienstämme erzeugt, durch eine adaptive Resistenz bei Hinzufügen entsprechender RNA bei industriell wichtigen Bakterien, z. B. in der Milch- oder Weinindustrie. Durch ein mutiertes Cas ohne funktionsfähige Endonuklease (dCas9) kann ein DNA-bindendes Protein erzeugt werden, welches unter anderem analog zur RNAi zu einem Knockdown von endogenen Genen führt,[45] z. B. durch Transformation mit einem Plasmid, aus dem Cas9 und eine CRISPR-RNA transkribiert wird (CRISPRi).[46] Ebenso kann dCas9 als Fusionsprotein mit einem Aktivator an einer anderen, bestimmbaren Stelle im Genom eine Transkription eingeleitet werden. Anhand charakteristischer CRISPR-Sequenzen können CRISPR/Cas enthaltende Bakterienstämme identifiziert werden (spoligotyping). Ein grün fluoreszierendes Protein kann mit einer Cas-Mutante als Fusionsprotein zur Markierung von DNA-Sequenzen (auch repetitiver Sequenzen wie Telomere) verwendet werden.[47] Durch das CRISPR/Cas-System konnte die Herstellungszeit von Mäusen mit komplexen Genomveränderungen von bis zu zwei Jahren auf wenige Wochen verkürzt werden.[16]

Pflanzenzüchtung

Die CRISPR-Methode eröffnet Pflanzenzüchtern die Möglichkeit, Sorten von Nutzpflanzen auf eine leichtere, effizientere und flexiblere Art zu verbessern. CRISPR hat sich schnell als die bevorzugte Genome Editing-Methode unter Pflanzenwissenschaftlern durchgesetzt. Für mehrere Nutzpflanzen liegen bereits Studien vor, aber es sind noch keine CRISPR-Pflanzen auf dem Markt.[48][49][50]

Caribou Biosciences, die 2011 von Doudna und Charpentier gegründete Firma, ging eine strategische Partnerschaft mit DuPont Pioneer ein. Abhängig vom Ausgang des Patentstreits könnte DuPont daher die Rechte an der Anwendung der Methode bei wichtigen Nutzpflanzen wie Mais, Raps und Sojabohne erhalten, und Caribou für kleinere Märkte wie Obst und Gemüse. Unklar ist auch, wie sich der letztendliche Patentinhaber hinsichtlich der Lizenzierung der Methode verhalten wird.[48][49] Im September 2016 vergab das Broad-Institut eine (nicht exklusive) Lizenz zur Anwendung der Methode an Monsanto (von der Lizenz ausgeschlossen sind Gene Drive sowie Anwendungen bei Tabak und die Herstellung steriler Pflanzen).[51]

Gleichzeitig besteht weiterhin Unklarheit bezüglich der Regulierung von CRISPR-Pflanzen in verschiedenen Ländern. Die für die mögliche zukünftige kommerzielle Nutzung von CRISPR-Pflanzen in der Landwirtschaft entscheidende Frage ist, ob diese rechtlich als gentechnisch veränderte Pflanzen angesehen werden, sofern nur etwas aus dem Genom entfernt und kein Transgen eingefügt wurde, da gentechnisch veränderte Pflanzen insbesondere in der EU sehr streng reguliert sind.[48][49][50] Das US-Landwirtschaftsministerium verkündete bereits im April 2016, zwei mit der CRISPR-Methode hergestellte Pflanzen, einen nicht-bräunenden Champignon und einen Wachsmais mit verändertem Stärkegehalt nicht zu regulieren.[52] In der EU steht eine Rechtseinschätzung der Europäischen Kommission noch aus (die letztliche Deutungshoheit unterliegt dem Europäischen Gerichtshof); verschiedene Stakeholder haben sich bereits für oder gegen eine Gentechnik-Einstufung ausgesprochen.[53]

Entdeckungsgeschichte

Siehe auch: CRISPR#Entdeckung und Eigenschaften

Die Entdeckung und Erforschung der CRISPR-Sequenzen und des damit verbundenen CRISPR/Cas-Systems im Immunsystem verschiedener Bakterien und Archaea erfolgte in mehreren Schritten seit den späten 1980er Jahren. Vor allem in den frühen 2000ern wurden die Zusammenhänge zwischen den CRISPR-Sequenzen der DNA und den cas-Genen sowie ihre Bedeutung in der Immunabwehr der Bakterien identifiziert.

Im Jahr 2011 zeigte eine Arbeitsgruppe um Emmanuelle Charpentier und Jennifer Doudna, dass mithilfe des CRISPR/Cas-Systems der Mikroorganismen spezifische DNA-Ziele in vitro geschnitten werden können.[54] Sie reichten ihre wissenschaftliche Arbeit am 8. Juni 2012 bei der Fachzeitschrift Science ein, wo sie am 28. Juni veröffentlicht wurde.[1] Parallel zu ihnen arbeitete eine Arbeitsgruppe um Virginijus Šikšnys an der Methode, die bereits im April 2012 ihre Arbeit bei Cell einreichten, diese wurde jedoch abgelehnt, wenngleich die Herausgeber von Cell dem Artikel nachträglich eine große Bedeutung zuschrieben. Im Mai reichten Šikšnys und Kollegen das Papier in den Proceedings of the National Academy of Sciences (PNAS) ein, wo es am 4. September online veröffentlicht wurde.[55]

Doudna und Charpentier beschrieben, wie sich in einem Bakterium gezielt Abschnitte aus dem Erbgut entfernen lassen. Dem Neurowissenschaftler Feng Zhang vom Massachusetts Institute of Technology gelang es später, die CRISPR-Methode nicht nur im Bakterium anzuwenden, sondern für alle Zellen zu optimieren.[56] Der Leiter des Broad Institute und Vorgesetzte von Feng Zhang, Eric Lander, verfasste im Januar 2016 einen Artikel über die Anteile der verschiedenen Wissenschaftler an der Entdeckung des CRISPR/Cas-Systems,[57] der aufgrund von einseitiger Darstellung und eines vermuteten Interessenskonflikts kritisiert wurde.[58][59][60]

Charpentier und Doudna erhielten 2014 für die Entdeckung der CRISPR/Cas-Methode den mit drei Millionen Dollar für jeden Preisträger dotierten Breakthrough Prize in Life Sciences und wurden mit zahlreichen weiteren Preisen bedacht.

Patentstreit

Doudna und Charpentier (Berkeley) als auch Zhang (Broad) beantragten grundlegende Patente auf die CRISPR/Cas-Methode. Doudna und Charpentier reichten ihren Antrag beim United States Patent and Trademark Office (USPTO) im Mai 2012, Zhang im Dezember 2012 ein, Zhang beantragte ein Schnellverfahren. Zhang wurden im Mai 2014 Patentrechte zugesprochen. Das USPTO begründete diese Entscheidung damit, dass Zhang die Methode für alle Zellen tauglich machte.[56] Doudna und Charpentier reichten Klage beim USPTO gegen diese Entscheidung ein. Das Verfahren zur Klärung der Urheberschaft lief im Januar 2016 an. Broad argumentiert, Berkeley habe die Methode für zwar für Prokaryoten (Bakterien), aber nicht hinreichend für Eukaryoten (z.B. Mäusen und menschlichen Zellen) beschrieben. Berkeley argumentiert, der Schritt von Pro- zu Eukaryoten bedürfe keiner erfinderischen Tätigkeit.[61]

Auch das Europäische Patentamt (EPA) muss im Patentstreit Entscheidungen fällen. Hinsichtlich des Berkeley-Patentantrags hat das EPA bereits argumentiert, der Antrag habe die Erfindung nicht ausreichend beschrieben, da die Hervorhebung der Rolle der PAM-Sequenzen fehle. Berkeley vertritt die Ansicht, dass diese Rolle für Fachleute offensichtlich ist. Dem Broad-Institut wurden hingegen bereits mehrere Patente an der CRISPR/Cas-Methode zugesprochen, die jedoch von mehreren Seiten angefochten wurden. Kläger verweisen zum Beispiel darauf, dass Broads ursprünglicher Patentantrag einen Wissenschaftler der Rockefeller University als an der Erfindung Mitbeteiligten erwähnte, eine spätere Version des Antrags jedoch nicht.[61]

Literatur

Weblinks

Einzelnachweise

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  2. ↑ H. Ochiai: Single-Base Pair Genome Editing in Human Cells by Using Site-Specific Endonucleases. In: International journal of molecular sciences. Band 16, Nummer 9, 2015, S. 21128–21137, doi:10.3390/ijms160921128, PMID 26404258, PMC 4613245 (freier Volltext) (Review).
  3. ↑ Email Science: And Science’s Breakthrough of the Year is … In: news.sciencemag.org. 17. Dezember 2015, abgerufen am 17. Dezember 2015 (englisch).
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