„Molekülmarkierung“ – Versionsunterschied

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== Eigenschaften ==
== Eigenschaften ==
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Moleküle können je nach ihren charakteristischen [[Funktionelle Gruppe|funktionellen Gruppen]] mit einer selektiv bindenden Markierung versehen werden, die ein nachverfolgbares Signalmolekül (''Reportermolekül'') trägt. Die Markierung ist dabei meistens [[Kovalente Bindung|kovalent]] verbunden, kann bei [[Nuklid]]en aber auch [[ionische Bindung|ionisch]] und bei indirekten Nachweisen über eine Mischung aus ionischen Bindungen, [[Van-der-Waals-Bindung]]en, [[Hydrophober Effekt|hydrophoben Effekten]], [[Wasserstoffbrücke]]n und teilweise auch [[Disulfidbrücke]]n gebunden sein. Im Gegensatz zu einer Färbung mit selektiv bindenden Farbstoffen erfolgt die Markierung von Biomolekülen entweder an einzelnen Atomen oder sequenzspezifisch.
Moleküle können je nach ihren charakteristischen [[Funktionelle Gruppe|funktionellen Gruppen]] mit einer selektiv bindenden Markierung versehen werden, die ein nachverfolgbares Signalmolekül (''Reportermolekül'') trägt. Die Markierung ist dabei meistens [[Kovalente Bindung|kovalent]] verbunden, kann bei [[Nuklid]]en aber auch [[ionische Bindung|ionisch]] und bei indirekten Nachweisen über eine Mischung aus ionischen Bindungen, [[Van-der-Waals-Bindung]]en, [[Hydrophober Effekt|hydrophoben Effekten]], [[Wasserstoffbrücke]]n und teilweise auch [[Disulfidbrücke]]n gebunden sein. Im Gegensatz zu einer Färbung mit selektiv bindenden Farbstoffen erfolgt die kovalente Markierung von Biomolekülen entweder an einzelnen Atomen oder sequenzspezifisch.


Die Reportermoleküle werden meist über selektiv reaktive Kopplungsgruppen kovalent mit einem flexiblen Abstandshalter ({{enS}} ''linker'' ‚Verbinder‘) an bestimmte funktionelle Gruppen des zu markierenden Moleküls gekoppelt. Nuklide können aufgrund ihrer vergleichsweise geringen Molekülgröße auch direkt an ein anderes Molekül gekoppelt werden (ohne reaktive Kopplungsgruppe). Als Reportermoleküle innerhalb der Markierungen werden [[Nuklid]]e ([[radioaktiv]]e und nicht radioaktive), [[Biotin]], [[Reporterenzym]]e, [[Oligonukleotid]]e, [[Fluorophor]]e (im Zuge einer [[Fluoreszenzmarkierung]]) oder bei Proteinen auch [[Protein-Tag]]s eingesetzt.<ref>M. J. Hinner, K. Johnsson: ''How to obtain labeled proteins and what to do with them.'' In: ''Current opinion in biotechnology.'' Band 21, Nummer 6, Dezember 2010, S.&nbsp;766–776, {{ISSN|1879-0429}}. {{DOI|10.1016/j.copbio.2010.09.011}}. PMID 21030243.</ref><ref>R. Wombacher, V. W. Cornish: ''Chemical tags: applications in live cell fluorescence imaging.'' In: ''Journal of biophotonics.'' Band 4, Nummer 6, Juni 2011, S.&nbsp;391–402, {{ISSN|1864-0648}}. {{DOI|10.1002/jbio.201100018}}. PMID 21567974.</ref><ref>H. M. O'Hare, K. Johnsson, A. Gautier: ''Chemical probes shed light on protein function.'' In: ''Current opinion in structural biology.'' Band 17, Nummer 4, August 2007, S.&nbsp;488–494, {{ISSN|0959-440X}}. {{DOI|10.1016/j.sbi.2007.07.005}}. PMID 17851069.</ref><ref>L. W. Miller, V. W. Cornish: ''Selective chemical labeling of proteins in living cells.'' In: ''Current opinion in chemical biology.'' Band 9, Nummer 1, Februar 2005, S.&nbsp;56–61, {{ISSN|1367-5931}}. {{DOI|10.1016/j.cbpa.2004.12.007}}. PMID 15701454.</ref>
Die Reportermoleküle werden meist über selektiv reaktive Kopplungsgruppen kovalent mit einem flexiblen Abstandshalter ({{enS}} ''linker'' ‚Verbinder‘) an bestimmte funktionelle Gruppen des zu markierenden Moleküls gekoppelt. Nuklide können aufgrund ihrer vergleichsweise geringen Molekülgröße auch direkt an ein anderes Molekül gekoppelt werden (ohne reaktive Kopplungsgruppe). Als Reportermoleküle innerhalb der Markierungen werden [[Nuklid]]e ([[radioaktiv]]e und nicht radioaktive), [[Biotin]], [[Reporterenzym]]e, [[Oligonukleotid]]e, [[Fluorophor]]e (im Zuge einer [[Fluoreszenzmarkierung]]) oder bei Proteinen auch [[Protein-Tag]]s eingesetzt.<ref>M. J. Hinner, K. Johnsson: ''How to obtain labeled proteins and what to do with them.'' In: ''Current opinion in biotechnology.'' Band 21, Nummer 6, Dezember 2010, S.&nbsp;766–776, {{ISSN|1879-0429}}. {{DOI|10.1016/j.copbio.2010.09.011}}. PMID 21030243.</ref><ref>R. Wombacher, V. W. Cornish: ''Chemical tags: applications in live cell fluorescence imaging.'' In: ''Journal of biophotonics.'' Band 4, Nummer 6, Juni 2011, S.&nbsp;391–402, {{ISSN|1864-0648}}. {{DOI|10.1002/jbio.201100018}}. PMID 21567974.</ref><ref>H. M. O'Hare, K. Johnsson, A. Gautier: ''Chemical probes shed light on protein function.'' In: ''Current opinion in structural biology.'' Band 17, Nummer 4, August 2007, S.&nbsp;488–494, {{ISSN|0959-440X}}. {{DOI|10.1016/j.sbi.2007.07.005}}. PMID 17851069.</ref><ref>L. W. Miller, V. W. Cornish: ''Selective chemical labeling of proteins in living cells.'' In: ''Current opinion in chemical biology.'' Band 9, Nummer 1, Februar 2005, S.&nbsp;56–61, {{ISSN|1367-5931}}. {{DOI|10.1016/j.cbpa.2004.12.007}}. PMID 15701454.</ref>


Nuklide ([[Isotop]]e und [[Isobar (Kernphysik)|Isobare]]) können direkt an das zu markierende Molekül gekoppelt werden (''chemische Kopplung''), über eine Kopplungsgruppe angefügt werden, durch eine chemische [[Totalsynthese]] (z. B. per Peptidsynthese, per Phosphoramidit-Synthese) oder in einer [[Biosynthese]] durch den Umbau Nuklid-markierter Vorläufersubstanzen erzeugt werden (''metabolische Markierung''). Nuklide können auch ionisch gekoppelt werden, z. B. über [[Chelator]]en wie [[DTPA]] oder chelierende [[Peptid]]e wie das Protein-Tag ''His-Tag''.<ref>G. Licini, P. Scrimin: ''Metal-ion-binding peptides: from catalysis to protein tagging.'' In: ''Angewandte Chemie (International ed. in English).'' Band 42, Nummer 38, Oktober 2003, S.&nbsp;4572–4575, {{ISSN|1433-7851}}. {{DOI|10.1002/anie.200301668}}. PMID 14533147.</ref> Im Zuge einer chemischen [[Isotopenmarkierung]] oder einer metabolischen Isotopenmarkierung werden Moleküle mit radioaktiven [[Isotop]]en (z. B. <sup>3</sup>H, <sup>11</sup>C, <sup>14</sup>C, <sup>13</sup>N, <sup>15</sup>O, <sup>18</sup>F, <sup>32</sup>P, <sup>33</sup>P, <sup>35</sup>S, <sup>125</sup>I, <sup>131</sup>I) markiert.
Nuklide ([[Isotop]]e und [[Isobar (Kernphysik)|Isobare]]) können direkt an das zu markierende Molekül gekoppelt werden (''chemische Kopplung''), über eine Kopplungsgruppe angefügt werden, durch eine chemische [[Totalsynthese]] (z. B. per Peptidsynthese, per Phosphoramidit-Synthese) oder in einer [[Biosynthese]] durch den Umbau Nuklid-markierter Vorläufersubstanzen erzeugt werden (''metabolische Markierung''). Nuklide können auch ionisch gekoppelt werden, z. B. über [[Chelator]]en wie [[DTPA]] oder chelierende [[Peptid]]e wie das Protein-Tag ''His-Tag''.<ref>D. R. Reddy, L. E. Pedró Rosa, L. W. Miller: ''Luminescent trimethoprim-polyaminocarboxylate lanthanide complex conjugates for selective protein labeling and time-resolved bioassays.'' In: ''Bioconjugate chemistry.'' Band 22, Nummer 7, Juli 2011, S.&nbsp;1402–1409, {{ISSN|1520-4812}}. {{DOI|10.1021/bc200131k}}. PMID 21619068. {{PMC|3140616}}.</ref><ref>G. Licini, P. Scrimin: ''Metal-ion-binding peptides: from catalysis to protein tagging.'' In: ''Angewandte Chemie (International ed. in English).'' Band 42, Nummer 38, Oktober 2003, S.&nbsp;4572–4575, {{ISSN|1433-7851}}. {{DOI|10.1002/anie.200301668}}. PMID 14533147.</ref> Im Zuge einer chemischen [[Isotopenmarkierung]] oder einer metabolischen Isotopenmarkierung werden Moleküle mit radioaktiven [[Isotop]]en (z. B. <sup>3</sup>H, <sup>11</sup>C, <sup>14</sup>C, <sup>13</sup>N, <sup>15</sup>O, <sup>18</sup>F, <sup>32</sup>P, <sup>33</sup>P, <sup>35</sup>S, <sup>125</sup>I, <sup>131</sup>I) markiert.


Eine Markierung kann auch teilweise metabolisch und teilweise synthetisch erfolgen, wie bei der ''bioorthogonalen Markierung''.<ref>J. A. Prescher, D. H. Dube, [[Carolyn Bertozzi]]: ''Chemical remodelling of cell surfaces in living animals.'' In: ''Nature.'' Band 430, Nummer 7002, August 2004, S.&nbsp;873–877, {{ISSN|1476-4687}}. {{DOI|10.1038/nature02791}}. PMID 15318217.</ref><ref>J. A. Prescher, C. R. Bertozzi: ''Chemistry in living systems.'' In: ''Nature chemical biology.'' Band 1, Nummer 1, Juni 2005, S.&nbsp;13–21, {{ISSN|1552-4450}}. {{DOI|10.1038/nchembio0605-13}}. PMID 16407987.</ref><ref>A. B. Neef, N. W. Luedtke: ''Dynamic metabolic labeling of DNA in vivo with arabinosyl nucleosides.'' In: ''Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.'' Band 108, Nummer 51, Dezember 2011, S.&nbsp;20404–20409, {{ISSN|1091-6490}}. {{DOI|10.1073/pnas.1101126108}}. PMID 22143759. {{PMC|3251089}}.</ref> Dabei werden Vorläufersubstanzen mit einer reaktiven Gruppe für eine metabolische Markierung verwendet, die anschließend nach einer [[Proteinreinigung]] bzw. [[DNA-Reinigung]] zur nachträglichen chemischen Kopplung des Reportermoleküls verwendet wird, z. B. per [[Click-Chemie]],<ref>H. C. Kolb, M. G. Finn, K. B. Sharpless: ''Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions.'' In: ''Angewandte Chemie (International ed. in English).'' Band 40, Nummer 11, Juni 2001, S.&nbsp;2004–2021, {{ISSN|1521-3773}}. PMID 11433435.</ref><ref name="Los">A. Cieslar-Pobuda, M. J. Los: ''Prospects and limitations of "Click-Chemistry"-based DNA labeling technique employing 5-ethynyl-2'deoxyuridine (EdU).'' In: ''Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology.'' Band 83, Nummer 11, November 2013, S.&nbsp;977–978, {{ISSN|1552-4930}}. {{DOI|10.1002/cyto.a.22394}}. PMID 24115755.</ref> per [[Snap-Tag]] (oder ''CLIP''-Tag, jedoch nur bei Proteinen) oder per [[Staudinger-Reaktion]].<ref>E. Saxon, C. R. Bertozzi: ''Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction.'' In: ''Science (New York, N.Y.).'' Band 287, Nummer 5460, März 2000, S.&nbsp;2007–2010, {{ISSN|0036-8075}}. PMID 10720325.</ref><ref>N. J. Agard, J. M. Baskin, J. A. Prescher, A. Lo, C. R. Bertozzi: ''A comparative study of bioorthogonal reactions with azides.'' In: ''ACS chemical biology.'' Band 1, Nummer 10, November 2006, S.&nbsp;644–648, {{ISSN|1554-8937}}. PMID 17175580.</ref><ref>S. H. Weisbrod, A. Baccaro, A. Marx: ''Site-specific DNA labeling by Staudinger ligation.'' In: ''Methods in molecular biology (Clifton, N.J.).'' Band 751, 2011, S.&nbsp;195–207, {{ISSN|1940-6029}}. {{DOI|10.1007/978-1-61779-151-2_12}}. PMID 21674332.</ref>
Eine Markierung kann auch teilweise metabolisch und teilweise synthetisch erfolgen, wie bei der ''bioorthogonalen Markierung''.<ref>J. A. Prescher, D. H. Dube, [[Carolyn Bertozzi]]: ''Chemical remodelling of cell surfaces in living animals.'' In: ''Nature.'' Band 430, Nummer 7002, August 2004, S.&nbsp;873–877, {{ISSN|1476-4687}}. {{DOI|10.1038/nature02791}}. PMID 15318217.</ref><ref>J. A. Prescher, C. R. Bertozzi: ''Chemistry in living systems.'' In: ''Nature chemical biology.'' Band 1, Nummer 1, Juni 2005, S.&nbsp;13–21, {{ISSN|1552-4450}}. {{DOI|10.1038/nchembio0605-13}}. PMID 16407987.</ref><ref>A. B. Neef, N. W. Luedtke: ''Dynamic metabolic labeling of DNA in vivo with arabinosyl nucleosides.'' In: ''Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.'' Band 108, Nummer 51, Dezember 2011, S.&nbsp;20404–20409, {{ISSN|1091-6490}}. {{DOI|10.1073/pnas.1101126108}}. PMID 22143759. {{PMC|3251089}}.</ref> Dabei werden Vorläufersubstanzen mit einer reaktiven Gruppe für eine metabolische Markierung verwendet, die anschließend nach einer [[Proteinreinigung]] bzw. [[DNA-Reinigung]] zur nachträglichen chemischen Kopplung des Reportermoleküls verwendet wird, z. B. per [[Click-Chemie]]<ref>H. C. Kolb, M. G. Finn, K. B. Sharpless: ''Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions.'' In: ''Angewandte Chemie (International ed. in English).'' Band 40, Nummer 11, Juni 2001, S.&nbsp;2004–2021, {{ISSN|1521-3773}}. PMID 11433435.</ref><ref name="Los">A. Cieslar-Pobuda, M. J. Los: ''Prospects and limitations of "Click-Chemistry"-based DNA labeling technique employing 5-ethynyl-2'deoxyuridine (EdU).'' In: ''Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology.'' Band 83, Nummer 11, November 2013, S.&nbsp;977–978, {{ISSN|1552-4930}}. {{DOI|10.1002/cyto.a.22394}}. PMID 24115755.</ref> oder per [[Staudinger-Reaktion]].<ref>E. Saxon, C. R. Bertozzi: ''Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction.'' In: ''Science (New York, N.Y.).'' Band 287, Nummer 5460, März 2000, S.&nbsp;2007–2010, {{ISSN|0036-8075}}. PMID 10720325.</ref><ref>N. J. Agard, J. M. Baskin, J. A. Prescher, A. Lo, C. R. Bertozzi: ''A comparative study of bioorthogonal reactions with azides.'' In: ''ACS chemical biology.'' Band 1, Nummer 10, November 2006, S.&nbsp;644–648, {{ISSN|1554-8937}}. PMID 17175580.</ref><ref>S. H. Weisbrod, A. Baccaro, A. Marx: ''Site-specific DNA labeling by Staudinger ligation.'' In: ''Methods in molecular biology (Clifton, N.J.).'' Band 751, 2011, S.&nbsp;195–207, {{ISSN|1940-6029}}. {{DOI|10.1007/978-1-61779-151-2_12}}. PMID 21674332.</ref>


Zur Verfolgung des zeitlichen Verlaufs eines markierten Moleküls im Kontext des [[Stoffwechsel]]s wird als Variante der metabolischen Markierung die ''Puls-Markierung'' ({{enS}} ''pulse labeling'') verwendet. Bei der Puls-Markierung wird der Markierungszeitraum zeitlich begrenzt, wodurch die Markierung des Moleküls und seiner [[Metabolit]]en genauer eingrenzbar ist und der Wechsel der Markierung auf einzelne nachfolgende Stoffe in einem Stoffwechselweg beobachtet werden kann. Die Verfolgung mehrerer Metabolite gleichzeitig wird auch als metabolische Fluxanalyse ({{enS}} ''metabolic flux analysis'') bezeichnet.<ref>J. O'Grady, J. Schwender, Y. Shachar-Hill, J. A. Morgan: ''Metabolic cartography: experimental quantification of metabolic fluxes from isotopic labelling studies.'' In: ''Journal of experimental botany.'' Band 63, Nummer 6, März 2012, S.&nbsp;2293–2308, {{ISSN|1460-2431}}. {{DOI|10.1093/jxb/ers032}}. PMID 22371075. [http://jxb.oxfordjournals.org/content/63/6/2293.full.pdf+html PDF].</ref><ref>M. A. Orman, F. Berthiaume, I. P. Androulakis, M. G. Ierapetritou: ''Advanced stoichiometric analysis of metabolic networks of mammalian systems.'' In: ''Critical reviews in biomedical engineering.'' Band 39, Nummer 6, 2011, S.&nbsp;511–534, {{ISSN|0278-940X}}. PMID 22196224. {{PMC|3634616}}.</ref><ref>S. B. Crown, M. R. Antoniewicz: ''Parallel labeling experiments and metabolic flux analysis: Past, present and future methodologies.'' In: ''Metabolic engineering.'' Band 16, März 2013, S.&nbsp;21–32, {{ISSN|1096-7184}}. {{DOI|10.1016/j.ymben.2012.11.010}}. PMID 23246523.</ref><ref>X. Chen, Y. Shachar-Hill: ''Insights into metabolic efficiency from flux analysis.'' In: ''Journal of experimental botany.'' Band 63, Nummer 6, März 2012, S.&nbsp;2343–2351, {{ISSN|1460-2431}}. {{DOI|10.1093/jxb/ers057}}. PMID 22378949. [http://jxb.oxfordjournals.org/content/63/6/2343.full.pdf+html PDF].</ref> Durch die Molekülmarkierung können auch [[Zelle (Biologie)|Zellen]] markiert werden, z. B. für die [[Durchflusszytometrie]], die [[Fluoreszenzmikroskopie]] oder die [[Fluoreszenztomographie]].
Zur Verfolgung des zeitlichen Verlaufs eines markierten Moleküls im Kontext des [[Stoffwechsel]]s wird als Variante der metabolischen Markierung die ''Puls-Markierung'' ({{enS}} ''pulse labeling'') verwendet. Bei der Puls-Markierung wird der Markierungszeitraum zeitlich begrenzt, wodurch die Markierung des Moleküls und seiner [[Metabolit]]en genauer eingrenzbar ist und der Wechsel der Markierung auf einzelne nachfolgende Stoffe in einem Stoffwechselweg beobachtet werden kann. Die Verfolgung mehrerer Metabolite gleichzeitig wird auch als metabolische Fluxanalyse ({{enS}} ''metabolic flux analysis'') bezeichnet.<ref>J. O'Grady, J. Schwender, Y. Shachar-Hill, J. A. Morgan: ''Metabolic cartography: experimental quantification of metabolic fluxes from isotopic labelling studies.'' In: ''Journal of experimental botany.'' Band 63, Nummer 6, März 2012, S.&nbsp;2293–2308, {{ISSN|1460-2431}}. {{DOI|10.1093/jxb/ers032}}. PMID 22371075. [http://jxb.oxfordjournals.org/content/63/6/2293.full.pdf+html PDF].</ref><ref>M. A. Orman, F. Berthiaume, I. P. Androulakis, M. G. Ierapetritou: ''Advanced stoichiometric analysis of metabolic networks of mammalian systems.'' In: ''Critical reviews in biomedical engineering.'' Band 39, Nummer 6, 2011, S.&nbsp;511–534, {{ISSN|0278-940X}}. PMID 22196224. {{PMC|3634616}}.</ref><ref>S. B. Crown, M. R. Antoniewicz: ''Parallel labeling experiments and metabolic flux analysis: Past, present and future methodologies.'' In: ''Metabolic engineering.'' Band 16, März 2013, S.&nbsp;21–32, {{ISSN|1096-7184}}. {{DOI|10.1016/j.ymben.2012.11.010}}. PMID 23246523.</ref><ref>X. Chen, Y. Shachar-Hill: ''Insights into metabolic efficiency from flux analysis.'' In: ''Journal of experimental botany.'' Band 63, Nummer 6, März 2012, S.&nbsp;2343–2351, {{ISSN|1460-2431}}. {{DOI|10.1093/jxb/ers057}}. PMID 22378949. [http://jxb.oxfordjournals.org/content/63/6/2343.full.pdf+html PDF].</ref> Durch die Molekülmarkierung können auch [[Zelle (Biologie)|Zellen]] markiert werden, z. B. für die [[Durchflusszytometrie]], die [[Fluoreszenzmikroskopie]] oder die [[Fluoreszenztomographie]].
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=== Proteine ===
=== Proteine ===
[[Datei:Fluorescein Isothiocyanate.gif|mini|hochkant=0.75|Fluoresceinisothiocyanat (FITC).]]
[[Datei:Fluorescein Isothiocyanate.gif|mini|hochkant=0.75|Fluoresceinisothiocyanat (FITC).]]
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Im Gegensatz zu Kohlenhydraten und Nukleinsäuren kommen unter den [[Biomolekül]]en manche Strukturmotive aufgrund der verschiedenen enthaltenen [[Aminosäure]]n nur bei Proteinen vor, z. B. [[Sulfhydryl]]-enthaltende [[Cystein]]e oder [[Phenol]]reste in [[Tyrosin]]en. Diese Strukturmotive können mit entsprechenden Kopplungsreagenzien selektiv markiert werden. Cysteine können mit [[Maleimid]]estern, [[Disulfidbindung|Disulfiden]] oder [[Iodacetamid]] selektiv reagieren. Aminosäuren mit primären [[Amin]]en an der Seitenkette wie Lysin können durch [[Succinimid]]ester ([[N-Hydroxysuccinimid|''N''-Hydroxysuccinimid]], Sulfosuccinimid- oder andere Succinimidylester) oder bestimmte [[Isothiocyanat]]e wie [[PITC]] oder [[FITC]] markiert werden. Nach einer [[Oxidation]] von Proteinen können verschiedene Reportermoleküle gekoppelt werden.<ref>J. Roeser, R. Bischoff, A. P. Bruins, H. P. Permentier: ''Oxidative protein labeling in mass-spectrometry-based proteomics.'' In: ''Analytical and bioanalytical chemistry.'' Band 397, Nummer 8, August 2010, S.&nbsp;3441–3455, {{ISSN|1618-2650}}. {{DOI|10.1007/s00216-010-3471-8}}. PMID 20155254. {{PMC|2911539}}.</ref> Mit dem Enzym ''Sortase'' können Amine markiert werden.<ref name="PMID 21922670">T. Matsumoto, R. Takase, T. Tanaka, H. Fukuda, A. Kondo: ''Site-specific protein labeling with amine-containing molecules using Lactobacillus plantarum sortase.'' In: ''Biotechnology journal.'' Band 7, Nummer 5, Mai 2012, S.&nbsp;642–648, {{ISSN|1860-7314}}. {{DOI|10.1002/biot.201100213}}. PMID 21922670.</ref> Einige [[Proteaseinhibitor]]en führen zu einer selektiven Markierung von Proteinen. Auf dem gleichen Prinzip wie die Markierung basiert auch die [[Vernetzung (Chemie)|Vernetzung]] und die [[Fixierung (Präparationsmethode)|Fixierung]] verschiedener Aminosäuren. Bei einem [[Label-Transfer]]-Experiment wird eine spaltbare Quervernetzung mit einem Reporter zwischen zwei benachbarten Molekülen verwendet, um durch eine Spaltung der Quervernetzung das Reportermolekül zwischen diesen Molekülen zu übertragen und dadurch deren Nachbarschaft nachzuweisen.
[[Datei:Carboxyfluorescein succinimidyl ester.png|mini|Carboxyfluoresceinsuccinimidylester (CFSE).]]
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Im Gegensatz zu Kohlenhydraten und Nukleinsäuren kommen unter den [[Biomolekül]]en manche Strukturmotive aufgrund der verschiedenen enthaltenen [[Aminosäure]]n nur bei Proteinen vor, z. B. [[Sulfhydryl]]-enthaltende [[Cystein]]e oder [[Phenol]]reste in [[Tyrosin]]en. Diese Strukturmotive können mit entsprechenden Kopplungsreagenzien selektiv markiert werden. Cysteine können mit [[Maleimid]]estern, [[Disulfidbindung|Disulfiden]] oder [[Iodacetamid]] selektiv reagieren. Aminosäuren mit primären [[Amin]]en an der Seitenkette wie Lysin können durch [[Succinimid]]ester ([[N-Hydroxysuccinimid|''N''-Hydroxysuccinimid]], Sulfosuccinimid- oder andere Succinimidylester) oder bestimmte [[Isothiocyanat]]e wie [[PITC]] oder [[FITC]] markiert werden. Einige [[Proteaseinhibitor]]en führen zu einer selektiven Markierung von Proteinen. Auf dem gleichen Prinzip wie die Markierung basiert auch die [[Vernetzung (Chemie)|Vernetzung]] und die [[Fixierung (Präparationsmethode)|Fixierung]] verschiedener Aminosäuren. Bei einem [[Label-Transfer]]-Experiment wird eine spaltbare Quervernetzung mit einem Reporter zwischen zwei benachbarten Molekülen verwendet, um durch eine Spaltung der Quervernetzung das Reportermolekül zwischen diesen Molekülen zu übertragen und dadurch deren Nachbarschaft nachzuweisen.


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[[Datei:Diazirines.svg|mini|hochkant=0.25|Diazirine.]]
Auch photoreaktive Moleküle (z.&nbsp;B. [[Aryl]][[azid]]e, [[Diazirin]]e) können als reaktive Gruppe einer Markierung bei Proteinen verwendet werden, um den Zeitpunkt der Kopplung besser steuern zu können, da die Reaktion erst mit [[UV]]-Bestrahlung ausgelöst wird. Aufgrund der geringeren Selektivität dieser [[Radikale (Chemie)|radikalisch]] reagierenden Kopplungsgruppen wird oftmals die Funktionsfähigkeit des Proteins durch Reaktion der radikalischen Kopplungsgruppe mit wichtigen Funktionen (z.&nbsp;B. ein [[aktives Zentrum]] eines Enzyms oder eine [[Protein-Protein-Interaktion|Bindungsstelle]]) gemindert.<ref>J. Roeser, R. Bischoff, A. P. Bruins, H. P. Permentier: ''Oxidative protein labeling in mass-spectrometry-based proteomics.'' In: ''Analytical and bioanalytical chemistry.'' Band 397, Nummer 8, August 2010, S.&nbsp;3441–3455, {{ISSN|1618-2650}}. {{DOI|10.1007/s00216-010-3471-8}}. PMID 20155254. {{PMC|2911539}}.</ref> Daher werden photoreaktive Markierungen meistens eingesetzt, wenn keine oder nur eine Amin- oder Sulfhydrylgruppe zur selektiven Kopplung zur Verfügung steht oder eine anschließende Funktionsfähigkeit unerheblich ist. Es existieren auch photoreaktive Diazirin-enthaltende [[Analogon (Chemie)|Analoga]] der [[Aminosäuren]] [[Leucin]], [[Methionin]] und p-Benzoyl-[[Phenylalanin]], die während der Translation in das Protein eingebaut werden können.<ref>{{cite journal| author=M. Suchanek, A. Radzikowska, C. Thiele |date=2005 |title=Photo-leucine and photo-methionine allow identification of protein–protein interactions in living cells|journal=Nature Methods|volume=2|pmid=15782218|pages=261–268 |doi=10.1038/nmeth752| issue=4}}</ref> Durch eine [[Peptidsynthese]] können [[Peptid]]e mit markierten [[Aminosäure]]derivaten hergestellt werden.
Auch photoreaktive Moleküle (z.&nbsp;B. [[Aryl]][[azid]]e, [[Diazirin]]e) können als reaktive Gruppe einer Markierung bei Proteinen verwendet werden, um den Zeitpunkt der Kopplung besser steuern zu können, da die Reaktion erst mit [[UV]]-Bestrahlung ausgelöst wird. Aufgrund der geringeren Selektivität dieser [[Radikale (Chemie)|radikalisch]] reagierenden Kopplungsgruppen wird oftmals die Funktionsfähigkeit des Proteins durch Reaktion der radikalischen Kopplungsgruppe mit wichtigen Funktionen (z.&nbsp;B. ein [[aktives Zentrum]] eines Enzyms oder eine [[Protein-Protein-Interaktion|Bindungsstelle]]) gemindert.<ref>J. Roeser, R. Bischoff, A. P. Bruins, H. P. Permentier: ''Oxidative protein labeling in mass-spectrometry-based proteomics.'' In: ''Analytical and bioanalytical chemistry.'' Band 397, Nummer 8, August 2010, S.&nbsp;3441–3455, {{ISSN|1618-2650}}. {{DOI|10.1007/s00216-010-3471-8}}. PMID 20155254. {{PMC|2911539}}.</ref> Daher werden photoreaktive Markierungen meistens eingesetzt, wenn keine oder nur eine Amin- oder Sulfhydrylgruppe zur selektiven Kopplung zur Verfügung steht oder eine anschließende Funktionsfähigkeit unerheblich ist. Es existieren auch photoreaktive Diazirin-enthaltende [[Analogon (Chemie)|Analoga]] der [[Aminosäuren]] [[Leucin]], [[Methionin]] und p-Benzoyl-[[Phenylalanin]], die während der Translation in das Protein eingebaut werden können.<ref>{{cite journal| author=M. Suchanek, A. Radzikowska, C. Thiele |date=2005 |title=Photo-leucine and photo-methionine allow identification of protein–protein interactions in living cells|journal=Nature Methods|volume=2|pmid=15782218|pages=261–268 |doi=10.1038/nmeth752| issue=4}}</ref> Durch eine [[Peptidsynthese]] können [[Peptid]]e mit markierten [[Aminosäure]]derivaten hergestellt werden.


Die Markierungen mit Isotopen (oder Isobaren) besitzen unter den Markierungen die kleinsten Änderungen der [[Molmasse]] und führen daher zu einer vergleichsweise geringeren Änderung der [[Proteinstruktur]] und der [[Biologische Aktivität|biologischen Aktivität]], sind jedoch von erhöhten Sicherheitsmaßnahmen und Anforderungen an das Sicherheitslabor begleitet. Die Isotopenmarkierung erfolgt entweder chemisch oder biosynthetisch durch Fütterung von [[Zellkultur]]en oder [[Versuchstier]]en mit markierten Vorläufermolekülen. Durch eine Radioiodierung können Tyrosine mit radioaktivem [[Iod]] markiert werden.<ref>S. Caplan, M. Baniyash: ''Radioiodination of cellular proteins.'' In: ''Current protocols in cell biology / editorial board, Juan S. Bonifacino ... [et al.].'' Chapter 7, August 2002, S.&nbsp;Unit 7.10, {{ISSN|1934-2616}}. {{DOI|10.1002/0471143030.cb0710s15}}. PMID 18228409.</ref> [[Phosphorylierung]]en von [[Serin]], [[Threonin]] und Tyrosin werden meist enzymatisch mit geeigneten [[Proteinkinase]]n und radioaktivem Phosphor-haltigem [[Adenosintriphosphat]] durchgeführt.<ref>M. Sunbul, J. Yin: ''Site specific protein labeling by enzymatic posttranslational modification.'' In: ''Organic & biomolecular chemistry.'' Band 7, Nummer 17, September 2009, S.&nbsp;3361–3371, {{ISSN|1477-0539}}. {{DOI|10.1039/b908687k}}. PMID 19675886.</ref> Eine radioaktiv markierte [[Prenylierung]] kann mit <sup>3</sup>H-[[Mevalonsäure]] durchgeführt werden.<ref name="Bonifacino">s. Bonifacino</ref> Daneben wird im Zuge einer Prenylierung der C-Terminus methyliert, der durch <sup>3</sup>H-markiertes [[S-Adenosyl-Methionin]] reversibel radioaktiv markiert werden kann.<ref name="Bonifacino" /> [[Sulfatierung (Biologie)|Sulfatierungen]] können mit <sup>35</sup>S-markiertem Sulfat nachgewiesen werden.<ref name="Bonifacino" /> [[Wasserstoff]]atome können durch eine [[Deuterierung]] mit [[Deuterium]] ausgetauscht werden. Die Markierung mit radioaktiven [[Isotop]]en erlaubt eine Verfolgung per [[Autoradiographie]], per [[Szintillationszähler]] oder per [[Positronen-Emissions-Tomographie]].<ref>V. Tolmachev, A. Orlova: ''Influence of labelling methods on biodistribution and imaging properties of radiolabelled peptides for visualisation of molecular therapeutic targets.'' In: ''Current medicinal chemistry.'' Band 17, Nummer 24, 2010, S.&nbsp;2636–2655, {{ISSN|1875-533X}}. PMID 20491631.</ref><ref>V. Tolmachev, S. Stone-Elander: ''Radiolabelled proteins for positron emission tomography: Pros and cons of labelling methods.'' In: ''Biochimica et biophysica acta.'' Band 1800, Nummer 5, Mai 2010, S.&nbsp;487–510, {{ISSN|0006-3002}}. {{DOI|10.1016/j.bbagen.2010.02.002}}. PMID 20153401.</ref> In der [[Massenspektrometrie]] wird die [[Isobarenmarkierung]] zur Unterscheidung verschiedener Proben verwendet.<ref>K. M. Coombs: ''Quantitative proteomics of complex mixtures.'' In: ''Expert review of proteomics.'' Band 8, Nummer 5, Oktober 2011, S.&nbsp;659–677, {{ISSN|1744-8387}}. {{DOI|10.1586/epr.11.55}}. PMID 21999835.</ref><ref>Y. Xu, S. Matthews: ''TROSY NMR spectroscopy of large soluble proteins.'' In: ''Topics in current chemistry.'' Band 335, 2013, S.&nbsp;97–119, {{ISSN|0340-1022}}. {{DOI|10.1007/128_2011_228}}. PMID 21928013.</ref> Neben den üblicherweise verwendeten Nukliden <sup>1</sup>[[Wasserstoff]] oder <sup>15</sup>[[Stickstoff]] werden in der [[NMR-Spektroskopie]] Markierungen mit <sup>13</sup>[[Kohlenstoff]] oder <sup>19</sup>[[Fluor]] verwendet.<ref>A. Audhya, A. Desai: ''Proteomics in Caenorhabditis elegans.'' In: ''Briefings in functional genomics & proteomics.'' Band 7, Nummer 3, Mai 2008, S.&nbsp;205–210, {{ISSN|1477-4062}}. {{DOI|10.1093/bfgp/eln014}}. PMID 18372286.</ref><ref>S. Mizukami: ''Development of molecular imaging tools to investigate protein functions by chemical probe design.'' In: ''Chemical & pharmaceutical bulletin.'' Band 59, Nummer 12, 2011, S.&nbsp;1435–1446, {{ISSN|1347-5223}}. PMID 22130363.</ref>
Die Markierungen mit Isotopen (oder Isobaren) besitzen unter den Markierungen die kleinsten Änderungen der [[Molmasse]] und führen daher zu einer vergleichsweise geringeren Änderung der [[Proteinstruktur]] und der [[Biologische Aktivität|biologischen Aktivität]], sind jedoch von erhöhten Sicherheitsmaßnahmen und Anforderungen an das Sicherheitslabor begleitet. Die Isotopenmarkierung erfolgt entweder chemisch oder biosynthetisch durch Fütterung von [[Zellkultur]]en oder [[Versuchstier]]en mit markierten Vorläufermolekülen. Durch eine Radioiodierung können Tyrosine mit radioaktivem [[Iod]] markiert werden.<ref>S. Caplan, M. Baniyash: ''Radioiodination of cellular proteins.'' In: ''Current protocols in cell biology / editorial board, Juan S. Bonifacino ... [et al.].'' Chapter 7, August 2002, S.&nbsp;Unit 7.10, {{ISSN|1934-2616}}. {{DOI|10.1002/0471143030.cb0710s15}}. PMID 18228409.</ref> [[Phosphorylierung]]en von [[Serin]], [[Threonin]] und Tyrosin werden meist enzymatisch mit geeigneten [[Proteinkinase]]n und radioaktivem Phosphor-haltigem [[Adenosintriphosphat]] durchgeführt.<ref>M. Sunbul, J. Yin: ''Site specific protein labeling by enzymatic posttranslational modification.'' In: ''Organic & biomolecular chemistry.'' Band 7, Nummer 17, September 2009, S.&nbsp;3361–3371, {{ISSN|1477-0539}}. {{DOI|10.1039/b908687k}}. PMID 19675886.</ref> Eine radioaktiv markierte [[Prenylierung]] kann mit <sup>3</sup>H-[[Mevalonsäure]] durchgeführt werden.<ref name="Bonifacino">s. Bonifacino</ref> Daneben wird im Zuge einer Prenylierung der C-Terminus methyliert, der durch <sup>3</sup>H-markiertes [[S-Adenosyl-Methionin]] reversibel radioaktiv markiert werden kann.<ref name="Bonifacino" /> Durch eine [[Myristylierung]] kann N-terminal markiert werden.<ref name="Heal">W. P. Heal, M. H. Wright, E. Thinon, E. W. Tate: ''Multifunctional protein labeling via enzymatic N-terminal tagging and elaboration by click chemistry.'' In: ''Nature protocols.'' Band 7, Nummer 1, Januar 2012, S.&nbsp;105–117, {{ISSN|1750-2799}}. {{DOI|10.1038/nprot.2011.425}}. PMID 22193303.</ref> [[Sulfatierung (Biologie)|Sulfatierungen]] können mit <sup>35</sup>S-markiertem Sulfat nachgewiesen werden.<ref name="Bonifacino" /> [[Wasserstoff]]atome können durch eine [[Deuterierung]] mit [[Deuterium]] ausgetauscht werden. Die Markierung mit radioaktiven [[Isotop]]en erlaubt eine Verfolgung per [[Autoradiographie]], per [[Szintillationszähler]] oder per [[Positronen-Emissions-Tomographie]].<ref>V. Tolmachev, A. Orlova: ''Influence of labelling methods on biodistribution and imaging properties of radiolabelled peptides for visualisation of molecular therapeutic targets.'' In: ''Current medicinal chemistry.'' Band 17, Nummer 24, 2010, S.&nbsp;2636–2655, {{ISSN|1875-533X}}. PMID 20491631.</ref><ref>V. Tolmachev, S. Stone-Elander: ''Radiolabelled proteins for positron emission tomography: Pros and cons of labelling methods.'' In: ''Biochimica et biophysica acta.'' Band 1800, Nummer 5, Mai 2010, S.&nbsp;487–510, {{ISSN|0006-3002}}. {{DOI|10.1016/j.bbagen.2010.02.002}}. PMID 20153401.</ref> In der [[Massenspektrometrie]] wird die [[Isobarenmarkierung]] zur Unterscheidung verschiedener Proben verwendet.<ref>K. M. Coombs: ''Quantitative proteomics of complex mixtures.'' In: ''Expert review of proteomics.'' Band 8, Nummer 5, Oktober 2011, S.&nbsp;659–677, {{ISSN|1744-8387}}. {{DOI|10.1586/epr.11.55}}. PMID 21999835.</ref><ref>Y. Xu, S. Matthews: ''TROSY NMR spectroscopy of large soluble proteins.'' In: ''Topics in current chemistry.'' Band 335, 2013, S.&nbsp;97–119, {{ISSN|0340-1022}}. {{DOI|10.1007/128_2011_228}}. PMID 21928013.</ref> Neben den üblicherweise verwendeten Nukliden <sup>1</sup>[[Wasserstoff]] oder <sup>15</sup>[[Stickstoff]] werden in der [[NMR-Spektroskopie]] Markierungen mit <sup>13</sup>[[Kohlenstoff]] oder <sup>19</sup>[[Fluor]] verwendet.<ref>A. Audhya, A. Desai: ''Proteomics in Caenorhabditis elegans.'' In: ''Briefings in functional genomics & proteomics.'' Band 7, Nummer 3, Mai 2008, S.&nbsp;205–210, {{ISSN|1477-4062}}. {{DOI|10.1093/bfgp/eln014}}. PMID 18372286.</ref><ref>S. Mizukami: ''Development of molecular imaging tools to investigate protein functions by chemical probe design.'' In: ''Chemical & pharmaceutical bulletin.'' Band 59, Nummer 12, 2011, S.&nbsp;1435–1446, {{ISSN|1347-5223}}. PMID 22130363.</ref>


[[Datei:Bioorthogonal Synthetic Aminoacids.png|mini|Aminosäuren für eine bioorthogonale Markierung.]]
[[Datei:Bioorthogonal Synthetic Aminoacids.png|mini|Aminosäuren für eine bioorthogonale Markierung.]]
[[Datei:Enzyme-mediated labeling with azidooctanoic acid and SPAAC.tif|mini|Kopplung von Membranproteinen mit Aziden.]]
[[Datei:Enzyme-mediated labeling with azidooctanoic acid and SPAAC.tif|mini|Kopplung von Membranproteinen mit Aziden.]]
Proteine können bioorthogonal markiert werden.<ref>G. C. Rudolf, W. Heydenreuter, S. A. Sieber: ''Chemical proteomics: ligation and cleavage of protein modifications.'' In: ''Current opinion in chemical biology.'' Band 17, Nummer 1, Februar 2013, S.&nbsp;110–117, {{ISSN|1879-0402}}. {{DOI|10.1016/j.cbpa.2012.11.007}}. PMID 23273612.</ref><ref>R. K. Lim, Q. Lin: ''Photoinducible bioorthogonal chemistry: a spatiotemporally controllable tool to visualize and perturb proteins in live cells.'' In: ''Accounts of chemical research.'' Band 44, Nummer 9, September 2011, S.&nbsp;828–839, {{ISSN|1520-4898}}. {{DOI|10.1021/ar200021p}}. PMID 21609129. {{PMC|3175026}}.</ref><ref>Y. Takaoka, A. Ojida, I. Hamachi: ''Protein organic chemistry and applications for labeling and engineering in live-cell systems.'' In: ''Angewandte Chemie (International ed. in English).'' Band 52, Nummer 15, April 2013, S.&nbsp;4088–4106, {{ISSN|1521-3773}}. {{DOI|10.1002/anie.201207089}}. PMID 23426903.</ref> [[Membranprotein]]e können nach der Biosynthese enzymatisch mit [[Azid]]en gekoppelt werden, die wiederum per Staudinger-Reaktion mit Reportermolekülen gekoppelt werden.<ref>M. Fernández-Suárez, H. Baruah, L. Martínez-Hernández, K. T. Xie, J. M. Baskin, C. R. Bertozzi, A. Y. Ting: ''Redirecting lipoic acid ligase for cell surface protein labeling with small-molecule probes.'' In: ''Nature biotechnology.'' Band 25, Nummer 12, Dezember 2007, S.&nbsp;1483–1487, {{ISSN|1546-1696}}. {{DOI|10.1038/nbt1355}}. PMID 18059260. {{PMC|2654346}}.</ref>
Proteine können bioorthogonal markiert werden. Hierbei werden verschiedene selektive Kopplungsreaktionen verwendet, z. B. per [[Sonogashira-Kupplung]],<ref>J. Li, S. Lin, J. Wang, S. Jia, M. Yang, Z. Hao, X. Zhang, P. R. Chen: ''Ligand-free palladium-mediated site-specific protein labeling inside gram-negative bacterial pathogens.'' In: ''Journal of the American Chemical Society.'' Band 135, Nummer 19, Mai 2013, S.&nbsp;7330–7338, {{ISSN|1520-5126}}. {{DOI|10.1021/ja402424j}}. PMID 23641876.</ref> per kupferkatalysierter [[1,3-Dipolare Cycloaddition|Alkin-Azid-Cycloaddition]],<ref>C. Uttamapinant, M. I. Sanchez, D. S. Liu, J. Z. Yao, A. Y. Ting: ''Site-specific protein labeling using PRIME and chelation-assisted click chemistry.'' In: ''Nature protocols.'' Band 8, Nummer 8, August 2013, S.&nbsp;1620–1634, {{ISSN|1750-2799}}. {{DOI|10.1038/nprot.2013.096}}. PMID 23887180.</ref><ref>F. Truong, T. H. Yoo, T. J. Lampo, D. A. Tirrell: ''Two-strain, cell-selective protein labeling in mixed bacterial cultures.'' In: ''Journal of the American Chemical Society.'' Band 134, Nummer 20, Mai 2012, S.&nbsp;8551–8556, {{ISSN|1520-5126}}. {{DOI|10.1021/ja3004667}}. PMID 22575034. {{PMC|3443257}}.</ref> per [[Heck-Reaktion]],<ref>M. E. Ourailidou, J. Y. van der Meer, B. J. Baas, M. Jeronimus-Stratingh, A. L. Gottumukkala, G. J. Poelarends, A. J. Minnaard, F. J. Dekker: ''Aqueous oxidative heck reaction as a protein-labeling strategy.'' In: ''Chembiochem : a European journal of chemical biology.'' Band 15, Nummer 2, Januar 2014, S.&nbsp;209–212, {{ISSN|1439-7633}}. {{DOI|10.1002/cbic.201300714}}. PMID 24376051.</ref> per [[Oxim]]-Ligation,<ref>S. Voss, L. Zhao, X. Chen, F. Gerhard, Y. W. Wu: ''Generation of an intramolecular three-color fluorescence resonance energy transfer probe by site-specific protein labeling.'' In: ''Journal of peptide science : an official publication of the European Peptide Society.'' [elektronische Veröffentlichung vor dem Druck] Januar 2014, {{ISSN|1099-1387}}. {{DOI|10.1002/psc.2590}}. PMID 24395760.</ref> per Cyclopropen-Azid-Kopplung,<ref>Z. Yu, Y. Pan, Z. Wang, J. Wang, Q. Lin: ''Genetically encoded cyclopropene directs rapid, photoclick-chemistry-mediated protein labeling in mammalian cells.'' In: ''Angewandte Chemie (International ed. in English).'' Band 51, Nummer 42, Oktober 2012, S.&nbsp;10600–10604, {{ISSN|1521-3773}}. {{DOI|10.1002/anie.201205352}}. PMID 22997015. {{PMC|3517012}}.</ref> per Myristylierung,<ref name="Heal" /> per Cyanobenzothiazol-Kondensation,<ref>D. P. Nguyen, T. Elliott, M. Holt, T. W. Muir, J. W. Chin: ''Genetically encoded 1,2-aminothiols facilitate rapid and site-specific protein labeling via a bio-orthogonal cyanobenzothiazole condensation.'' In: ''Journal of the American Chemical Society.'' Band 133, Nummer 30, August 2011, S.&nbsp;11418–11421, {{ISSN|1520-5126}}. {{DOI|10.1021/ja203111c}}. PMID 21736333.</ref><ref>G. C. Rudolf, W. Heydenreuter, S. A. Sieber: ''Chemical proteomics: ligation and cleavage of protein modifications.'' In: ''Current opinion in chemical biology.'' Band 17, Nummer 1, Februar 2013, S.&nbsp;110–117, {{ISSN|1879-0402}}. {{DOI|10.1016/j.cbpa.2012.11.007}}. PMID 23273612.</ref><ref>R. K. Lim, Q. Lin: ''Photoinducible bioorthogonal chemistry: a spatiotemporally controllable tool to visualize and perturb proteins in live cells.'' In: ''Accounts of chemical research.'' Band 44, Nummer 9, September 2011, S.&nbsp;828–839, {{ISSN|1520-4898}}. {{DOI|10.1021/ar200021p}}. PMID 21609129. {{PMC|3175026}}.</ref><ref>Y. Takaoka, A. Ojida, I. Hamachi: ''Protein organic chemistry and applications for labeling and engineering in live-cell systems.'' In: ''Angewandte Chemie (International ed. in English).'' Band 52, Nummer 15, April 2013, S.&nbsp;4088–4106, {{ISSN|1521-3773}}. {{DOI|10.1002/anie.201207089}}. PMID 23426903.</ref> [[Membranprotein]]e können nach der Biosynthese enzymatisch mit [[Azid]]en gekoppelt werden, die wiederum per Staudinger-Reaktion mit Reportermolekülen gekoppelt werden.<ref>M. Fernández-Suárez, H. Baruah, L. Martínez-Hernández, K. T. Xie, J. M. Baskin, C. R. Bertozzi, A. Y. Ting: ''Redirecting lipoic acid ligase for cell surface protein labeling with small-molecule probes.'' In: ''Nature biotechnology.'' Band 25, Nummer 12, Dezember 2007, S.&nbsp;1483–1487, {{ISSN|1546-1696}}. {{DOI|10.1038/nbt1355}}. PMID 18059260. {{PMC|2654346}}.</ref>


Proteine können als [[rekombinantes Protein|rekombinante Proteine]] mit einem Protein-Tag oder mit einem [[Reporterprotein]] als [[Fusionsprotein]] hergestellt werden, das während der [[Translation (Biologie)|Translation]] [[N-Terminus|N-terminal]] oder [[C-Terminus|C-terminal]] an das Protein angehängt wurde. Über das in das rekombinante Protein eingefügte Protein-Tag kann ein Protein aufgereinigt oder [[Proteincharakterisierung|nachgewiesen]] werden, z. B. mit [[Grün fluoreszierendes Protein|GFP]] oder mit [[Reporterenzym]]en. Manche Protein-Tags werden nach der Biosynthese nachträglich mit einem Reportermolekül gekoppelt, z. B. das [[Snap-Tag]] und das ''Clip-Tag''.
Proteine können als [[rekombinantes Protein|rekombinante Proteine]] mit einem Protein-Tag oder mit einem [[Reporterprotein]] als [[Fusionsprotein]] hergestellt werden, das während der [[Translation (Biologie)|Translation]] [[N-Terminus|N-terminal]] oder [[C-Terminus|C-terminal]] an das Protein angehängt wird. Über das in das rekombinante Protein eingefügte Protein-Tag kann ein Protein aufgereinigt oder [[Proteincharakterisierung|nachgewiesen]] werden, z. B. mit [[Grün fluoreszierendes Protein|GFP]] oder mit [[Reporterenzym]]en. Manche Protein-Tags werden nach der Biosynthese nachträglich mit einem Reportermolekül gekoppelt, z. B. das [[Snap-Tag]], das [[Flash-Tag]], das ''Clip-Tag'', das ''HyRe''-Tag, das ''beta-Lactamase-Tag'', das ''LAP-Tag'' und das ''Sortase''-Tag.<ref>G. M. Eldridge, G. A. Weiss: ''Hydrazide reactive peptide tags for site-specific protein labeling.'' In: ''Bioconjugate chemistry.'' Band 22, Nummer 10, Oktober 2011, S.&nbsp;2143–2153, {{ISSN|1520-4812}}. {{DOI|10.1021/bc200415v}}. PMID 21905743. {{PMC|3199291}}.</ref><ref>A. Yoshimura, S. Mizukami, Y. Hori, S. Watanabe, K. Kikuchi: ''Cell-surface protein labeling with luminescent nanoparticles through biotinylation by using mutant ?-lactamase-tag technology.'' In: ''Chembiochem : a European journal of chemical biology.'' Band 12, Nummer 7, Mai 2011, S.&nbsp;1031–1034, {{ISSN|1439-7633}}. {{DOI|10.1002/cbic.201100021}}. PMID 21425232.</ref><ref>C. Uttamapinant, K. A. White, H. Baruah, S. Thompson, M. Fernández-Suárez, S. Puthenveetil, A. Y. Ting: ''A fluorophore ligase for site-specific protein labeling inside living cells.'' In: ''Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.'' Band 107, Nummer 24, Juni 2010, S.&nbsp;10914–10919, {{ISSN|1091-6490}}. {{DOI|10.1073/pnas.0914067107}}. PMID 20534555. {{PMC|2890758}}.</ref><ref name="PMID 21922670" /> Durch [[Intein]]e können Proteine posttranslational markiert werden.<ref>I. V. Thiel, G. Volkmann, S. Pietrokovski, H. D. Mootz: ''An atypical naturally split intein engineered for highly efficient protein labeling.'' In: ''Angewandte Chemie (International ed. in English).'' Band 53, Nummer 5, Januar 2014, S.&nbsp;1306–1310, {{ISSN|1521-3773}}. {{DOI|10.1002/anie.201307969}}. PMID 24382817.</ref><ref>I. Ghosh, N. Considine, E. Maunus, L. Sun, A. Zhang, J. Buswell, T. C. Evans, M. Q. Xu: ''Site-specific protein labeling by intein-mediated protein ligation.'' In: ''Methods in molecular biology (Clifton, N.J.).'' Band 705, 2011, S.&nbsp;87–107, {{ISSN|1940-6029}}. {{DOI|10.1007/978-1-61737-967-3_6}}. PMID 21125382.</ref>


Bei einer [[Immunmarkierung]] mit [[Immunkonjugat]]en basiert die Selektivität der Markierung auf der Bindung von [[Antikörper]]n, daneben ist der Antikörper meist selbst oder über einen Sekundärantikörper mit einem Reportermolekül markiert, der indirekt zum Nachweis dient, z. B. bei der Fluoreszenzmikroskopie, beim [[Western Blot]] und beim [[ELISA]]. Das vom Antikörper gebundene [[Epitop]] ist dabei entweder im Protein oder an einem Protein-Tag. In der [[DIGE]] werden unterschiedlich markierte Proben gemeinsam per [[SDS-PAGE]] oder [[2D-Gelelektrophorese]] aufgetrennt.<ref>M. M. Shaw, B. M. Riederer: ''Sample preparation for two-dimensional gel electrophoresis.'' In: ''Proteomics.'' Band 3, Nummer 8, August 2003, S.&nbsp;1408–1417, {{ISSN|1615-9853}}. {{DOI|10.1002/pmic.200300471}}. PMID 12923765.</ref><ref>J. F. Timms, R. Cramer: ''Difference gel electrophoresis.'' In: ''Proteomics.'' Band 8, Nummer 23–24, Dezember 2008, S.&nbsp;4886–4897, {{ISSN|1615-9861}}. {{DOI|10.1002/pmic.200800298}}. PMID 19003860.</ref><ref>B. M. Riederer: ''Non-covalent and covalent protein labeling in two-dimensional gel electrophoresis.'' In: ''Journal of proteomics.'' Band 71, Nummer 2, Juli 2008, S.&nbsp;231–244, {{ISSN|1874-3919}}. {{DOI|10.1016/j.jprot.2008.05.001}}. PMID 18556257.</ref> Proteine können mit Biotin-Succinimidylestern ''in vitro'' biotinyliert oder ''in vivo'' mit einem Protein-Tag mit Biotinylierung (z. B. Avi-Tag, BCCP-Tag, Strep-Tag) versehen werden und anschließend indirekt mit [[Avidin]]- oder [[Streptavidin]]-Konjugaten markiert werden. Proteine können durch [[Reportergen]]e indirekt nachgewiesen werden.
Bei einer [[Immunmarkierung]] mit [[Immunkonjugat]]en basiert die Selektivität der Markierung auf der Bindung von [[Antikörper]]n, daneben ist der Antikörper meist selbst oder über einen Sekundärantikörper mit einem Reportermolekül markiert, der indirekt zum Nachweis dient, z. B. bei der Fluoreszenzmikroskopie, beim [[Western Blot]] und beim [[ELISA]]. Das vom Antikörper gebundene [[Epitop]] ist dabei entweder im Protein oder an einem Protein-Tag. In der [[DIGE]] werden unterschiedlich markierte Proben gemeinsam per [[SDS-PAGE]] oder [[2D-Gelelektrophorese]] aufgetrennt.<ref>M. M. Shaw, B. M. Riederer: ''Sample preparation for two-dimensional gel electrophoresis.'' In: ''Proteomics.'' Band 3, Nummer 8, August 2003, S.&nbsp;1408–1417, {{ISSN|1615-9853}}. {{DOI|10.1002/pmic.200300471}}. PMID 12923765.</ref><ref>J. F. Timms, R. Cramer: ''Difference gel electrophoresis.'' In: ''Proteomics.'' Band 8, Nummer 23–24, Dezember 2008, S.&nbsp;4886–4897, {{ISSN|1615-9861}}. {{DOI|10.1002/pmic.200800298}}. PMID 19003860.</ref><ref>B. M. Riederer: ''Non-covalent and covalent protein labeling in two-dimensional gel electrophoresis.'' In: ''Journal of proteomics.'' Band 71, Nummer 2, Juli 2008, S.&nbsp;231–244, {{ISSN|1874-3919}}. {{DOI|10.1016/j.jprot.2008.05.001}}. PMID 18556257.</ref> Proteine können mit Biotin-Succinimidylestern ''in vitro'' biotinyliert oder ''in vivo'' mit einem Protein-Tag mit Biotinylierung (z. B. Avi-Tag, BCCP-Tag, Strep-Tag) versehen werden und anschließend indirekt mit [[Avidin]]- oder [[Streptavidin]]-Konjugaten markiert werden.<REF>K. H. Lim, H. Huang, A. Pralle, S. Park: ''Stable, high-affinity streptavidin monomer for protein labeling and monovalent biotin detection.'' In: ''Biotechnology and bioengineering.'' Band 110, Nummer 1, Januar 2013, S.&nbsp;57–67, {{ISSN|1097-0290}}. {{DOI|10.1002/bit.24605}}. PMID 22806584.</ref> Proteine können durch [[Reportergen]]e indirekt nachgewiesen werden.


=== Nukleinsäuren ===
=== Nukleinsäuren ===
[[Datei:DNA Sequencin 3 labeling methods.jpg|mini|hochkant=0.5|Häufig verwendete Markierungen bei der DNA-Sequenzierung.]]
[[Datei:DNA Sequencin 3 labeling methods.jpg|mini|hochkant=0.5|Häufig verwendete Markierungen bei der DNA-Sequenzierung.]]
[[DNA]] besitzt im Vergleich zu Proteinen eine geringere Anzahl verfügbarer funktioneller Gruppen aufgrund der verwendeten [[Nukleotid]]e. Die Phosphatgruppe kann durch radioaktives Phosphat mit einem <sup>32</sup>Phosphoratom im Zuge eines [[Random Priming]], einer [[Nick translation]], einer Erzeugung per [[Phosphoramidit-Synthese]] oder durch [[Biosynthese]] mit radioaktivem Phosphat markiert werden. Auch DNA kann bioorthogonal markiert werden, z. B. mit 5-Ethynyl-2'dUTP.<ref name="Los" /> Durch eine [[Polymerasekettenreaktion]] kann DNA ''in vitro'' mit unnatürlichen [[Nukleotid]]analoga markiert werden, z. B. [[BrdU]], [[Digoxigenin]]-dUTP, Hydroxymethyl-dCTP, fluoreszente Nukleotide in der [[DNA-Sequenzierung]] nach Sänger, der [[QPCR]] oder der [[In-situ-Hybridisierung]] mit [[Hybridisierungssonde]]n.<ref>Y. Du, C. E. Hendrick, K. S. Frye, L. R. Comstock: ''Fluorescent DNA labeling by N-mustard analogues of S-adenosyl-L-methionine.'' In: ''Chembiochem : a European journal of chemical biology.'' Band 13, Nummer 15, Oktober 2012, S.&nbsp;2225–2233, {{ISSN|1439-7633}}. {{DOI|10.1002/cbic.201200438}}. PMID 22961989.</ref><ref>S. E. Walker, J. Lorsch: ''Sanger dideoxy sequencing of DNA.'' In: ''Methods in enzymology.'' Band 529, 2013, S.&nbsp;171–184, {{ISSN|1557-7988}}. {{DOI|10.1016/B978-0-12-418687-3.00014-8}}. PMID 24011045.</ref><ref>R. Redon, T. Fitzgerald, N. P. Carter: ''Comparative genomic hybridization: DNA labeling, hybridization and detection.'' In: ''Methods in molecular biology (Clifton, N.J.).'' Band 529, 2009, S.&nbsp;267–278, {{ISSN|1064-3745}}. {{DOI|10.1007/978-1-59745-538-1_17}}. PMID 19381974. {{PMC|2867219}}.</ref><ref>H. Zohar, S. J. Muller: ''Labeling DNA for single-molecule experiments: methods of labeling internal specific sequences on double-stranded DNA.'' In: ''Nanoscale.'' Band 3, Nummer 8, August 2011, S.&nbsp;3027–3039, {{ISSN|2040-3372}}. {{DOI|10.1039/c1nr10280j}}. PMID 21734993. {{PMC|3322637}}.</ref> Die Aminogruppe des Adenins kann mit Succinimidylestern oder Isothiocyanaten reagieren.
[[DNA]] besitzt im Vergleich zu Proteinen eine geringere Anzahl verfügbarer funktioneller Gruppen aufgrund der verwendeten [[Nukleotid]]e. Die Phosphatgruppe kann durch radioaktives Phosphat mit einem <sup>32</sup>Phosphoratom im Zuge eines [[Random Priming]], einer [[Nick translation]], einer Erzeugung per [[Phosphoramidit-Synthese]] oder durch [[Biosynthese]] mit radioaktivem Phosphat markiert werden. Auch DNA kann bioorthogonal markiert werden, z. B. mit 5-Ethynyl-2'dUTP.<ref name="Los" /> Durch eine [[Polymerasekettenreaktion]] kann DNA ''in vitro'' mit unnatürlichen [[Nukleotid]]analoga markiert werden, z. B. [[BrdU]], [[Digoxigenin]]-dUTP, Hydroxymethyl-dCTP sowie fluoreszente Nukleotide in der [[DNA-Sequenzierung]] nach Sänger, der [[QPCR]] oder der [[In-situ-Hybridisierung]] mit [[Hybridisierungssonde]]n.<ref>Y. Du, C. E. Hendrick, K. S. Frye, L. R. Comstock: ''Fluorescent DNA labeling by N-mustard analogues of S-adenosyl-L-methionine.'' In: ''Chembiochem : a European journal of chemical biology.'' Band 13, Nummer 15, Oktober 2012, S.&nbsp;2225–2233, {{ISSN|1439-7633}}. {{DOI|10.1002/cbic.201200438}}. PMID 22961989.</ref><ref>S. E. Walker, J. Lorsch: ''Sanger dideoxy sequencing of DNA.'' In: ''Methods in enzymology.'' Band 529, 2013, S.&nbsp;171–184, {{ISSN|1557-7988}}. {{DOI|10.1016/B978-0-12-418687-3.00014-8}}. PMID 24011045.</ref><ref>R. Redon, T. Fitzgerald, N. P. Carter: ''Comparative genomic hybridization: DNA labeling, hybridization and detection.'' In: ''Methods in molecular biology (Clifton, N.J.).'' Band 529, 2009, S.&nbsp;267–278, {{ISSN|1064-3745}}. {{DOI|10.1007/978-1-59745-538-1_17}}. PMID 19381974. {{PMC|2867219}}.</ref><ref>H. Zohar, S. J. Muller: ''Labeling DNA for single-molecule experiments: methods of labeling internal specific sequences on double-stranded DNA.'' In: ''Nanoscale.'' Band 3, Nummer 8, August 2011, S.&nbsp;3027–3039, {{ISSN|2040-3372}}. {{DOI|10.1039/c1nr10280j}}. PMID 21734993. {{PMC|3322637}}.</ref> Die Aminogruppe des Adenins kann mit Succinimidylestern oder Isothiocyanaten reagieren.


[[RNA]] kann unter anderem biosynthetisch mit RNA-Tags, chemisch oder mit Hybridisierungssonden markiert werden.<ref>E. Paredes, M. Evans, S. R. Das: ''RNA labeling, conjugation and ligation.'' In: ''Methods (San Diego, Calif.).'' Band 54, Nummer 2, Juni 2011, S.&nbsp;251–259, {{ISSN|1095-9130}}. {{DOI|10.1016/j.ymeth.2011.02.008}}. PMID 21354310.</ref><ref>D. V. Bann, L. J. Parent: ''Application of live-cell RNA imaging techniques to the study of retroviral RNA trafficking.'' In: ''Viruses.'' Band 4, Nummer 6, Juni 2012, S.&nbsp;963–979, {{ISSN|1999-4915}}. {{DOI|10.3390/v4060963}}. PMID 22816035. {{PMC|3397357}}.</ref><ref>J. S. Kaddis, D. H. Wai, J. Bowers, N. Hartmann, L. Baeriswyl, S. Bajaj, M. J. Anderson, R. C. Getts, T. J. Triche: ''Influence of RNA labeling on expression profiling of microRNAs.'' In: ''The Journal of molecular diagnostics : JMD.'' Band 14, Nummer 1, Januar 2012, S.&nbsp;12–21, {{ISSN|1943-7811}}. {{DOI|10.1016/j.jmoldx.2011.08.005}}. PMID 22074760. {{PMC|3338349}}.</ref><ref>K. Cole, V. Truong, D. Barone, G. McGall: ''Direct labeling of RNA with multiple biotins allows sensitive expression profiling of acute leukemia class predictor genes.'' In: ''Nucleic acids research.'' Band 32, Nummer 11, 2004, S.&nbsp;e86, {{ISSN|1362-4962}}. {{DOI|10.1093/nar/gnh085}}. PMID 15205470. {{PMC|443553}}.</ref><ref>V. Olieric, U. Rieder, K. Lang, A. Serganov, C. Schulze-Briese, R. Micura, P. Dumas, E. Ennifar: ''A fast selenium derivatization strategy for crystallization and phasing of RNA structures.'' In: ''RNA (New York, N.Y.).'' Band 15, Nummer 4, April 2009, S.&nbsp;707–715, {{ISSN|1469-9001}}. {{DOI|10.1261/rna.1499309}}. PMID 19228585. {{PMC|2661828}}.</ref> Bei RNA-Tags werden meist DNA-Sequenzen von [[Aptamer]]en in das [[Offenes Leseraster|offene Leseraster]] eines Gens [[Klonierung|kloniert]]. Nach einer Erzeugung der RNA mit dem RNA-Tag durch [[Transkription (Biologie)|Transkription]] bilden sich [[Sekundärstruktur]]en, die z. B. selektiv an [[Dextran]], [[Streptavidin]] oder [[Farbstoff]]e binden.<ref>S. C. Walker, F. H. Scott, C. Srisawat, D. R. Engelke: ''RNA affinity tags for the rapid purification and investigation of RNAs and RNA-protein complexes.'' In: ''Methods in molecular biology (Clifton, N.J.).'' Band 488, 2008, S.&nbsp;23–40, {{ISSN|1064-3745}}. {{DOI|10.1007/978-1-60327-475-3_3}}. PMID 18982282. {{PMC|2807123}}.</ref><ref>J. S. Paige, K. Y. Wu, S. R. Jaffrey: ''RNA mimics of green fluorescent protein.'' In: ''Science (New York, N.Y.).'' Band 333, Nummer 6042, Juli 2011, S.&nbsp;642–646, {{ISSN|1095-9203}}. {{DOI|10.1126/science.1207339}}. PMID 21798953. {{PMC|3314379}}.</ref><ref>R. M. Martin, J. Rino, C. Carvalho, T. Kirchhausen, M. Carmo-Fonseca: ''Live-cell visualization of pre-mRNA splicing with single-molecule sensitivity.'' In: ''Cell reports.'' Band 4, Nummer 6, September 2013, S.&nbsp;1144–1155, {{ISSN|2211-1247}}. {{DOI|10.1016/j.celrep.2013.08.013}}. PMID 24035393. {{PMC|3805459}}.</ref>
[[RNA]] kann unter anderem biosynthetisch mit RNA-Tags, chemisch oder mit Hybridisierungssonden markiert werden.<ref>E. Paredes, M. Evans, S. R. Das: ''RNA labeling, conjugation and ligation.'' In: ''Methods (San Diego, Calif.).'' Band 54, Nummer 2, Juni 2011, S.&nbsp;251–259, {{ISSN|1095-9130}}. {{DOI|10.1016/j.ymeth.2011.02.008}}. PMID 21354310.</ref><ref>D. V. Bann, L. J. Parent: ''Application of live-cell RNA imaging techniques to the study of retroviral RNA trafficking.'' In: ''Viruses.'' Band 4, Nummer 6, Juni 2012, S.&nbsp;963–979, {{ISSN|1999-4915}}. {{DOI|10.3390/v4060963}}. PMID 22816035. {{PMC|3397357}}.</ref><ref>J. S. Kaddis, D. H. Wai, J. Bowers, N. Hartmann, L. Baeriswyl, S. Bajaj, M. J. Anderson, R. C. Getts, T. J. Triche: ''Influence of RNA labeling on expression profiling of microRNAs.'' In: ''The Journal of molecular diagnostics : JMD.'' Band 14, Nummer 1, Januar 2012, S.&nbsp;12–21, {{ISSN|1943-7811}}. {{DOI|10.1016/j.jmoldx.2011.08.005}}. PMID 22074760. {{PMC|3338349}}.</ref><ref>K. Cole, V. Truong, D. Barone, G. McGall: ''Direct labeling of RNA with multiple biotins allows sensitive expression profiling of acute leukemia class predictor genes.'' In: ''Nucleic acids research.'' Band 32, Nummer 11, 2004, S.&nbsp;e86, {{ISSN|1362-4962}}. {{DOI|10.1093/nar/gnh085}}. PMID 15205470. {{PMC|443553}}.</ref><ref>V. Olieric, U. Rieder, K. Lang, A. Serganov, C. Schulze-Briese, R. Micura, P. Dumas, E. Ennifar: ''A fast selenium derivatization strategy for crystallization and phasing of RNA structures.'' In: ''RNA (New York, N.Y.).'' Band 15, Nummer 4, April 2009, S.&nbsp;707–715, {{ISSN|1469-9001}}. {{DOI|10.1261/rna.1499309}}. PMID 19228585. {{PMC|2661828}}.</ref> Bei RNA-Tags werden meist DNA-Sequenzen von [[Aptamer]]en in das [[Offenes Leseraster|offene Leseraster]] eines Gens [[Klonierung|kloniert]]. Nach einer Erzeugung der RNA mit dem RNA-Tag durch [[Transkription (Biologie)|Transkription]] bilden sich [[Sekundärstruktur]]en, die z. B. selektiv an [[Dextran]], [[Streptavidin]] oder [[Farbstoff]]e binden.<ref>S. C. Walker, F. H. Scott, C. Srisawat, D. R. Engelke: ''RNA affinity tags for the rapid purification and investigation of RNAs and RNA-protein complexes.'' In: ''Methods in molecular biology (Clifton, N.J.).'' Band 488, 2008, S.&nbsp;23–40, {{ISSN|1064-3745}}. {{DOI|10.1007/978-1-60327-475-3_3}}. PMID 18982282. {{PMC|2807123}}.</ref><ref>J. S. Paige, K. Y. Wu, S. R. Jaffrey: ''RNA mimics of green fluorescent protein.'' In: ''Science (New York, N.Y.).'' Band 333, Nummer 6042, Juli 2011, S.&nbsp;642–646, {{ISSN|1095-9203}}. {{DOI|10.1126/science.1207339}}. PMID 21798953. {{PMC|3314379}}.</ref><ref>R. M. Martin, J. Rino, C. Carvalho, T. Kirchhausen, M. Carmo-Fonseca: ''Live-cell visualization of pre-mRNA splicing with single-molecule sensitivity.'' In: ''Cell reports.'' Band 4, Nummer 6, September 2013, S.&nbsp;1144–1155, {{ISSN|2211-1247}}. {{DOI|10.1016/j.celrep.2013.08.013}}. PMID 24035393. {{PMC|3805459}}.</ref>

Version vom 2. Februar 2014, 23:12 Uhr

Die Molekülmarkierung (englisch labeling, labelling, tagging) ist eine Methode der Chemie und Biochemie zur selektiven Bindung eines Atoms oder Moleküls an ein Molekül. Die Markierung wird zur weiteren Verfolgung des markierten Moleküls oder zur Aufklärung eines Reaktionsmechanismus (englisch crossover experiment) verwendet.

Eigenschaften

GFP aus Aequorea victoria.

Moleküle können je nach ihren charakteristischen funktionellen Gruppen mit einer selektiv bindenden Markierung versehen werden, die ein nachverfolgbares Signalmolekül (Reportermolekül) trägt. Die Markierung ist dabei meistens kovalent verbunden, kann bei Nukliden aber auch ionisch und bei indirekten Nachweisen über eine Mischung aus ionischen Bindungen, Van-der-Waals-Bindungen, hydrophoben Effekten, Wasserstoffbrücken und teilweise auch Disulfidbrücken gebunden sein. Im Gegensatz zu einer Färbung mit selektiv bindenden Farbstoffen erfolgt die kovalente Markierung von Biomolekülen entweder an einzelnen Atomen oder sequenzspezifisch.

Die Reportermoleküle werden meist über selektiv reaktive Kopplungsgruppen kovalent mit einem flexiblen Abstandshalter (englisch linker ‚Verbinder‘) an bestimmte funktionelle Gruppen des zu markierenden Moleküls gekoppelt. Nuklide können aufgrund ihrer vergleichsweise geringen Molekülgröße auch direkt an ein anderes Molekül gekoppelt werden (ohne reaktive Kopplungsgruppe). Als Reportermoleküle innerhalb der Markierungen werden Nuklide (radioaktive und nicht radioaktive), Biotin, Reporterenzyme, Oligonukleotide, Fluorophore (im Zuge einer Fluoreszenzmarkierung) oder bei Proteinen auch Protein-Tags eingesetzt.[1][2][3][4]

Nuklide (Isotope und Isobare) können direkt an das zu markierende Molekül gekoppelt werden (chemische Kopplung), über eine Kopplungsgruppe angefügt werden, durch eine chemische Totalsynthese (z. B. per Peptidsynthese, per Phosphoramidit-Synthese) oder in einer Biosynthese durch den Umbau Nuklid-markierter Vorläufersubstanzen erzeugt werden (metabolische Markierung). Nuklide können auch ionisch gekoppelt werden, z. B. über Chelatoren wie DTPA oder chelierende Peptide wie das Protein-Tag His-Tag.[5][6] Im Zuge einer chemischen Isotopenmarkierung oder einer metabolischen Isotopenmarkierung werden Moleküle mit radioaktiven Isotopen (z. B. 3H, 11C, 14C, 13N, 15O, 18F, 32P, 33P, 35S, 125I, 131I) markiert.

Eine Markierung kann auch teilweise metabolisch und teilweise synthetisch erfolgen, wie bei der bioorthogonalen Markierung.[7][8][9] Dabei werden Vorläufersubstanzen mit einer reaktiven Gruppe für eine metabolische Markierung verwendet, die anschließend nach einer Proteinreinigung bzw. DNA-Reinigung zur nachträglichen chemischen Kopplung des Reportermoleküls verwendet wird, z. B. per Click-Chemie[10][11] oder per Staudinger-Reaktion.[12][13][14]

Zur Verfolgung des zeitlichen Verlaufs eines markierten Moleküls im Kontext des Stoffwechsels wird als Variante der metabolischen Markierung die Puls-Markierung (englisch pulse labeling) verwendet. Bei der Puls-Markierung wird der Markierungszeitraum zeitlich begrenzt, wodurch die Markierung des Moleküls und seiner Metaboliten genauer eingrenzbar ist und der Wechsel der Markierung auf einzelne nachfolgende Stoffe in einem Stoffwechselweg beobachtet werden kann. Die Verfolgung mehrerer Metabolite gleichzeitig wird auch als metabolische Fluxanalyse (englisch metabolic flux analysis) bezeichnet.[15][16][17][18] Durch die Molekülmarkierung können auch Zellen markiert werden, z. B. für die Durchflusszytometrie, die Fluoreszenzmikroskopie oder die Fluoreszenztomographie.

Bei einer Molekülmarkierung kann das nachzuweisende Molekül direkt mit einem Reportermolekül versehen werden oder indirekt durch selektiv bindende Reporter-tragende Moleküle nachgewiesen werden. Methoden zur Molekülmarkierung sind:

Proteine

Fluoresceinisothiocyanat (FITC).

Im Gegensatz zu Kohlenhydraten und Nukleinsäuren kommen unter den Biomolekülen manche Strukturmotive aufgrund der verschiedenen enthaltenen Aminosäuren nur bei Proteinen vor, z. B. Sulfhydryl-enthaltende Cysteine oder Phenolreste in Tyrosinen. Diese Strukturmotive können mit entsprechenden Kopplungsreagenzien selektiv markiert werden. Cysteine können mit Maleimidestern, Disulfiden oder Iodacetamid selektiv reagieren. Aminosäuren mit primären Aminen an der Seitenkette wie Lysin können durch Succinimidester (N-Hydroxysuccinimid, Sulfosuccinimid- oder andere Succinimidylester) oder bestimmte Isothiocyanate wie PITC oder FITC markiert werden. Nach einer Oxidation von Proteinen können verschiedene Reportermoleküle gekoppelt werden.[19] Mit dem Enzym Sortase können Amine markiert werden.[20] Einige Proteaseinhibitoren führen zu einer selektiven Markierung von Proteinen. Auf dem gleichen Prinzip wie die Markierung basiert auch die Vernetzung und die Fixierung verschiedener Aminosäuren. Bei einem Label-Transfer-Experiment wird eine spaltbare Quervernetzung mit einem Reporter zwischen zwei benachbarten Molekülen verwendet, um durch eine Spaltung der Quervernetzung das Reportermolekül zwischen diesen Molekülen zu übertragen und dadurch deren Nachbarschaft nachzuweisen.

Diazirine.

Auch photoreaktive Moleküle (z. B. Arylazide, Diazirine) können als reaktive Gruppe einer Markierung bei Proteinen verwendet werden, um den Zeitpunkt der Kopplung besser steuern zu können, da die Reaktion erst mit UV-Bestrahlung ausgelöst wird. Aufgrund der geringeren Selektivität dieser radikalisch reagierenden Kopplungsgruppen wird oftmals die Funktionsfähigkeit des Proteins durch Reaktion der radikalischen Kopplungsgruppe mit wichtigen Funktionen (z. B. ein aktives Zentrum eines Enzyms oder eine Bindungsstelle) gemindert.[21] Daher werden photoreaktive Markierungen meistens eingesetzt, wenn keine oder nur eine Amin- oder Sulfhydrylgruppe zur selektiven Kopplung zur Verfügung steht oder eine anschließende Funktionsfähigkeit unerheblich ist. Es existieren auch photoreaktive Diazirin-enthaltende Analoga der Aminosäuren Leucin, Methionin und p-Benzoyl-Phenylalanin, die während der Translation in das Protein eingebaut werden können.[22] Durch eine Peptidsynthese können Peptide mit markierten Aminosäurederivaten hergestellt werden.

Die Markierungen mit Isotopen (oder Isobaren) besitzen unter den Markierungen die kleinsten Änderungen der Molmasse und führen daher zu einer vergleichsweise geringeren Änderung der Proteinstruktur und der biologischen Aktivität, sind jedoch von erhöhten Sicherheitsmaßnahmen und Anforderungen an das Sicherheitslabor begleitet. Die Isotopenmarkierung erfolgt entweder chemisch oder biosynthetisch durch Fütterung von Zellkulturen oder Versuchstieren mit markierten Vorläufermolekülen. Durch eine Radioiodierung können Tyrosine mit radioaktivem Iod markiert werden.[23] Phosphorylierungen von Serin, Threonin und Tyrosin werden meist enzymatisch mit geeigneten Proteinkinasen und radioaktivem Phosphor-haltigem Adenosintriphosphat durchgeführt.[24] Eine radioaktiv markierte Prenylierung kann mit 3H-Mevalonsäure durchgeführt werden.[25] Daneben wird im Zuge einer Prenylierung der C-Terminus methyliert, der durch 3H-markiertes S-Adenosyl-Methionin reversibel radioaktiv markiert werden kann.[25] Durch eine Myristylierung kann N-terminal markiert werden.[26] Sulfatierungen können mit 35S-markiertem Sulfat nachgewiesen werden.[25] Wasserstoffatome können durch eine Deuterierung mit Deuterium ausgetauscht werden. Die Markierung mit radioaktiven Isotopen erlaubt eine Verfolgung per Autoradiographie, per Szintillationszähler oder per Positronen-Emissions-Tomographie.[27][28] In der Massenspektrometrie wird die Isobarenmarkierung zur Unterscheidung verschiedener Proben verwendet.[29][30] Neben den üblicherweise verwendeten Nukliden 1Wasserstoff oder 15Stickstoff werden in der NMR-Spektroskopie Markierungen mit 13Kohlenstoff oder 19Fluor verwendet.[31][32]

Aminosäuren für eine bioorthogonale Markierung.
Kopplung von Membranproteinen mit Aziden.

Proteine können bioorthogonal markiert werden. Hierbei werden verschiedene selektive Kopplungsreaktionen verwendet, z. B. per Sonogashira-Kupplung,[33] per kupferkatalysierter Alkin-Azid-Cycloaddition,[34][35] per Heck-Reaktion,[36] per Oxim-Ligation,[37] per Cyclopropen-Azid-Kopplung,[38] per Myristylierung,[26] per Cyanobenzothiazol-Kondensation,[39][40][41][42] Membranproteine können nach der Biosynthese enzymatisch mit Aziden gekoppelt werden, die wiederum per Staudinger-Reaktion mit Reportermolekülen gekoppelt werden.[43]

Proteine können als rekombinante Proteine mit einem Protein-Tag oder mit einem Reporterprotein als Fusionsprotein hergestellt werden, das während der Translation N-terminal oder C-terminal an das Protein angehängt wird. Über das in das rekombinante Protein eingefügte Protein-Tag kann ein Protein aufgereinigt oder nachgewiesen werden, z. B. mit GFP oder mit Reporterenzymen. Manche Protein-Tags werden nach der Biosynthese nachträglich mit einem Reportermolekül gekoppelt, z. B. das Snap-Tag, das Flash-Tag, das Clip-Tag, das HyRe-Tag, das beta-Lactamase-Tag, das LAP-Tag und das Sortase-Tag.[44][45][46][20] Durch Inteine können Proteine posttranslational markiert werden.[47][48]

Bei einer Immunmarkierung mit Immunkonjugaten basiert die Selektivität der Markierung auf der Bindung von Antikörpern, daneben ist der Antikörper meist selbst oder über einen Sekundärantikörper mit einem Reportermolekül markiert, der indirekt zum Nachweis dient, z. B. bei der Fluoreszenzmikroskopie, beim Western Blot und beim ELISA. Das vom Antikörper gebundene Epitop ist dabei entweder im Protein oder an einem Protein-Tag. In der DIGE werden unterschiedlich markierte Proben gemeinsam per SDS-PAGE oder 2D-Gelelektrophorese aufgetrennt.[49][50][51] Proteine können mit Biotin-Succinimidylestern in vitro biotinyliert oder in vivo mit einem Protein-Tag mit Biotinylierung (z. B. Avi-Tag, BCCP-Tag, Strep-Tag) versehen werden und anschließend indirekt mit Avidin- oder Streptavidin-Konjugaten markiert werden.[52] Proteine können durch Reportergene indirekt nachgewiesen werden.

Nukleinsäuren

Häufig verwendete Markierungen bei der DNA-Sequenzierung.

DNA besitzt im Vergleich zu Proteinen eine geringere Anzahl verfügbarer funktioneller Gruppen aufgrund der verwendeten Nukleotide. Die Phosphatgruppe kann durch radioaktives Phosphat mit einem 32Phosphoratom im Zuge eines Random Priming, einer Nick translation, einer Erzeugung per Phosphoramidit-Synthese oder durch Biosynthese mit radioaktivem Phosphat markiert werden. Auch DNA kann bioorthogonal markiert werden, z. B. mit 5-Ethynyl-2'dUTP.[11] Durch eine Polymerasekettenreaktion kann DNA in vitro mit unnatürlichen Nukleotidanaloga markiert werden, z. B. BrdU, Digoxigenin-dUTP, Hydroxymethyl-dCTP sowie fluoreszente Nukleotide in der DNA-Sequenzierung nach Sänger, der QPCR oder der In-situ-Hybridisierung mit Hybridisierungssonden.[53][54][55][56] Die Aminogruppe des Adenins kann mit Succinimidylestern oder Isothiocyanaten reagieren.

RNA kann unter anderem biosynthetisch mit RNA-Tags, chemisch oder mit Hybridisierungssonden markiert werden.[57][58][59][60][61] Bei RNA-Tags werden meist DNA-Sequenzen von Aptameren in das offene Leseraster eines Gens kloniert. Nach einer Erzeugung der RNA mit dem RNA-Tag durch Transkription bilden sich Sekundärstrukturen, die z. B. selektiv an Dextran, Streptavidin oder Farbstoffe binden.[62][63][64]

Kohlenhydrate

Bioorthogonale Markierung mit modifiziertem Glucosamin.

Markierte Kohlenhydrate werden durch metabolische oder bioorthogonale Markierung erzeugt, chemisch markiert oder die Kohlenhydrate werden indirekt über Lektine nachgewiesen.[65][66]

Literatur

Einzelnachweise

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