„CRISPR/Cas-Methode“ – Versionsunterschied

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=== Spezifität ===
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Bei der Erzeugung von Doppelstrangbrüchen können unerwünschte [[Mutation]]en entstehen, die als ''off-target''-Effekte bezeichnet werden.<ref name="Fu_2013">Y. Fu, J. A. Foden, C. Khayter, M. L. Maeder, D. Reyon, J. K. Joung, J. D. Sander: ''High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells.'' In: ''[[Nature Biotechnology]].'' Band 31, Nummer 9, September 2013, S.&nbsp;822–826, {{DOI|10.1038/nbt.2623}}, PMID 23792628, {{PMC|3773023}}.</ref><ref name="Cho_2014">S. W. Cho, S. Kim, Y. Kim, J. Kweon, H. S. Kim, S. Bae, J. S. Kim: ''Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases.'' In: ''Genome research.'' Band 24, Nummer 1, Januar 2014, S.&nbsp;132–141, {{DOI|10.1101/gr.162339.113}}, PMID 24253446, {{PMC|3875854}}.</ref><ref name="Veres_2014">A. Veres, B. S. Gosis, Q. Ding, R. Collins, A. Ragavendran, H. Brand, S. Erdin, C. A. Cowan, M. E. Talkowski, K. Musunuru: ''Low incidence of off-target mutations in individual CRISPR-Cas9 and TALEN targeted human stem cell clones detected by whole-genome sequencing.'' In: ''Cell stem cell.'' Band 15, Nummer 1, Juli 2014, S.&nbsp;27–30, {{DOI|10.1016/j.stem.2014.04.020}}, PMID 24996167, {{PMC|4082799}}.</ref> Durch einen unspezifischen Schnitt können Gene in ihrer Funktion gestört werden. Unter die ''off-target''-Effekte fallen [[Punktmutation]]en (Basenänderungen),<ref>H. Wang, H. Yang, C. S. Shivalila, M. M. Dawlaty, A. W. Cheng, F. Zhang, R. Jaenisch: ''One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.'' In: ''[[Cell (Zeitschrift)|Cell]].'' Band 153, Nummer 4, Mai 2013, S.&nbsp;910–918, {{DOI|10.1016/j.cell.2013.04.025}}, PMID 23643243, {{PMC|3969854}}.</ref> [[Deletion]]en (Entfernungen von DNA-Sequenzen),<ref name="Lin_2014">Y. Lin, T. J. Cradick, M. T. Brown, H. Deshmukh, P. Ranjan, N. Sarode, B. M. Wile, P. M. Vertino, F. J. Stewart, G. Bao: ''CRISPR/Cas9 systems have off-target activity with insertions or deletions between target DNA and guide RNA sequences.'' In: ''Nucleic acids research.'' Band 42, Nummer 11, Juni 2014, S.&nbsp;7473–7485, {{DOI|10.1093/nar/gku402}}, PMID 24838573, {{PMC|4066799}}.</ref><ref name="Cradick_2013">T. J. Cradick, E. J. Fine, C. J. Antico, G. Bao: ''CRISPR/Cas9 systems targeting β-globin and CCR5 genes have substantial off-target activity.'' In: ''Nucleic acids research.'' Band 41, Nummer 20, November 2013, S.&nbsp;9584–9592, {{DOI|10.1093/nar/gkt714}}, PMID 23939622, {{PMC|3814385}}.</ref> [[Insertion (Genetik)|Insertionen]] (Einfügungen von DNA-Sequenzen),<ref name="Veres_2014" /> [[Inversion (Genetik)|Inversionen]] (Einfügungen von DNA-Sequenzen mit umgekehrter Abfolge),<ref name="Veres_2014" /> und [[Translokation (Genetik)|Translokationen]] (Verbindungen mit anderen DNA-Strängen).<ref name="Kim_2015">D. Kim, S. Bae, J. Park, E. Kim, S. Kim, H. R. Yu, J. Hwang, J. I. Kim, J. S. Kim: ''Digenome-seq: genome-wide profiling of CRISPR-Cas9 off-target effects in human cells.'' In: ''Nature methods.'' Band 12, Nummer 3, März 2015, S.&nbsp;237–43, 1 p following 243, {{DOI|10.1038/nmeth.3284}}, PMID 25664545.</ref><ref name="Cradick_2013" /> Es wurde beschrieben, dass teilweise über 50 % der Schnitte ''off-target'' erfolgten.<ref name="Fu_2013" /><ref name="Lin_2014" /> Die Bindung der sgRNA an eine Zielsequenz toleriert auch Basenfehlpaarungen, wodurch sich die Zahl der möglichen Bindungsstellen auf mehrere tausend erhöht, wodurch experimentelle und sicherheitstechnische Probleme entstehen,<ref>P. D. Hsu, E. S. Lander, F. Zhang: ''Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.'' In: ''[[Cell (Zeitschrift)|Cell]].'' Band 157, Nummer 6, Juni 2014, S.&nbsp;1262–1278, {{DOI|10.1016/j.cell.2014.05.010}}, PMID 24906146, {{PMC|4343198}}.</ref><ref name="Fu_2013" /> die typisch für unspezifische Mutationen sind. Experimentelle Probleme sind irreführende und nicht [[Reproduzierbarkeit|reproduzierbare]] Ergebnisse.<ref name="Cong_2015" /> Als sichterheitstechnisches Problem wird eine mögliche Entstehung von [[Krebs (Medizin)|Krebs]] angesehen.<ref>A. Eid, M. M. Mahfouz: ''Genome editing: the road of CRISPR/Cas9 from bench to clinic.'' In: ''Experimental & molecular medicine.'' Band 48, Nummer 10, 10 2016, S.&nbsp;e265, {{DOI|10.1038/emm.2016.111}}, PMID 27741224, {{PMC|5099421}}.</ref>
Bei der Erzeugung von Doppelstrangbrüchen können unerwünschte [[Mutation]]en entstehen, die als ''off-target''-Effekte bezeichnet werden.<ref name="Fu_2013">Y. Fu, J. A. Foden, C. Khayter, M. L. Maeder, D. Reyon, J. K. Joung, J. D. Sander: ''High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells.'' In: ''[[Nature Biotechnology]].'' Band 31, Nummer 9, September 2013, S.&nbsp;822–826, {{DOI|10.1038/nbt.2623}}, PMID 23792628, {{PMC|3773023}}.</ref><ref name="Cho_2014">S. W. Cho, S. Kim, Y. Kim, J. Kweon, H. S. Kim, S. Bae, J. S. Kim: ''Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases.'' In: ''Genome research.'' Band 24, Nummer 1, Januar 2014, S.&nbsp;132–141, {{DOI|10.1101/gr.162339.113}}, PMID 24253446, {{PMC|3875854}}.</ref><ref name="Veres_2014">A. Veres, B. S. Gosis, Q. Ding, R. Collins, A. Ragavendran, H. Brand, S. Erdin, C. A. Cowan, M. E. Talkowski, K. Musunuru: ''Low incidence of off-target mutations in individual CRISPR-Cas9 and TALEN targeted human stem cell clones detected by whole-genome sequencing.'' In: ''Cell stem cell.'' Band 15, Nummer 1, Juli 2014, S.&nbsp;27–30, {{DOI|10.1016/j.stem.2014.04.020}}, PMID 24996167, {{PMC|4082799}}.</ref> Durch einen unspezifischen Schnitt können Gene in ihrer Funktion gestört werden. Unter die ''off-target''-Effekte fallen [[Punktmutation]]en (Basenänderungen),<ref>H. Wang, H. Yang, C. S. Shivalila, M. M. Dawlaty, A. W. Cheng, F. Zhang, R. Jaenisch: ''One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.'' In: ''[[Cell (Zeitschrift)|Cell]].'' Band 153, Nummer 4, Mai 2013, S.&nbsp;910–918, {{DOI|10.1016/j.cell.2013.04.025}}, PMID 23643243, {{PMC|3969854}}.</ref> [[Deletion]]en (Entfernungen von DNA-Sequenzen),<ref name="Lin_2014">Y. Lin, T. J. Cradick, M. T. Brown, H. Deshmukh, P. Ranjan, N. Sarode, B. M. Wile, P. M. Vertino, F. J. Stewart, G. Bao: ''CRISPR/Cas9 systems have off-target activity with insertions or deletions between target DNA and guide RNA sequences.'' In: ''Nucleic acids research.'' Band 42, Nummer 11, Juni 2014, S.&nbsp;7473–7485, {{DOI|10.1093/nar/gku402}}, PMID 24838573, {{PMC|4066799}}.</ref><ref name="Cradick_2013">T. J. Cradick, E. J. Fine, C. J. Antico, G. Bao: ''CRISPR/Cas9 systems targeting β-globin and CCR5 genes have substantial off-target activity.'' In: ''Nucleic acids research.'' Band 41, Nummer 20, November 2013, S.&nbsp;9584–9592, {{DOI|10.1093/nar/gkt714}}, PMID 23939622, {{PMC|3814385}}.</ref> [[Insertion (Genetik)|Insertionen]] (Einfügungen von DNA-Sequenzen),<ref name="Veres_2014" /> [[Inversion (Genetik)|Inversionen]] (Einfügungen von DNA-Sequenzen mit umgekehrter Abfolge),<ref name="Veres_2014" /> und [[Translokation (Genetik)|Translokationen]] (Verbindungen mit anderen DNA-Strängen).<ref name="Kim_2015">D. Kim, S. Bae, J. Park, E. Kim, S. Kim, H. R. Yu, J. Hwang, J. I. Kim, J. S. Kim: ''Digenome-seq: genome-wide profiling of CRISPR-Cas9 off-target effects in human cells.'' In: ''Nature methods.'' Band 12, Nummer 3, März 2015, S.&nbsp;237–43, 1 p following 243, {{DOI|10.1038/nmeth.3284}}, PMID 25664545.</ref><ref name="Cradick_2013" /> Es wurde beschrieben, dass teilweise über 50 % der Schnitte ''off-target'' erfolgten.<ref name="Fu_2013" /><ref name="Lin_2014" /> Die Bindung der sgRNA an eine Zielsequenz toleriert auch Basenfehlpaarungen, wodurch sich die Zahl der möglichen Bindungsstellen auf mehrere tausend erhöht, wodurch experimentelle und sicherheitstechnische Probleme entstehen,<ref>P. D. Hsu, E. S. Lander, F. Zhang: ''Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.'' In: ''[[Cell (Zeitschrift)|Cell]].'' Band 157, Nummer 6, Juni 2014, S.&nbsp;1262–1278, {{DOI|10.1016/j.cell.2014.05.010}}, PMID 24906146, {{PMC|4343198}}.</ref><ref name="Fu_2013" /> die typisch für unspezifische Mutationen sind. Experimentelle Probleme sind irreführende und nicht [[Reproduzierbarkeit|reproduzierbare]] Ergebnisse.<ref name="Cong_2015">L. Cong, F. Zhang: ''Genome engineering using CRISPR-Cas9 system.'' In: ''Methods in molecular biology.'' Band 1239, 2015, S.&nbsp;197–217, {{DOI|10.1007/978-1-4939-1862-1_10}}, PMID 25408407.</ref> Als sichterheitstechnisches Problem wird eine mögliche Entstehung von [[Krebs (Medizin)|Krebs]] angesehen.<ref>A. Eid, M. M. Mahfouz: ''Genome editing: the road of CRISPR/Cas9 from bench to clinic.'' In: ''Experimental & molecular medicine.'' Band 48, Nummer 10, 10 2016, S.&nbsp;e265, {{DOI|10.1038/emm.2016.111}}, PMID 27741224, {{PMC|5099421}}.</ref>


Zur Minimierung unspezifischer DNA-Schnitte und der daraus potentiell folgenden [[Mutagenese]] werden verschiedene Ansätze zur Erhöhung der [[Beurteilung eines Klassifikators|Spezifität]] untersucht,<ref name="Fu_2014b">Y. Fu, J. D. Sander, D. Reyon, V. M. Cascio, J. K. Joung: ''Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs.'' In: ''[[Nature Biotechnology]].'' Band 32, Nummer 3, März 2014, S.&nbsp;279–284, {{DOI|10.1038/nbt.2808}}, PMID 24463574, {{PMC|3988262}}.</ref><ref>K. Standage-Beier, Q. Zhang, X. Wang: ''Targeted Large-Scale Deletion of Bacterial Genomes Using CRISPR-Nickases.'' In: ''ACS synthetic biology.'' Band 4, Nummer 11, November 2015, S.&nbsp;1217–1225, {{DOI|10.1021/acssynbio.5b00132}}, PMID 26451892, {{PMC|4655420}}.</ref> wie [[Proteindesign]] der Cas9 oder Ersatz der Endonukleaseaktivität von Cas9 durch [[Fusionsprotein|Kombination]] mit anderen Endonukleasen.<ref name="Tsai_2014b">S. Q. Tsai, N. Wyvekens, C. Khayter, J. A. Foden, V. Thapar, D. Reyon, M. J. Goodwin, M. J. Aryee, J. K. Joung: ''Dimeric CRISPR RNA-guided FokI nucleases for highly specific genome editing.'' In: ''[[Nature Biotechnology]].'' Band 32, Nummer 6, Juni 2014, S.&nbsp;569–576, {{DOI|10.1038/nbt.2908}}, PMID 24770325, {{PMC|4090141}}.</ref> Entsprechend wurden verschiedene Methoden zur Detektion solcher Mutationen entwickelt.<ref>J. Zischewski, R. Fischer, L. Bortesi: ''Detection of on-target and off-target mutations generated by CRISPR/Cas9 and other sequence-specific nucleases.'' In: ''[[Biotechnology Advances]].'' Band 35, Nummer 1, 2017 Jan - Feb, S.&nbsp;95–104, {{DOI|10.1016/j.biotechadv.2016.12.003}}, PMID 28011075.</ref><ref name="Kim_2015" /><ref name="Tsai_2017">S. Q. Tsai, N. T. Nguyen, J. Malagon-Lopez, V. V. Topkar, M. J. Aryee, J. K. Joung: ''CIRCLE-seq: a highly sensitive in vitro screen for genome-wide CRISPR-Cas9 nuclease off-targets.'' In: ''Nature methods.'' Band 14, Nummer 6, Juni 2017, S.&nbsp;607–614, {{DOI|10.1038/nmeth.4278}}, PMID 28459458, {{PMC|5924695}}.</ref> Ebenso wurden Computerprogramme und Datenbanken entwickelt, um ''off-target''-Effekte vorherzusagen.<ref>R. Singh, C. Kuscu, A. Quinlan, Y. Qi, M. Adli: ''Cas9-chromatin binding information enables more accurate CRISPR off-target prediction.'' In: ''Nucleic acids research.'' Band 43, Nummer 18, Oktober 2015, S.&nbsp;e118, {{DOI|10.1093/nar/gkv575}}, PMID 26032770, {{PMC|4605288}}.</ref><ref>S. Q. Tsai, Z. Zheng, N. T. Nguyen, M. Liebers, V. V. Topkar, V. Thapar, N. Wyvekens, C. Khayter, A. J. Iafrate, L. P. Le, M. J. Aryee, J. K. Joung: ''GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases.'' In: ''[[Nature Biotechnology]].'' Band 33, Nummer 2, Februar 2015, S.&nbsp;187–197, {{DOI|10.1038/nbt.3117}}, PMID 25513782, {{PMC|4320685}}.
Zur Minimierung unspezifischer DNA-Schnitte und der daraus potentiell folgenden [[Mutagenese]] werden verschiedene Ansätze zur Erhöhung der [[Beurteilung eines Klassifikators|Spezifität]] untersucht,<ref name="Fu_2014b">Y. Fu, J. D. Sander, D. Reyon, V. M. Cascio, J. K. Joung: ''Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs.'' In: ''[[Nature Biotechnology]].'' Band 32, Nummer 3, März 2014, S.&nbsp;279–284, {{DOI|10.1038/nbt.2808}}, PMID 24463574, {{PMC|3988262}}.</ref><ref>K. Standage-Beier, Q. Zhang, X. Wang: ''Targeted Large-Scale Deletion of Bacterial Genomes Using CRISPR-Nickases.'' In: ''ACS synthetic biology.'' Band 4, Nummer 11, November 2015, S.&nbsp;1217–1225, {{DOI|10.1021/acssynbio.5b00132}}, PMID 26451892, {{PMC|4655420}}.</ref> wie [[Proteindesign]] der Cas9 oder Ersatz der Endonukleaseaktivität von Cas9 durch [[Fusionsprotein|Kombination]] mit anderen Endonukleasen.<ref name="Tsai_2014b">S. Q. Tsai, N. Wyvekens, C. Khayter, J. A. Foden, V. Thapar, D. Reyon, M. J. Goodwin, M. J. Aryee, J. K. Joung: ''Dimeric CRISPR RNA-guided FokI nucleases for highly specific genome editing.'' In: ''[[Nature Biotechnology]].'' Band 32, Nummer 6, Juni 2014, S.&nbsp;569–576, {{DOI|10.1038/nbt.2908}}, PMID 24770325, {{PMC|4090141}}.</ref> Entsprechend wurden verschiedene Methoden zur Detektion solcher Mutationen entwickelt.<ref>J. Zischewski, R. Fischer, L. Bortesi: ''Detection of on-target and off-target mutations generated by CRISPR/Cas9 and other sequence-specific nucleases.'' In: ''[[Biotechnology Advances]].'' Band 35, Nummer 1, 2017 Jan - Feb, S.&nbsp;95–104, {{DOI|10.1016/j.biotechadv.2016.12.003}}, PMID 28011075.</ref><ref name="Kim_2015" /><ref name="Tsai_2017">S. Q. Tsai, N. T. Nguyen, J. Malagon-Lopez, V. V. Topkar, M. J. Aryee, J. K. Joung: ''CIRCLE-seq: a highly sensitive in vitro screen for genome-wide CRISPR-Cas9 nuclease off-targets.'' In: ''Nature methods.'' Band 14, Nummer 6, Juni 2017, S.&nbsp;607–614, {{DOI|10.1038/nmeth.4278}}, PMID 28459458, {{PMC|5924695}}.</ref> Ebenso wurden Computerprogramme und Datenbanken entwickelt, um ''off-target''-Effekte vorherzusagen.<ref>R. Singh, C. Kuscu, A. Quinlan, Y. Qi, M. Adli: ''Cas9-chromatin binding information enables more accurate CRISPR off-target prediction.'' In: ''Nucleic acids research.'' Band 43, Nummer 18, Oktober 2015, S.&nbsp;e118, {{DOI|10.1093/nar/gkv575}}, PMID 26032770, {{PMC|4605288}}.</ref><ref>S. Q. Tsai, Z. Zheng, N. T. Nguyen, M. Liebers, V. V. Topkar, V. Thapar, N. Wyvekens, C. Khayter, A. J. Iafrate, L. P. Le, M. J. Aryee, J. K. Joung: ''GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases.'' In: ''[[Nature Biotechnology]].'' Band 33, Nummer 2, Februar 2015, S.&nbsp;187–197, {{DOI|10.1038/nbt.3117}}, PMID 25513782, {{PMC|4320685}}.

Version vom 20. Januar 2019, 21:31 Uhr

CRISPR/Cas-Komplex mit DNA

Die CRISPR/Cas-Methode (von engl. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats ‚gruppierte kurze palindromische Wiederholungen mit regelmäßigen Abständen‘ und CRISPR-associated ‚CRISPR-assoziiert‘) ist eine molekularbiologische Methode, um DNA gezielt zu schneiden und zu verändern (Genome Editing). Gene können mit dem CRISPR/Cas-System eingefügt, entfernt oder ausgeschaltet werden,[1] auch Nukleotide in einem Gen können geändert werden.[2] Aufgrund der einfachen Durchführung, der Skalierbarkeit und der geringen Kosten wird die CRISPR/Cas-Methode zunehmend in der Forschung eingesetzt.[3][4]

Die wissenschaftliche Grundlage zur Entwicklung der CRISPR/Cas-Methode wurde durch die Entdeckung und Erforschung der CRISPR-Sequenzen und des damit verbundenen CRISPR/Cas-Systems im Immunsystem verschiedener Bakterien und Archaea gelegt. Die erste wissenschaftliche Dokumentation zur Entwicklung und zum Einsatz der Methode wurde 2012 durch eine Arbeitsgruppe um Emmanuelle Charpentier und Jennifer Doudna veröffentlicht. Die wissenschaftliche Fachzeitschrift Science erklärte die CRISPR-Methode zum Breakthrough of the Year 2015.[5]

Eigenschaften

3D-Struktur des CRISPR-Cas9-Interferenz-Komplexes
CRISPR-Cas9 kann als molekulares Werkzeug gezielt DNA-Doppelstrangbrüche einführen.
Die durch CRISPR-Cas9 gezielt eingeführten DNA-Doppelstrangbrüche eröffnen den Weg zu genetischer Manipulation.

Die CRISPR/Cas-Methode basiert auf einem adaptiven antiviralen Abwehrmechanismus von Bakterien, dem CRISPR.[6][7] Sie wird verwendet, um DNA an einer bestimmbaren DNA-Sequenz zu schneiden. Dadurch können beispielsweise DNA-Sequenzen entfernt oder andere DNA-Sequenzen an dieser Stelle eingefügt werden. Das CRISPR/Cas-System kann durch Zugabe eines DNA-Oligonukleotids auch zur Veränderung von RNA verwendet werden.[8][9] Der Effekt der Unterdrückung eines Gens durch CRISPR/Cas besitzt verschiedene Ähnlichkeiten mit demjenigen der RNA-Interferenz, da bei beiden bakteriellen Abwehrmechanismen kurze RNA-Stücke von etwa 18 bis 20 Nukleotiden die Bindung an das Ziel vermitteln.[10]

Cas-Proteine können als Ribonukleoproteine bestimmte RNA-Sequenzen binden. Die Endonuklease Cas9 (von englisch CRISPR-associated, veraltet auch Cas5, Csn1 oder Csx12) kann eine bestimmte RNA-Sequenz (crRNA repeat, Sequenz GUUUUAGAGCU(A/G)UG(C/U)UGUUUUG)[11] binden und in der unmittelbaren Umgebung DNA schneiden. Diese crRNA-repeat-Sequenz bildet eine RNA-Sekundärstruktur und wird dann von Cas9 gebunden,[12] wodurch eine Änderung der Proteinfaltung von Cas9 erfolgt und die Ziel-DNA von der RNA gebunden wird.[13] Darüber hinaus ist das Vorhandensein eines PAM-Motivs (englisch protospacer adjacent motif ‚Angrenzendes Motiv an den Protospacer‘) mit der Sequenz NGG (mit N als beliebige Nukleinbase gefolgt von zwei Guaninen) in der Ziel-DNA für eine Aktivierung von Cas9 notwendig.[14] Der Schnitt der DNA erfolgt drei Nukleotide vor dem PAM. An der crRNA-repeat-Sequenz befindet sich anschließend eine an die Ziel-DNA bindende Sequenz (crRNA spacer); beide Sequenzen werden zusammen als crRNA bezeichnet. Als zweiter Teil der crRNA dient die crRNA-spacer-Sequenz in der Funktion eines variablen Adapters, die komplementär zur Ziel-DNA ist und an die Ziel-DNA bindet. Zudem ist noch eine RNA (tracrRNA, von engl. trans-acting CRISPR RNA) notwendig. Die tracrRNA ist teilweise komplementär zur crRNA, weshalb sie aneinander binden. Die tracrRNA bindet an eine Vorläufer-crRNA, bildet eine RNA-Doppelhelix und wird durch die RNase III in die aktive Form überführt.[15][1][16] Durch diese Eigenschaften wird die DNA gebunden und von der Endonukleasefunktion nahe der Bindungsstelle geschnitten. Die DNA-Reparatur des erzeugten Doppelstrangbruchs erfolgt durch homology-directed repair (HDR) oder durch non-homologous end joining (NHEJ).

Anpassung an die Zielsequenz

Wird an eine crRNA repeat-Sequenz anstatt der natürlich vorkommenden crRNA-spacer-Sequenz eine andere, zu einer DNA-Zielsequenz komplementäre RNA-Sequenz angefügt und diese crRNA zu einer tracrRNA hinzugegeben, schneidet Cas9 die DNA nahe der geänderten Zielsequenz. Die an die Ziel-DNA bindende Sequenz besteht aus 20 Nukleotiden, von denen vor allem die 12 an das PAM angrenzenden Nukleotide für die Bindungsspezifität entscheidend sind.[17] Die beiden RNA-Stränge der crRNA und der tracrRNA können auch in einem einzelnen, teilweise selbsthybridisierenden RNA-Strang untergebracht werden (sgRNA ‚single guide RNA‘).[1] Durch das Cas9 mit den entsprechend geänderten RNA-Sequenzen kann sequenzspezifisch doppelsträngige, teilweise komplementäre DNA geschnitten werden, wodurch gezielte Deletionen erzeugt werden können.

Nukleotidsubstitution

Einzelne Cytidine können durch ein Fusionsprotein aus Cas9 ohne doppelsträngige Endonuklease mit einer Cytidindeaminase in Thymidin umgewandelt werden.[18] Dadurch entsteht eine Substitutionsmutation.

Insertionen

Durch Doppelstrangbrüche kann die Häufigkeit einer homologen Rekombination deutlich erhöht werden,[19] wodurch ein sequenzspezifischer Schnitt durch Cas9 auch zum Einfügen von DNA-Sequenzen (z. B. im Zuge der Gentherapie) verwendet werden kann, sofern die anschließend einzufügende DNA an beiden Enden jeweils eine zur jeweiligen Zielsequenz überlappende Sequenz aufweist.[20]

Spezifität

Bei der Erzeugung von Doppelstrangbrüchen können unerwünschte Mutationen entstehen, die als off-target-Effekte bezeichnet werden.[21][22][23] Durch einen unspezifischen Schnitt können Gene in ihrer Funktion gestört werden. Unter die off-target-Effekte fallen Punktmutationen (Basenänderungen),[24] Deletionen (Entfernungen von DNA-Sequenzen),[25][26] Insertionen (Einfügungen von DNA-Sequenzen),[23] Inversionen (Einfügungen von DNA-Sequenzen mit umgekehrter Abfolge),[23] und Translokationen (Verbindungen mit anderen DNA-Strängen).[27][26] Es wurde beschrieben, dass teilweise über 50 % der Schnitte off-target erfolgten.[21][25] Die Bindung der sgRNA an eine Zielsequenz toleriert auch Basenfehlpaarungen, wodurch sich die Zahl der möglichen Bindungsstellen auf mehrere tausend erhöht, wodurch experimentelle und sicherheitstechnische Probleme entstehen,[28][21] die typisch für unspezifische Mutationen sind. Experimentelle Probleme sind irreführende und nicht reproduzierbare Ergebnisse.[29] Als sichterheitstechnisches Problem wird eine mögliche Entstehung von Krebs angesehen.[30]

Zur Minimierung unspezifischer DNA-Schnitte und der daraus potentiell folgenden Mutagenese werden verschiedene Ansätze zur Erhöhung der Spezifität untersucht,[31][32] wie Proteindesign der Cas9 oder Ersatz der Endonukleaseaktivität von Cas9 durch Kombination mit anderen Endonukleasen.[33] Entsprechend wurden verschiedene Methoden zur Detektion solcher Mutationen entwickelt.[34][27][35] Ebenso wurden Computerprogramme und Datenbanken entwickelt, um off-target-Effekte vorherzusagen.[36][37]

Die Mutation von Asparaginsäure zu Alanin an der Position 10 in Cas9 (kurz: D10A) oder von Histidin zu Alanin an der Position 840 (H840A) inaktiviert die doppelsträngige Endonukleasefunktion des gebundenen DNA-Stranges unter Erhalt der RNA-DNA-Bindungsfunktion und einer einzelsträngigen Endonukleasefunktion.[38][39] Zudem wird die Spezifität durch die Affinität der RNA-DNA-Bindung an Cas9 bestimmt.[40][41][42] Durch Verwendung zweier verschiedener sgRNA, deren an die Ziel-DNA bindende Sequenzen geringfügig versetzt sind, kann die Spezifität des Schnitts erhöht werden.[38][43] Dabei werden zwei geringfügig verschiedene Cas9-sgRNA-Komplexe mit unterschiedlicher Spezifität gebildet (paired nickases). Zudem entstehen durch die versetzten Einzelstrangbrüche sticky ends, die eine Insertion einer DNA mit komplementären sticky ends erleichtern. Einzelstrangbrüche werden durch die Basenexzisionsreparatur[38] und die HDR geschlossen,[44] die weniger Mutationen als die Reparatur per NHEJ erzeugen.[38]

Einbringung in Zellen

Durch Transformation oder Transfektion von einem Vektor können Lebewesen mit dem CRISPR/Cas-System "ergänzt" werden, die es natürlicherweise nicht besitzen, z. B. manche Bakterienstämme,[45] Bäckerhefe,[46] Taufliegen,[47] Zebrabärblinge,[48] Mäuse[49] und Menschen.[50][51] Üblicherweise wird CRISPR/Cas per Plasmid in einen Organismus eingefügt, alternativ kann auch der Komplex aus Cas9 mit einer sgRNA in Zellen eingeschleust werden.[52]

Für ein Genome Editing in der Keimbahn werden als Methoden zur Einschleusung des CRISPR/Cas9 die Elektroporation und die Mikroinjektion eingesetzt. Die gleichzeitige Änderung mehrerer DNA-Zielsequenzen wird als Multiplex Genome Editing bezeichnet.

Regulation

Die Verwendung von Anti-CRISPR-Proteinen wurde zur konditionalen Hemmung von CRISPR/Cas und somit zur zeitlichen, gewebsspezifischen oder zellzyklusabschnittsspezifischen Steuerung der CRISPR-Cas-Methode vorgeschlagen.[53] Da CRISPR/Cas DNA schneidet, solange es aktiv ist, kann eine zeitliche Begrenzung auch unspezifische Schnitte begrenzen, die zu unerwünschten Mutationen führen können.[53]

Beispielsweise werden Anti-CRISPR-Proteine zu einem gewünschten Zeitpunkt induziert[54] oder es werden Fusionsproteine von Anti-CRISPR-Proteinen mit lichtgesteuerten Proteinen zur zeitlichen Steuerung der Methode verwendet.[55] Die Kombination lichtsensitiver Proteine mit Anti-CRISPR-Proteinen ermöglicht eine Aktivierung von CRISPR-Cas nur während einer Bestrahlung mit Licht, beispielsweise die Kombination des Anti-CRISPR-Proteins AcrIIA4 (ein Hemmstoff von Cas9) mit dem lichtsensitiven Protein LOV2 aus Avena sativa (Saathafer).[55]

Typen

Es existieren mehr als 40 verschiedene Cas-Proteinfamilien.[56] Die Familien können in zwei Klassen mit sechs Typen (Klasse I mit Typen I, III und IV sowie Klasse II mit Typen II, V und VI) und weiter in 19 Subtypen eingeteilt werden.[57][58] Bei Klasse I besteht der Proteinanteil aus mehreren Proteinen in einem Proteinkomplex, während Klasse II nur ein Protein verwendet.[57] Typ I, II und III-A binden und schneiden doppelsträngige DNA, während Typ III-B einzelsträngige RNA bindet und schneidet.[58][59] Bei allen Typen erfolgt die Bildung des spacers in Bakterien durch Cas1 und Cas2.[59] Bei den Typen I-A und I-E erfolgt der DNA-Schnitt durch Cas3, während bei Typ II Cas9, bei Typ III-A Csm6 und bei Typ III-B Cmr4 den Schnitt bewirkt.[59] Die Typen I und III sind strukturell verwandt, was einen gemeinsamen Ursprung nahelegt.[58] Das helikale Protein Cas des Typs III besitzt mehrere β-hairpins, die in Abständen von sechs Nukleotiden die Doppelhelix der crRNA und der Ziel-RNA für den Schnitt auseinanderdrücken.[58]

Das Cas9 stammt meistens entweder aus Streptococcus pyogenes (SpCas9) oder Staphylococcus aureus (SaCas9), wobei die kodierende DNA-Sequenz von SaCas9 etwa 1000 Basenpaare kürzer ist.[60] Cas9 gehört zum Typ II und wird vermehrt eingesetzt, da der Proteinanteil nur aus einem Protein besteht, wodurch die Klonierung und Überexpression weniger aufwändig ist. Cas-Proteine des Typs I sind dagegen Proteinkomplexe aus mehreren kleinen Proteinen.[61]

Eine alternative Methode mit gleicher Spannbreite möglicher DNA-Zielsequenzen ist das CRISPR/Cpf1-System. Alternativ zum CRISPR/Cas-System können teilweise Transcription Activator-like Effector Nucleases und Zinkfingernukleasen verwendet werden.

Anwendungen

Verwendungsbeispiel des CRISPR/Cas-Systems in einem Plasmid
Blockade der Genexpression durch eine Cas9-Mutante (dCas9) im Zuge der CRISPRi

Das CRISPR/Cas-System kann unter anderem zum Genome Editing (Deletionen/Gen-Knockout[62] und Insertionen) und damit auch zur Gentherapie verwendet werden.[63][64]

Problematisch für humane Anwendungen könnte jedoch sein, dass das Immunsystem die Endonuklease Cas9, die bakteriellen Ursprungs ist, als Antigen erkennt. Über 80 % aller gesunden Menschen zeigen sowohl eine Antikörper-basierte humorale Immunantwort, als auch eine auf T-Gedächtniszellen basierte zelluläre Immunantwort. Ursache hierfür ist, dass die meisten Menschen im Laufe ihres Lebens schon einmal mit Bakterien wie S. pyogenes oder S. aureus in Kontakt kamen und sich so entsprechende Antikörper und Gedächtniszellen bilden konnten.[65] Körperzellen, deren Genom mit CRISPR/Cas9 editiert wurde, können prinzipiell von cytotoxischen T-Zellen erkannt und durch Apoptose vernichtet werden. Der therapeutische Effekt wäre somit nicht mehr gegeben. Diese Problematik wird aktuell (Stand 2018) intensiv diskutiert.[66][67][68]

Weiterhin wird das CRISPR/Cas-System zur Entfernung der Genome von Krankheitserregern chronischer Infektionskrankheiten wie des Hepatitis-B-Virus[69] und des HIV eingesetzt.[70][71] Die gezielte Veränderung einzelner Gene wird bei der Charakterisierung von Onkogenen und somit zur Untersuchung der Tumorentstehung verwendet.[72][73] Das CRISPR/Cas-System wird zur Untersuchung der Funktionen von teilweise unbekannten Genen eingesetzt.[74] Zudem wird es zur Korrektur von Mutationen bei der Erzeugung induzierter pluripotenter Stammzellen[75] und embryonaler Stammzellen verwendet.[76][77] Weitere Anwendungen werden untersucht.[78]

Mit dem CRISPR/Cas-System wurden unter anderem Bakteriophagen-resistente Bakterienstämme erzeugt, und dies durch eine adaptive Resistenz bei Hinzufügen entsprechender RNA bei industriell wichtigen Bakterien, z. B. in der Milch- oder Weinindustrie. Durch ein mutiertes Cas ohne funktionsfähige Endonuklease (dCas9) kann ein DNA-bindendes Protein erzeugt werden, das unter anderem analog zur RNAi zu einem Knockdown von endogenen Genen führt,[79] z. B. durch Transformation mit einem Plasmid, aus dem Cas9 und eine CRISPR-RNA transkribiert wird (CRISPRi).[80] Ebenso kann mittels dCas9 als Fusionsprotein mit einem Aktivator an einer anderen, bestimmbaren Stelle im Genom eine Transkription eingeleitet werden. Anhand charakteristischer CRISPR-Sequenzen können CRISPR/Cas enthaltende Bakterienstämme identifiziert werden (spoligotyping). Ein grün fluoreszierendes Protein kann mit einer Cas-Mutante als Fusionsprotein zur Markierung von DNA-Sequenzen (auch repetitiver Sequenzen wie Telomere) verwendet werden.[81] Durch das CRISPR/Cas-System konnte die Herstellungszeit von Mäusen mit komplexen Genomveränderungen von bis zu zwei Jahren auf wenige Wochen verkürzt werden.[49]

Pflanzenzüchtung

Die CRISPR-Methode eröffnet Pflanzenzüchtern die Möglichkeit, Sorten von Nutzpflanzen auf eine leichtere, effizientere und flexiblere Art zu verändern.[82] Für mehrere Nutzpflanzen liegen bereits Studien vor, aber es sind noch keine CRISPR-Pflanzen auf dem Markt.[83][84][85]

Caribou Biosciences, die 2011 von Doudna und Charpentier gegründete Firma, ging eine strategische Partnerschaft mit DuPont Pioneer ein. Abhängig vom Ausgang des Patentstreits könnte DuPont daher die Rechte an der Anwendung der Methode bei wichtigen Nutzpflanzen wie Mais, Raps und Sojabohne erhalten und Caribou für kleinere Märkte wie Obst und Gemüse. Unklar ist auch, wie sich der letztendliche Patentinhaber hinsichtlich der Lizenzierung der Methode verhalten wird.[83][84] Im September 2016 vergab das Broad-Institut eine (nicht exklusive) Lizenz zur Anwendung der Methode an Monsanto. Von der Lizenz ausgeschlossen sind Gene Drive sowie Anwendungen bei Tabak und die Herstellung steriler Pflanzen.[86]

Gleichzeitig besteht weiterhin Unklarheit bezüglich der Regulierung von CRISPR-Pflanzen (ausschließlich mit Deletionen, ohne Insertionen) in verschiedenen Ländern. Die für die mögliche zukünftige kommerzielle Nutzung von CRISPR-Pflanzen in der Landwirtschaft entscheidende Frage ist, ob diese rechtlich als gentechnisch veränderte Pflanzen angesehen werden, sofern nur etwas aus dem Genom entfernt und kein Transgen eingefügt wurde, da gentechnisch veränderte Pflanzen insbesondere in der EU sehr streng reguliert sind.[83][84][85] Das US-Landwirtschaftsministerium verkündete bereits im April 2016, zwei mit der CRISPR-Methode hergestellte Organismen, einen nicht-bräunenden Champignon und einen Wachsmais mit verändertem Stärkegehalt, nicht zu regulieren.[87]

Bekämpfung von Insekten

Entdeckungsgeschichte

Siehe auch: CRISPR#Entdeckung und Eigenschaften

Die Entdeckung und Erforschung der CRISPR-Sequenzen und des damit verbundenen CRISPR/Cas-Systems im Immunsystem verschiedener Bakterien und Archaea erfolgte in mehreren Schritten seit den späten 1980er Jahren. Vor allem in den frühen 2000ern wurden die Zusammenhänge zwischen den CRISPR-Sequenzen der DNA und den cas-Genen sowie ihre Bedeutung in der Immunabwehr der Bakterien identifiziert. Ab 2008 war bekannt, dass das adaptive CRISPR DNA bindet.[88]

Im Jahr 2011 zeigte eine Arbeitsgruppe um Emmanuelle Charpentier und Jennifer Doudna, dass mittels des CRISPR/Cas-Systems der Mikroorganismen spezifische DNA-Ziele in vitro geschnitten werden können.[89] Sie reichten ihre wissenschaftliche Arbeit am 8. Juni 2012 bei der Fachzeitschrift Science ein, wo sie am 28. Juni veröffentlicht wurde.[1] Parallel zu ihnen arbeitete eine Arbeitsgruppe um Virginijus Šikšnys an der Methode, die bereits im April 2012 ihre Arbeit bei Cell einreichten; diese wurde jedoch abgelehnt, wenngleich die Herausgeber von Cell dem Artikel nachträglich eine große Bedeutung zuschrieben. Im Mai reichten Šikšnys und Kollegen das Papier in den Proceedings of the National Academy of Sciences (PNAS) ein, wo es am 4. September online veröffentlicht wurde.[90]

Doudna und Charpentier beschrieben, wie sich in einem Bakterium gezielt Abschnitte aus dem Erbgut entfernen lassen. Dem Neurowissenschaftler Feng Zhang vom Massachusetts Institute of Technology gelang es später, die CRISPR-Methode nicht nur im Bakterium anzuwenden, sondern für alle Zellen zu optimieren.[91] Der Leiter des Broad Institute und Vorgesetzte von Feng Zhang, Eric Lander, verfasste im Januar 2016 einen Artikel über die Anteile der verschiedenen Wissenschaftler an der Entdeckung des CRISPR/Cas-Systems,[92] der aufgrund von einseitiger Darstellung und eines vermuteten Interessenskonflikts kritisiert wurde.[93][94][95]

Charpentier und Doudna erhielten 2014 für die Entdeckung der CRISPR/Cas-Methode den mit drei Millionen Dollar für jeden Preisträger dotierten Breakthrough Prize in Life Sciences[96] des Jahres 2015 und wurden mit zahlreichen weiteren Preisen bedacht. Innerhalb der ersten fünf Jahre nach Veröffentlichung ist die Methode eine Standardmethode in Laboren geworden und es wurden darüber in diesen fünf Jahren 2.500 wissenschaftliche Veröffentlichungen publiziert.[97]

Patentstreit

Sowohl Doudna und Charpentier (University of California, Berkeley) als auch Zhang (Broad) beantragten grundlegende Patente auf die CRISPR/Cas-Methode. Doudna und Charpentier reichten ihren Antrag beim United States Patent and Trademark Office (USPTO) im Mai 2012, Zhang im Dezember 2012 ein, und Zhang beantragte ein Schnellverfahren. Zhang wurden im Mai 2014 Patentrechte zugesprochen. Das USPTO begründete diese Entscheidung damit, dass Zhang die Methode für alle Zellen tauglich machte.[91] Doudna und Charpentier reichten Klage beim USPTO gegen diese Entscheidung ein. Das Verfahren zur Klärung der Urheberschaft lief im Januar 2016 an. Broad argumentiert, Berkeley habe die Methode zwar für Prokaryoten (Bakterien), aber nicht hinreichend für Eukaryoten (z. B. Mäusen und menschlichen Zellen) beschrieben. Berkeley argumentiert, der Schritt von Pro- zu Eukaryoten bedürfe keiner erfinderischen Tätigkeit.[98] Im Februar 2017 entschied das USPTO zugunsten von Broad und lehnte die Klage der University of California mit der Begründung ab, dass die Anwendung der von Doudna und Charpentier beschriebenen CRISPR/Cas-Methode auf Eukaryoten nicht offensichtlich sei.[99]

Auch das Europäische Patentamt (EPA) muss im Patentstreit Entscheidungen fällen. Hinsichtlich des Berkeley-Patentantrags hat das EPA bereits argumentiert, der Antrag habe die Erfindung nicht ausreichend beschrieben, da die Hervorhebung der Rolle der PAM-Sequenzen fehle. Berkeley vertritt die Ansicht, dass diese Rolle für Fachleute offensichtlich ist. Dem Broad-Institut wurden hingegen bereits mehrere Patente an der CRISPR/Cas-Methode zugesprochen, die jedoch von mehreren Seiten angefochten wurden. Kläger verweisen zum Beispiel darauf, dass Broads ursprünglicher Patentantrag einen Wissenschaftler der Rockefeller University als an der Erfindung Mitbeteiligten erwähnte, eine spätere Version des Antrags jedoch nicht.[98]

Risiken

Die Methode ist eine verhältnismäßig einfache, preiswerte, leicht verfügbare, punktgenaue und effiziente Technik. Es ist noch nicht geregelt, ob reine Deletionen, die auch durch zufällige Mutagenese im Rahmen einer Züchtung entstehen können (jedoch nicht zielgerichtet), als Gentechnik zu bewerten sind. Kritiker weisen darauf hin, dass es beispielsweise internationaler Standards und Vorsorgemaßnahmen bedürfe, um Wildwuchs und Missbrauch vorzubeugen. Hier bestehen auch Befürchtungen vor kriminellen oder terroristischen Anwendungen; das amerikanische FBI beispielsweise beobachtet entsprechende mehr oder weniger private Do-it-Yourself (DIY)-„Garagen-Bastler“ („Bio-Hacker“). In Bezug auf den Eingriff in die menschliche Keimbahn durch Verwendung einer CRISPR/Cas-Methode auf menschlichen Keimzellen in Verbindung mit einer In-vitro-Fertilisation im Rahmen einer Gentherapie gibt es bioethische Bedenken.[100]

Recht

Der Europäische Gerichtshof (EuGH) entschied am 25. Juli 2018, dass grundsätzlich auch mit der CRISPR/Cas-Methode (Mutagenese) bearbeitete Pflanzen ohne Fremd-DNA als gentechnisch veränderte Organismen (GVO) anzusehen sind und grundsätzlich den in der GVO-Richtlinie vorgesehenen Verpflichtungen unterliegen (Az. C-528/16). Geklagt hatte die französische Bauerngewerkschaft Confédération paysanne und weitere acht Verbände gegen die französische Regierung.[101]

Das Urteil wurde von Umweltschützern gelobt, während Naturwissenschaftler die Auswirkungen skeptisch beurteilten. Es sei fraglich, ob von nun an noch Forschungsförderung für entsprechende Projekte gewährt werde. Auch sei die diesbezügliche Forschung innerhalb der EU für Unternehmen unter den neuen rechtlichen Rahmenbedingungen nicht mehr profitabel. Deshalb werde sie nicht mehr innerhalb der EU erfolgen.[102] Weiterhin wurden nachteilige Auswirkungen auf den Welthandel befürchtet.[103]

Literatur

Weblinks

Einzelnachweise

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