CRISPR/Cas-Methode

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CRISPR/Cas-Komplex mit DNA

Die CRISPR/Cas-Methode (von englisch Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats – gruppierte kurze palindromische Wiederholungen mit regelmäßigen Abständen und CRISPR-associated – CRISPR-assoziiertes Protein) ist eine molekularbiologische Methode, um DNA gezielt zu schneiden und zu verändern (Genome Editing). Gene können mit dem CRISPR/Cas-System eingefügt, entfernt oder ausgeschaltet werden,[1] auch Nukleotide in einem Gen können geändert werden.[2] Aufgrund der einfachen Durchführung, der Skalierbarkeit hinsichtlich unterschiedlicher Zielsequenzen und der geringen Kosten wird die CRISPR/Cas-Methode zunehmend in der Forschung eingesetzt.[3][4] Gleichzeitig gibt es beim aktuellen Stand der Forschung noch Probleme bei der Spezifität durch off-target-Effekte, also Auswirkungen am Genom außerhalb der Schnittstelle.

Die wissenschaftliche Grundlage zur Entwicklung der CRISPR/Cas-Methode wurde durch die Entdeckung und Erforschung der CRISPR-Sequenzen und des damit verbundenen CRISPR/Cas-Systems im Immunsystem verschiedener Bakterien und Archaea gelegt. Die erste wissenschaftliche Dokumentation zur Entwicklung und zum Einsatz der Methode wurde 2012 durch eine Arbeitsgruppe um Emmanuelle Charpentier und Jennifer Doudna veröffentlicht. Die wissenschaftliche Fachzeitschrift Science erklärte die CRISPR-Methode zum Breakthrough of the Year 2015.[5] Für ihre Arbeiten an der CRISPR/Cas-Methode wurden die beiden Wissenschaftlerinnen mit dem Nobelpreis für Chemie 2020 ausgezeichnet.

Prinzip

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Überblick der drei Phasen des CRISPR/Cas9-Prozesses als Abwehrmechanismus[6]

Die CRISPR/Cas-Methode basiert auf einem adaptiven antiviralen Abwehrmechanismus von Bakterien, dem CRISPR.[7][8] Sie wird als Methode verwendet, um DNA an einer bestimmbaren DNA-Sequenz zu schneiden. Dadurch können beispielsweise durch zwei Schnitte DNA-Sequenzen entfernt – oder es kann im Anschluss an einen Schnitt eine andere DNA-Sequenz an der Schnittstelle eingefügt werden.

Das DNA-schneidende Enzym namens Cas (von englisch CRISPR-associated‚ CRISPR-assoziiert‘) bindet eine bestimmte RNA-Sequenz. Auf diese RNA-Sequenz folgt eine weitere RNA-Sequenz, die per Basenpaarung an eine DNA mit komplementärer Sequenz binden kann. Die RNA dient hierbei als Brücke zwischen Cas und der zu schneidenden DNA. Durch die Verkettung des Enzyms Cas, der RNA und der DNA wird das DNA-schneidende Enzym Cas in die räumliche Nähe der gebundenen DNA gebracht, woraufhin das Enzym die (indirekt gebundene) DNA schneidet. Im Sonderfall einer Einfügung von DNA in die Schnittstelle wird eine weitere DNA hinzugegeben, die an ihren beiden Enden jeweils überlappende Sequenzen für eines der beiden Enden der Schnittstelle aufweist. Die einzufügende DNA wird durch die zelleigene DNA-Reparatur mit den Enden der Schnittstelle verbunden. Bei einer Variante des Systems (Prime Editing) ist keine einzufügende DNA für eine Einfügung nötig, da die einzufügende Sequenz durch eine RNA-Verlängerung codiert wird.

Eigenschaften

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3D-Struktur des CRISPR-Cas9-Komplexes
CRISPR-Cas9 kann als molekulares Werkzeug gezielt DNA-Doppelstrangbrüche einführen
Die durch CRISPR-Cas9 gezielt eingeführten DNA-Doppelstrangbrüche eröffnen den Weg zu genetischer Manipulation

Cas-Proteine können als Ribonukleoproteine bestimmte RNA-Sequenzen binden. Die Endonuklease Cas9 (veraltet auch Cas5, Csn1 oder Csx12) kann eine bestimmte RNA-Sequenz (crRNA repeat, Sequenz GUUUUAGAGCU(A/G)UG(C/U)UGUUUUG)[9] binden und in der unmittelbaren Umgebung DNA schneiden. In Bakterien folgt auf die crRNA repeat-Sequenz eine crRNA-spacer-Sequenz, die an die Ziel-DNA bindet. Beide Teile werden zusammen als crRNA bezeichnet. Die crRNA-spacer-Sequenz dient in der Funktion eines variablen Adapters, die komplementär zur Ziel-DNA ist und an die Ziel-DNA bindet. Die crRNA-repeat-Sequenz bildet eine RNA-Sekundärstruktur und wird dann von Cas9 gebunden,[10] wodurch eine Änderung der Proteinfaltung von Cas9 erfolgt und die Ziel-DNA von der crRNA-spacer-Sequenz durch Basenpaarung gebunden wird.[11] Bei der CRISPR/Cas-Methode wird die crRNA-spacer-Sequenz geändert, um an eine andere Ziel-DNA zu binden. Die Sequenz des crRNA-spacer bestimmt, welche Ziel-DNA-Sequenz gebunden wird.

Neben Cas9 und der crRNA ist das Vorhandensein eines PAM-Motivs (englisch protospacer adjacent motif ‚Angrenzendes Motiv an den Protospacer‘) mit der Sequenz NGG (mit N als beliebige Nukleinbase gefolgt von zwei Guaninen) in der Ziel-DNA notwendig für eine Aktivierung von Cas9.[12] Der Schnitt der DNA erfolgt drei Nukleotide vor dem PAM. Zudem ist noch eine weitere RNA notwendig, die tracrRNA, von engl. trans-acting CRISPR RNA. Die tracrRNA ist teilweise komplementär zur crRNA, weshalb sie aneinander binden. Die tracrRNA bindet an eine Vorläufer-crRNA, bildet eine RNA-Doppelhelix und wird durch die RNase III in die aktive Form überführt.[1][13][14] Die beiden RNA-Stränge der crRNA und der tracrRNA können auch in einem einzelnen, teilweise selbsthybridisierenden RNA-Strang untergebracht werden (sgRNA ‚single guide RNA‘).[1] Durch diese Komponenten wird die DNA gebunden und von der Endonukleasefunktion nahe der Bindungsstelle an beiden Strängen der Ziel-DNA geschnitten. In lebenden Organismen folgt nach einem doppelsträngigen DNA-Schnitt eine DNA-Reparatur. Die Reparatur des erzeugten Doppelstrangbruchs erfolgt durch homology-directed repair (HDR) oder durch non-homologous end joining (NHEJ). Bei der CRISPR/Cas-Methode ist die HDR aufgrund der Genauigkeit die bevorzugte Form der DNA-Reparatur.[15][16][17][18][19]

Eine alternative Methode mit gleicher Spannbreite möglicher DNA-Zielsequenzen ist das CRISPR/Cpf1-System und das CRISPR/Cas12b-System. Alternativ zum CRISPR/Cas-System können teilweise Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALEN) und Zinkfingernukleasen (ZFN) verwendet werden. Jedoch sind diese beiden Methoden mit höherem Aufwand zur Anpassung an unterschiedliche Zielsequenzen verbunden, da zuerst ein Proteindesign zur Änderung der Bindungsspezifität notwendig ist, während die Bindungsspezifität bei Cas-Proteinen je nach Verwendung durch die gebundene crRNA bzw. sgRNA erfolgt und somit leichter zu ändern ist. Alle diese Methoden werden umgangssprachlich als Genschere bezeichnet.

Komponenten

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Komponente Funktion
crRNA Enthält die Guide RNA, die das richtige Segment der Wirts-DNA lokalisiert, zusammen mit einer Region, die an die tracrRNA bindet (im Allgemeinen in Form einer Haarnadelschleife) und einen aktiven Komplex bildet.
tracrRNA Bindet an crRNA und bildet einen aktiven Komplex.
sgRNA Single-guide RNAs sind kombinierte RNAs, die aus einer tracrRNA und mindestens einer crRNA bestehen.
Cas9 (oder Alternative) Ein Enzym, dessen aktive Form die DNA verändern kann. Es gibt viele Varianten mit unterschiedlichen Funktionen (z. B. Einzelstrangeinkerbung, Doppelstrangbruch, DNA-Bindung) aufgrund der Funktion jedes Enzyms zur Erkennung von DNA-Stellen.
Reparaturvorlage DNA-Molekül, das im DNA-Reparaturprozess der Wirtszelle als Vorlage dient und das Einfügen einer spezifischen DNA-Sequenz in das von Cas9 geteilte Wirtssegment ermöglicht.

Alternativen zu Cas9

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Protein Hauptanwendung / Charakteristiken Jahr/e
Cas12 Cas12a ist kleiner und einfacher als Cas9; Cas12b u. a. für das Genome Engineering bei Pflanzen.[20][21]
Cas13 für RNA-Editing[22]
Cas3[23][24] 2019
CasMINI Etwa doppelt so kompakt wie die gebräuchlicheren Cas9 und Cas12a.[25][26] 2021

Unterschiede zwischen Cas9, Cpf1 und Cas12b

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Eigenschaft Cas9[27] Cpf1[27] Cas12b[28]
Struktur 2 RNA notwendig oder 1 sgRNA 1 RNA notwendig (keine tracrRNA) 2 RNA notwendig oder 1 sgRNA
Überhang keinen (blunt end) sticky end sticky end
Schnittstelle proximal zur Erkennungssequenz distal zur Erkennungssequenz distal zur Erkennungssequenz
Zielsequenz G-reiches PAM T-reiches PAM T-reiches PAM
Zelltyp teilende Zellen ruhende Zellen unbekannt

Das CRISPR/Cas-System kann durch Zugabe eines DNA-Oligonukleotids anstatt eines RNA-Oligonukleotids auch zur Veränderung von RNA verwendet werden.[29][30] Der Effekt der Unterdrückung eines Gens durch Verwendung von CRISPR/Cas besitzt verschiedene Ähnlichkeiten mit demjenigen der RNA-Interferenz, da bei beiden bakteriellen Abwehrmechanismen kurze RNA-Stücke von etwa 18 bis 20 Nukleotiden die Bindung an das Ziel vermitteln.[31]

Anpassung an die Zielsequenz

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Wird an eine crRNA repeat-Sequenz anstatt der natürlich vorkommenden crRNA-spacer-Sequenz eine andere, zu einer DNA-Zielsequenz komplementäre RNA-Sequenz angefügt und diese crRNA zu einer tracrRNA hinzugegeben, schneidet Cas9 die DNA nahe der geänderten Zielsequenz. Die an die Ziel-DNA bindende Sequenz besteht aus 20 Nukleotiden, von denen vor allem die 12 an das PAM angrenzenden Nukleotide für die Bindungsspezifität entscheidend sind.[32] Durch das Cas9 mit den entsprechend geänderten RNA-Sequenzen kann sequenzspezifisch doppelsträngige, teilweise komplementäre DNA geschnitten werden, wodurch gezielte Deletionen erzeugt werden können. Die gleichzeitige Änderung mehrerer DNA-Zielsequenzen wird als Multiplex Genome Editing bezeichnet.

Nukleotidsubstitution

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Einzelne Cytidine können durch ein Fusionsprotein aus Cas9 ohne doppelsträngige Endonuklease-Aktivität mit einer Cytidin-Deaminase in Thymidin umgewandelt werden.[33] Entsprechend kann mit einem Fusionsprotein, das die Adenosin-Deaminase enthält, ein Adenosin in Guanosin verändert werden.[34] In beiden Fällen entstehen Substitutionsmutationen. Da bei diesen Methode nur einzelne Basen verändert werden, ohne dass die DNA geschnitten wird, wird dieses Verfahren als Base Editing bezeichnet.

Insertionen

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Durch Doppelstrangbrüche kann die Häufigkeit einer homologen Rekombination deutlich erhöht werden,[35] wodurch ein sequenzspezifischer Schnitt durch Cas9 auch zum Einfügen von DNA-Sequenzen (z. B. im Zuge der Gentherapie) verwendet werden kann, sofern die anschließend einzufügende DNA an beiden Enden jeweils eine zur jeweiligen Zielsequenz überlappende Sequenz aufweist.[36]

Einbringung in Zellen

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Durch Transformation oder Transfektion von einem Vektor können Lebewesen mit dem CRISPR/Cas-System „ergänzt“ werden, die es natürlicherweise nicht besitzen, z. B. manche Bakterienstämme,[37] Bäckerhefe,[38] Taufliegen,[39] Zebrabärblinge,[40] Mäuse[41] und Menschen.[42][43] Üblicherweise werden Gene von Cas mit Kernlokalisierungssignal und sgRNA per Plasmid in einen Organismus eingefügt, alternativ kann auch der Komplex aus Cas9 mit einer sgRNA in Zellen eingeschleust werden.[44]

Für ein Genome Editing in der Keimbahn werden als Methoden zur Einschleusung des CRISPR/Cas9 die Elektroporation und die Mikroinjektion eingesetzt.

Spezifität

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Fehlbindungen durch Schleifenbildung in der Ziel-DNA (links) oder der sgRNA (rechts)

Bei der Erzeugung von Doppelstrangbrüchen an unerwünschten Stellen können unerwünschte Mutationen entstehen, die als off-target-Effekte bezeichnet werden.[45][46][47][48] Durch einen unspezifischen Schnitt können Gene in ihrer Funktion gestört werden. Unter die off-target-Effekte fallen Punktmutationen (Basenänderungen),[49] Deletionen (Entfernungen von DNA-Sequenzen),[50][51] Insertionen (Einfügungen von DNA-Sequenzen),[48] Inversionen (Einfügungen von DNA-Sequenzen mit umgekehrter Abfolge)[48] und Translokationen (Verbindungen mit anderen DNA-Strängen).[51][52] Es wurde beschrieben, dass teilweise über 50 % der Schnitte off-target erfolgten.[45][50] Die Bindung der sgRNA an eine Zielsequenz toleriert auch Basenfehlpaarungen, wodurch sich die Zahl der möglichen Bindungsstellen auf mehrere tausend erhöht, wodurch experimentelle und sicherheitstechnische Probleme entstehen,[45][53] die typisch für unspezifische Mutationen sind. Experimentelle Probleme sind irreführende und nicht reproduzierbare Ergebnisse.[54] Als sicherheitstechnisches Problem wird eine mögliche Entstehung von Krebs angesehen.[55] Die Ursachen für unspezifische Schnitte lassen sich in Basenfehlpaarungen und Schleifenbildungen (der sgRNA oder der Ziel-DNA) einteilen.[50]

Im Jahr 2015 hat ein Team chinesischer Forscher 86 menschlichen Embryonen die korrekte Version des Beta-Globin-Gens injiziert, um den der Beta-Thalassämie zugrunde liegenden Defekt zu korrigieren; dabei wurde festgestellt, dass das korrekte Gen an der richtigen Stelle nur in vier Fällen nachgewiesen werden konnte, in den vier Stellen lag aber ein Mosaik vor.[56]

Erhöhung der Spezifität

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Zur Minimierung unspezifischer DNA-Schnitte und der daraus potentiell folgenden Mutagenese werden verschiedene Ansätze zur Erhöhung der Spezifität untersucht,[57][58] wie Proteindesign der Cas9 oder Ersatz der Endonukleaseaktivität von Cas9 durch Kombination mit anderen Endonukleasen.[59] Entsprechend wurden verschiedene Methoden zur Detektion solcher Mutationen entwickelt.[52][60][61][62][63] Ebenso wurden Computerprogramme und Datenbanken entwickelt, um off-target-Effekte vorherzusagen.[64][65]

Paired Nickases

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Die Mutation von Asparaginsäure zu Alanin an der Position 10 in Cas9 (kurz: D10A) oder von Histidin zu Alanin an der Position 840 (H840A) inaktiviert die doppelsträngige Endonukleasefunktion des gebundenen DNA-Stranges unter Erhalt der RNA-DNA-Bindungsfunktion und einer einzelsträngigen Endonukleasefunktion.[66][67] Zudem wird die Spezifität durch die Affinität der RNA-DNA-Bindung an Cas9 bestimmt.[68][69][70] Durch Verwendung zweier verschiedener sgRNA, deren an die Ziel-DNA bindende Sequenzen geringfügig versetzt sind, entstehen zwei verschieden bindende Cas-RNA-Komplexe, wodurch die Spezifität des Schnitts erhöht werden kann.[66][71] Dabei werden zwei geringfügig verschiedene Cas9-sgRNA-Komplexe mit unterschiedlicher Spezifität gebildet (paired nickases). Zudem entstehen durch die versetzten Einzelstrangbrüche sticky ends, die eine Insertion einer DNA mit komplementären sticky ends erleichtern. Einzelstrangbrüche werden durch die Basenexzisionsreparatur[66] und die HDR geschlossen,[72] die weniger Mutationen als die Reparatur per NHEJ erzeugen.[66]

Proteindesign von Cas9

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Die Mutation D1135E (Änderung von Asparaginsäure zu Glutaminsäure an der Position 1135) von SpCas9 verändert die Bindungsspezifität für das protospacer adjacent motif (PAM) und senkt die Anzahl unspezifischer Schnitte.[73] Auch die HF1-Mutante von Cas9 führt zu einer Minderung unspezifischer DNA-Schnitte.[74]

dCas9-FokI

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Die Kombination von Cas9 mit inaktivierter Nukleasefunktion (dCas9) mit der Endonuklease FokI wurde entwickelt, um die Spezifität des DNA-Schnitts zu erhöhen.[59][75][76] FokI wird nur als Homodimer aktiv. Dadurch wird die Anzahl unspezifischer Schnitte auf 1/10.000 gemindert.

BhCas12b v4

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Das Protein Cas12b (alter Name C2c1, ein Cas des Typs V, Klasse II) aus Bacillus hisashii, abgekürzt BhCas12b, ist mit 1108 Aminosäuren kleiner als SpCas9 (1368 Aminosäuren) und hat daher auch ein kleineres Gen, was die Verwendung in viralen Vektoren (insbesondere AAV-Vektoren) erleichtert.[77] Allerdings erzeugt der Wildtyp von BhCas12b bei 37 °C nur Einzelstrangbrüche.[77] Daher wurde eine Mutante von BhCas12b namens BhCas12b v4 entwickelt (K846R/S893R/E837G), die auch bei der Körpertemperatur von Säugetieren Doppelstrangbrüche und weniger unspezifische Schnitte erzeugt.[77]

dCas9-RT: Prime Editing

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Eine deaktivierte Cas9 (dCas9) – die noch über eine RNA an DNA binden kann, aber ohne DNA zu schneiden – wurde als Fusionsprotein mit einer reversen Transkriptase (RT) kombiniert.[78] Reverse Transkriptasen verwenden eine RNA-Vorlage, um DNA herzustellen – sie sind RNA-abhängige DNA-Polymerasen. Zusätzlich wird eine prime editing guide RNA (pegRNA) benötigt, die sowohl die crRNA-repeat-Sequenz für die Bindung von Cas9 und eine an die Ziel-DNA bindende RNA-Sequenz als auch eine RNA-Vorlagensequenz zur Änderung der DNA-Sequenz (analog zu einem Primer) enthält.[78] Dadurch können Insertionen, Deletionen und alle 12 möglichen Punktmutationen durchgeführt werden, ohne dass mutationsanfällige Doppelstrangbrüche entstehen und im Falle einer Insertion ohne Notwendigkeit einer einzufügenden DNA-Sequenz.[78]

Regulation

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Die Verwendung von Anti-CRISPR-Proteinen wurde zur konditionalen Hemmung von CRISPR/Cas sowie zur zeitlichen, örtlichen (zelltypspezifischen) oder zellzyklusabschnittsspezifischen Steuerung der CRISPR-Cas-Methode vorgeschlagen.[79] Da CRISPR/Cas DNA schneidet, solange es aktiv ist, kann eine zeitliche Begrenzung auch unspezifische Schnitte begrenzen, die zu unerwünschten Mutationen führen können.[79]

Beispielsweise werden Anti-CRISPR-Proteine zu einem gewünschten Zeitpunkt induziert[80] oder es werden Fusionsproteine von Anti-CRISPR-Proteinen mit lichtgesteuerten Proteinen zur zeitlichen Steuerung der Methode verwendet.[81] Die Kombination lichtsensitiver Proteine mit Anti-CRISPR-Proteinen ermöglicht eine Aktivierung von CRISPR-Cas nur während einer Bestrahlung mit Licht, beispielsweise die Kombination des Anti-CRISPR-Proteins AcrIIA4 (ein Hemmstoff von Cas9) mit dem lichtsensitiven Protein LOV2 aus Avena sativa (Saathafer), die auch CASANOVA genannt wird.[81] Durch die Verwendung zelltypspezifischer Promotoren vor den Genen von Cas und sgRNA kann die örtliche Wirkung gesteuert werden. Außerdem wurde durch die Kombination der Gene von Anti-CRISPR-Proteinen (AcrIIC1, AcrIIC3 und AcrIIC1) mit Bindungsstellen für miRNAs, die nur in bestimmten Geweben (Leberzellen und Herzmuskelzellen) vorkommen und dort die Bildung des Anti-CRISPR-Proteins hemmen, eine gewebespezifische Steuerung für Leber- und Herzmuskelzellen ermöglicht.[82] Durch die Verwendung zellzyklusabschnittsspezifischer Promotoren (Promotoren von Cyclinen) kann eine Wirkung auf einen Abschnitt im Zellzyklus begrenzt werden.

Typen

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Es existieren mehr als 40 verschiedene Cas-Proteinfamilien.[83] Die Familien können in zwei Klassen mit sechs Typen (Klasse I mit Typen I, III und IV sowie Klasse II mit Typen II, V und VI) und weiter in mehr als 30 Subtypen[84] eingeteilt werden.[85][86] Bei Klasse I besteht der Proteinanteil aus mehreren Proteinen in einem Proteinkomplex (Effektorkomplex), während Klasse II nur ein Protein (Effektorprotein) verwendet.[85] Typ I und II binden und schneiden doppelsträngige DNA und III-A dsDNA sowie RNA,[87] während Typ III-B einzelsträngige RNA oder DNA[88] bindet und schneidet.[86][89] Bei allen Typen erfolgt die Bildung des spacers in Bakterien durch Cas1 und Cas2.[89] Bei den Typen I-A und I-E erfolgt der DNA-Schnitt durch Cas3, während bei Typ II Cas9, bei Typ III-A Csm6 und bei Typ III-B Cmr4 den Schnitt bewirkt.[89] Die Typen I und III sind strukturell verwandt, was einen gemeinsamen Ursprung nahelegt.[86] Das helikale Protein Cas des Typs III besitzt mehrere β-hairpins, die in Abständen von sechs Nukleotiden die Doppelhelix der crRNA und der Ziel-RNA für den Schnitt auseinanderdrücken.[86]

Das Cas9 stammt meistens entweder aus Streptococcus pyogenes (SpCas9) oder Staphylococcus aureus (SaCas9), wobei die kodierende DNA-Sequenz von SaCas9 etwa 1000 Basenpaare kürzer ist.[90] Cas9 gehört zum Typ II und wird vermehrt eingesetzt, da der Proteinanteil nur aus einem Protein besteht, wodurch die Klonierung und Überexpression weniger aufwändig ist. Cas-Proteine des Typs I sind dagegen Proteinkomplexe aus mehreren kleinen Proteinen.[91]

Klassifizierung

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Aufgrund der evolutionären Entwicklung von Pathogenen und der daraus resultierenden Vielfalt an Erregern müssen sich antivirale Abwehrmechanismen den verschiedenen Pathogenen anpassen können. Dieses Phänomen beschreibt man in der englischsprachigen Literatur als evolutionary arms race (deutsch evolutionäres Wettrüsten).[92][93] Aufgrund dessen haben CRISPR/Cas-Systeme als wichtige Akteure der antiviralen Abwehrmechanismen sich ebenfalls den evolutionären Änderungen angepasst. Dies resultierte in einer Erhöhung der Diversität hinsichtlich der Genzusammensetzung des cas-Operons, der Architektur des CRISPR-Genlocus und der Gensequenzen (auch innerhalb der Cas-Core-Gene). Bei den Cas-Core-Genen handelt es sich um die cas-Gene cas1 bis cas6, die innerhalb vieler CRISPR/Cas-Systemvarianten konserviert sind.[83]

Eine einfache und rationale Klassifizierung von CRISPR/Cas-Systemen erweist sich aus folgenden Gründen als vorteilhaft:

  • Erklärung der Herkunft und Evolution der Diversität von CRISPR/Cas-Systemen
  • Mitverfolgung und Integration neu entdeckter CRISPR/Cas-Systemvarianten
  • kohärente Annotation von CRISPR/Cas-Genloci in mikrobiellen Genomen

Die seit den Anfängen der CRISPR-Forschung verwendete Klassifizierung von CRISPR/Cas-Systemen anhand der Phylogenese des Cas1-Proteins[94] erwies sich nach weiteren Entdeckungen von Genomen mit CRISPR/Cas-Genloci als problematisch, weil die Organisation und Phylogenese der Gene des Effektormoduls von der Phylogenese des Cas1-Proteins abwich. Unter einem Effektormodul versteht man eine Gruppe von cas-Genen, die zur Identifizierung von genetischem Material dient. Des Weiteren existiert ein Adaptationsmodul, welches ebenfalls cas-Gene umfasst und mithilfe von Effektorproteinen zur Protospacer-Auswahl beiträgt, die in das bakterielle Genom integriert werden können.[95][96] Ursache für die phylogenetischen Abweichungen ist wahrscheinlich die Rekombination zwischen den Effektor- und Adaptationsmodulen (englisch module shuffling).[97][98] Somit entschied man, dass charakteristische Merkmale des Effektormoduls zum Klassifizierungsmerkmal von CRISPR/Cas-Systemen wurde.

Klassifizierung von CRISPR/Cas-Systemen[99]
Klasse Typ Ziel Operon-Organisation⁠1 Subtyp Bakterienstamm
I
I
DNA
 cas6, cas11, cas7, cas5, cas8a1, cas3’, cas3’’, cas2, cas4, cas1, cas4, CRISPR
I-A
 Archaeoglobus fulgidus
AF1859, AF1870–AF1789
DNA
 cas6, cas8b1, cas7, cas5, cas3, cas4, cas1, cas2, CRISPR
I-B
 Clostridium kluyveri
CKL_2758–CKL_2751
DNA
 cas3, cas5, cas8c, cas7, cas4, cas1, cas2, CRISPR
I-C
 Bacillus halodurans
BH0336–BH0342
DNA
 cas3, cas8u2, cas7, cas5, cas6, cas4, cas1, cas2, CRISPR
I-G
 Geobacter sulfurreducens
GSU0051–GSU0054, GSU0057–GSU0058
DNA
 cas3’, cas3’’, cas10d, cas7, cas5, cas6, cas4, cas1, cas2, CRISPR
I-D
 Cyanothece sp. 8802
Cyan8802_0527–Cyan8802_0520
DNA
 cas3, cas8e, cas11, cas7, cas5, cas6, cas1, cas2, CRISPR
I-E
 Escherichia coli K12
ygcB–ygbF
DNA
 cas1, cas2, cas3, cas8f, cas5f1, cas7f1, cas6f, CRISPR
I-F1
 Yersinia pseudotuberculosis
YPK_1644–YPK_1649
tnsA, tnsB, tnsC, tnsD, cas8f3/cas5f3, cas7f3, cas6f, CRISPR
I-F3
 Vibrio crassostreae J5 20
VCR20J5_310088–VCR20J5_310108
DNA
 cas1, cas2, cas3, cas7f2, cas5f2, cas6f, CRISPR
I-F2
 Shewanella putrefaciens CN–32
Sputcn32_1819–Sputcn32_1823
IV
Plasmide
[100]
 dinG, cas6, cas8-like, cas7, cas5, CRISPR
IV-A
 Thioalkalivibrio sp. K90mix
TK90_2699–TK90_2703
Plasmide
[100]
 cysH-like, cas8-like, cas11, cas7, cas5, CRISPR
IV-B
 Rhodococcus jostii RHA1
RHA1_ro10069–RHA1_ro10072
DNA?
 LS, cas11, cas7, cas5, CRISPR
IV-C
 Thermoflexia bacterium
D6793_05715–D6793_05700
III
DNA/RNA
 cas6, cas10, cas11, cas7, cas5, cas7, csm6, cas1, cas2, CRISPR
III-A
 Staphylococcus epidermidis
SERP2463–SERP2455
RNA?
 cas10, cas7, cas5, cas11, cas7, cas7, csx19, cas7, CRISPR
III-D
 Synechocystis sp. 6803
sll7067–sll7063
RNA?
 TPR + caspase, cas7(3), cas11, RT, cas1, cas2, CRISPR
III-E
 Candidatus Scalindua brodae
SCABRO_02601,SCABRO_02597,
SCABRO_02593,SCABRO_02595
DNA?
 cas10, cas5, cas11, cas7, CRISPR
III-F
 Thermotoga lettingae TMO
Tlet_0097–Tlet_0100
DNA/RNA
 cas7, cas7, cas10, cas7, cas11, cas5, CRISPR
III-C
 Methanothermobacter thermautotrophicus
MTH328–MTH323
DNA/RNA
 cas7, cas10, cas5, cas7, cas11, cas6, cas7, CRISPR
III-B
 Pyrococcus furiosus
PF1131–PF1124
II
II
DNA
 cas9, cas1, cas2, cas4, tracrRNA, CRISPR
II-B
 Legionella pneumophila str. Paris
lpp0160–lpp0163
DNA
 cas9, cas1, cas2, csn2, tracrRNA, CRISPR
II-A
 Streptococcus thermophilus
str0657–str0660
DNA
 cas9, cas1, cas2, tracrRNA, CRISPR
II-C1
 Neisseria lactamica 020-06
NLA_17660–NLA_17680
DNA
 cas9, tracrRNA, CRISPR, cas4, cas2, cas1
II-C2
 Micrarchaeum acidiphilum ARMAN-1
BK997_03320–BK997_03335
V
DNA
 cas12a, cas4, cas1, cas2, CRISPR
V-A
 Francisella cf. novicida Fx1
FNFX1_1431–FNFX_1428
DNA
 cas12e, cas4, cas1, cas2, tracrRNA, CRISPR
V-E
 Deltaproteobacteria bacterium
A2Z89_08250–A2Z89_08265
DNA
 cas12b1, cas4, cas1, cas2, tracrRNA, CRISPR
V-B1
 Alicyclobacillus acidoterrestris
N007_06525–N007_06535
DNA
 cas4, cas1, cas2, cas12b2, tracrRNA, CRISPR
V-B2
 Planctomycetes bacterium RBG_13_46_10
A2167_01675–A2167_01685
DNA
 cas12i, CRISPR
V-I
 Freshwater metagenome (JGI)
Ga0208225_100001036
cas12h, CRISPR
V-H
 Hypersaline lake sediment metagenome (JGI)
Ga0180438_100006283
DNA
 cas1, cas12c, CRISPR
V-C
 Oleiphilus sp.
A3715_16885–A3715_16890
DNA
 cas1, CRISPR, cas12d
V-D
 Bacterium CG09_39_24
BK003_02070–BK003_02075
DNA
 cas1, cas2, cas4, cas12f1, CRISPR
V-F1
 Uncultured archaeon
NDOCEIEL_00008–NDOCEIEL_00011
DNA
 c2c10, CRISPR
V-F1
(V-U3)
 Bacillus thuringiensis HD-771
BTG_31928
DNA
 cas12f2, CRISPR, cas1, cas2, cas4
V-F2
 Uncultured archaeon
ICDLJNLD_00049–ICDLJNLD_00052
c2c8, CRISPR
V-U2
 Cyanothece sp. PCC 8801
PCC8801_4127
c2c9, CRISPR
V-U4
 Rothia dentocariosa M567
HMPREF0734_01291
cas1, cas2, cas4, cas12f3, CRISPR
V-F3
 Candidatus Micrarchaeota archaeon
COU37_03050–COU37_03065
c2c4, CRISPR
V-U1
 Gordonia otitidis
GOOTI_RS19525
cas12g, CRISPR, tracrRNA
V-G
 Hot springs metagenome
FLYL01000025.1 (182949..185252)
tnsB, tnsC, tniQ, cas12k, tracrRNA, CRISPR
V-K
(V-U5)
 Cyanothece sp. PCC 8801
PCC8801_2993–PCC8801_2997
VI
RNA
 cas13a, cas1, cas2, CRISPR
VI-A
 Leptotrichia shahii
B031_RS0110445
RNA
 WYL, cas13d, cas1, cas2, CRISPR
VI-D
 Ruminococcus bicirculans
RBI_RS12820
RNA?
 cas13c, CRISPR
VI-C
 Fusobacterium perfoetens
T364_RS0105110
RNA
 cas13b1, csx28, CRISPR
VI-B1
 Prevotella buccae
HMPREF6485_RS00335–HMPREF6485_RS00340
RNA
 csx27, cas13b2, CRISPR
VI-B2
 Bergeyella zoohelcum
HMPREF9699_02005–HMPREF9699_02006
1 
Die fett gekennzeichneten Gene stellen Gene von Effektorkomplexen von CRISPR/Cas-Systemen der Klasse I und Gene von Effektorproteinen von CRISPR/Cas-Systemen der Klasse II dar.

Anwendungen

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Verwendungsbeispiel des CRISPR/Cas-Systems in einem Plasmid
Blockade der Genexpression durch eine Cas9-Mutante (dCas9) im Zuge der CRISPRi

Das CRISPR/Cas-System kann unter anderem zum Genome Editing (Deletionen/Gen-Knockout[101] und Insertionen) und damit auch zur Gentherapie verwendet werden.[102][103]

Problematisch für humane Anwendungen könnte jedoch sein, dass das Immunsystem die Endonuklease Cas9, die bakteriellen Ursprungs ist, als Antigen erkennt. Über 80 % aller gesunden Menschen zeigen sowohl eine Antikörper-basierte humorale Immunantwort als auch eine auf T-Gedächtniszellen basierte zelluläre Immunantwort. Ursache hierfür ist, dass die meisten Menschen im Laufe ihres Lebens schon einmal mit Bakterien wie S. pyogenes oder S. aureus in Kontakt kamen und sich so entsprechende Antikörper und Gedächtniszellen bilden konnten.[104] Körperzellen, deren Genom mit CRISPR/Cas9 editiert wurde, können prinzipiell von cytotoxischen T-Zellen erkannt und durch Apoptose vernichtet werden. Der therapeutische Effekt wäre somit nicht mehr gegeben. Diese Problematik wird aktuell (Stand 2018) intensiv diskutiert.[105][106][107]

Weiterhin wird das CRISPR/Cas-System zur Entfernung der Genome von Krankheitserregern chronischer Infektionskrankheiten wie des Hepatitis-B-Virus[108] und des HIV[109][110] eingesetzt. Die gezielte Veränderung einzelner Gene wird bei der Charakterisierung von Onkogenen und somit zur Untersuchung der Tumorentstehung verwendet.[111][112] Das CRISPR/Cas-System wird zur Untersuchung der Funktionen von teilweise unbekannten Genen eingesetzt.[113] Zudem wird es zur Korrektur von Mutationen bei der Erzeugung induzierter pluripotenter Stammzellen[114] und embryonaler Stammzellen verwendet.[115][116] Weitere Anwendungen werden untersucht.[117] Im März 2020 setzten Wissenschaftler erstmals CRISPR-Cas9 in einem menschlichen Körper ein. Sie versuchen in einer klinischen Studie mittels Genome Editing das Sehvermögen eines Patienten mit Lebersche Kongenitale Amaurose wiederherzustellen, nachdem Tests in menschlichen Zellen, Mäusen und Affen erfolgreich verliefen und sie eine offizielle Genehmigung erhielten. Sie injizieren dazu drei Tropfen mit Milliarden Viren unter die Retina des Patienten. Die Änderung der DNA ist permanent und – anders als beim Human Germline Engineering – nicht vererbbar.[118][119][120] Im Juni 2020 wurden vorläufige Ergebnisse der, im Frühjahr 2019 gestarteten, ersten klinischen Studie zur Behandlung von vererbten genetischen Erkrankungen mittels CRISPR-Cas9 außerhalb von China veröffentlicht. Sie deuten auf einen Erfolg der Behandlung („CTX001“) hin.[121][122] 2021 wurde die erste, kleine klinische Studie intravenöser CRISPR-Genbearbeitung im Menschen mit erfolgversprechenden Ergebnissen beendet.[123][124]

Mit dem CRISPR/Cas-System wurden unter anderem Bakteriophagen-resistente Bakterienstämme erzeugt, und dies durch eine adaptive Resistenz bei Hinzufügen entsprechender RNA bei industriell wichtigen Bakterien, z. B. in der Milch- oder Weinindustrie. Durch ein mutiertes Cas ohne funktionsfähige Endonuklease (dCas9) kann ein DNA-bindendes Protein erzeugt werden, das unter anderem analog zur RNAi zu einem Knockdown von endogenen Genen führt,[125] z. B. durch Transformation mit einem Plasmid, aus dem Cas9 und eine CRISPR-RNA transkribiert wird (CRISPRi).[126] Ebenso kann im Zuge der CRISPRa mittels dCas9 als Fusionsprotein mit einem Aktivator an einer anderen, bestimmbaren Stelle im Genom eine Transkription eingeleitet werden. Anhand charakteristischer CRISPR-Sequenzen können CRISPR/Cas enthaltende Bakterienstämme identifiziert werden (spoligotyping). Ein grün fluoreszierendes Protein kann mit einer Cas-Mutante als Fusionsprotein zur Markierung von DNA-Sequenzen (auch repetitiver Sequenzen wie Telomere) verwendet werden.[127] Durch das CRISPR/Cas-System konnte die Herstellungszeit von Mäusen mit komplexen Genomveränderungen von bis zu zwei Jahren auf wenige Wochen verkürzt werden.[41]

Pflanzenzüchtung

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Die CRISPR-Methode eröffnet Pflanzenzüchtern die Möglichkeit, Sorten von Nutzpflanzen auf eine leichtere, effizientere und flexiblere Art zu verändern.[128] Für mehrere Nutzpflanzen liegen bereits Studien vor, aber es sind noch keine CRISPR-Pflanzen auf dem Markt.[129][130][131]

Caribou Biosciences, die 2011 von Doudna und Charpentier gegründete Firma, ging eine strategische Partnerschaft mit DuPont Pioneer ein. Abhängig vom Ausgang des Patentstreits könnte DuPont daher die Rechte an der Anwendung der Methode bei wichtigen Nutzpflanzen wie Mais, Raps und Sojabohne erhalten und Caribou für kleinere Märkte wie Obst und Gemüse. Unklar ist auch, wie sich der letztendliche Patentinhaber hinsichtlich der Lizenzierung der Methode verhalten wird.[129][130] Im September 2016 vergab das Broad-Institut eine (nicht exklusive) Lizenz zur Anwendung der Methode an Monsanto. Von der Lizenz ausgeschlossen sind Gene Drive sowie Anwendungen bei Tabak und die Herstellung steriler Pflanzen.[132]

Gleichzeitig besteht weiterhin Unklarheit bezüglich der Regulierung von CRISPR-Pflanzen (ausschließlich mit Deletionen, ohne Insertionen) in verschiedenen Ländern. Die für die mögliche zukünftige kommerzielle Nutzung von CRISPR-Pflanzen in der Landwirtschaft entscheidende Frage ist, ob diese rechtlich als gentechnisch veränderte Pflanzen angesehen werden, sofern nur etwas aus dem Genom entfernt und kein Transgen eingefügt wurde, da gentechnisch veränderte Pflanzen insbesondere in der EU sehr streng reguliert sind.[129][130][131] Das US-Landwirtschaftsministerium verkündete bereits im April 2016, zwei mit der CRISPR-Methode hergestellte Organismen, einen nicht-bräunenden Champignon und einen Wachsmais mit verändertem Stärkegehalt, nicht zu regulieren.[133] 2021 gingen in Japan Tomaten mit per CRISPR fünffach erhöhtem Gehalt an, möglicherweise leicht beruhigend wirkendem,[134] GABA auf den öffentlichen Markt.[135]

Tierzüchtung

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Durch die CRISPR/Cas-Methode kann zum Beispiel das Geschlecht von Tieren beeinflusst werden. In der Schweinemast könnte dadurch das Problem des Ebergeruchs angegangen werden.[136]

Um die Tötung männlicher Eintagsküken zu verhindern, wurden Hühner so verändert, dass männliche Embryos automatisch absterben.[137]

Bekämpfung von Insekten

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Entdeckungsgeschichte

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Siehe auch: CRISPR#Entdeckung und Eigenschaften

Die Entdeckung und Erforschung der CRISPR-Sequenzen und des damit verbundenen CRISPR/Cas-Systems im Immunsystem verschiedener Bakterien und Archaea erfolgte in mehreren Schritten seit es im Jahr 1987 zum ersten Mal beschrieben wurde.[56] Obwohl die Funktion von CRISPR/Cas noch nicht bekannt war, wurde es zu Beginn der 1990er Jahre für das sog. Spoligotyping (die Genom-Typisierung von Bakterien-Isolaten über die Erkennung der unterschiedlichen Spacer innerhalb der direct-repeat-region) genutzt.[56]

Vor allem in den frühen 2000ern wurden die Zusammenhänge zwischen den CRISPR-Sequenzen der DNA und den cas-Genen sowie ihre Bedeutung in der Immunabwehr der Bakterien identifiziert. Ab 2008 war bekannt, dass das adaptive CRISPR DNA bindet.[138]

Im Jahr 2011 zeigte eine Arbeitsgruppe um Emmanuelle Charpentier und Jennifer Doudna, dass mittels des CRISPR/Cas-Systems der Mikroorganismen spezifische DNA-Ziele in vitro geschnitten werden können.[56][139] Sie reichten ihre wissenschaftliche Arbeit am 8. Juni 2012 bei der Fachzeitschrift Science ein, wo sie am 28. Juni veröffentlicht wurde.[1] Parallel zu ihnen arbeitete eine Arbeitsgruppe um Virginijus Šikšnys an der Methode, die bereits im April 2012 ihre Arbeit bei Cell einreichten; diese wurde jedoch abgelehnt, wenngleich die Herausgeber von Cell dem Artikel nachträglich eine große Bedeutung zuschrieben.[140] Im Mai reichten Šikšnys und Kollegen das Papier in den Proceedings of the National Academy of Sciences (PNAS) ein, wo es am 4. September online veröffentlicht wurde.[141]

Doudna und Charpentier beschrieben, wie sich in einem Bakterium gezielt Abschnitte aus dem Erbgut entfernen lassen. Dem Neurowissenschaftler Feng Zhang vom Massachusetts Institute of Technology gelang es später, die CRISPR-Methode nicht nur im Bakterium anzuwenden, sondern für alle Zellen zu optimieren.[142] Der Leiter des Broad Institute und Vorgesetzte von Feng Zhang, Eric Lander, verfasste im Januar 2016 einen Artikel über die Anteile der verschiedenen Wissenschaftler an der Entdeckung des CRISPR/Cas-Systems,[143] der aufgrund von einseitiger Darstellung und eines vermuteten Interessenskonflikts kritisiert wurde.[144][145][146]

Charpentier und Doudna erhielten 2014 für die Entdeckung der CRISPR/Cas-Methode den mit drei Millionen Dollar für jeden Preisträger dotierten Breakthrough Prize in Life Sciences[147] des Jahres 2015 und wurden mit zahlreichen weiteren Preisen bedacht. Im Jahr 2020 erhielten sie den Nobelpreis für Chemie. Innerhalb der ersten fünf Jahre nach Veröffentlichung ist die Methode eine Standardmethode in Laboren geworden und es wurden darüber in diesen fünf Jahren 2.500 wissenschaftliche Veröffentlichungen publiziert.[148]

Patentstreit

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Sowohl Doudna und Charpentier (University of California, Berkeley) als auch Zhang (Broad) beantragten grundlegende Patente auf die CRISPR/Cas-Methode. Doudna und Charpentier reichten ihren Antrag beim United States Patent and Trademark Office (USPTO) im Mai 2012, Zhang im Dezember 2012 ein, und Zhang beantragte ein Schnellverfahren. Zhang wurden im Mai 2014 Patentrechte zugesprochen. Das USPTO begründete diese Entscheidung damit, dass Zhang die Methode für alle Zellen tauglich machte.[142] Doudna und Charpentier reichten Klage beim USPTO gegen diese Entscheidung ein. Das Verfahren zur Klärung der Urheberschaft lief im Januar 2016 an. Broad argumentiert, Berkeley habe die Methode zwar für Prokaryoten (Bakterien), aber nicht hinreichend für Eukaryoten (z. B. Mäuse und menschliche Zellen) beschrieben. Berkeley argumentiert, der Schritt von Pro- zu Eukaryoten bedürfe keiner erfinderischen Tätigkeit.[149] Im Februar 2017 entschied das USPTO zugunsten von Broad und lehnte die Klage der University of California mit der Begründung ab, dass die Anwendung der von Doudna und Charpentier beschriebenen CRISPR/Cas-Methode auf Eukaryoten nicht offensichtlich sei.[150] Im März 2022 sprach das US-Patentamt dem Broad Institute of MIT and Harvard das Recht an der CRISPR/CAS-Methode zu, weil Zhang als Erster deren Einsatz in Eukaryoten – und damit auch in menschlichen Zellen – publiziert habe.[151][152]

Auch das Europäische Patentamt (EPA) muss im Patentstreit Entscheidungen fällen. Hinsichtlich des Berkeley-Patentantrags hat das EPA bereits argumentiert, der Antrag habe die Erfindung nicht ausreichend beschrieben, da die Hervorhebung der Rolle der PAM-Sequenzen fehle. Berkeley vertritt die Ansicht, dass diese Rolle für Fachleute offensichtlich ist. Dem Broad-Institut wurden hingegen bereits mehrere Patente an der CRISPR/Cas-Methode zugesprochen, die jedoch von mehreren Seiten angefochten wurden. Kläger verweisen zum Beispiel darauf, dass Broads ursprünglicher Patentantrag einen Wissenschaftler der Rockefeller University als an der Erfindung Mitbeteiligten erwähnte, eine spätere Version des Antrags jedoch nicht.[149]

Derweil kündigte die UC Berkeley im Mai 2021 an, dass sie NFTs zum Zweck der Offenlegung des Patents unter anderem der CRISPR/Cas-Methode versteigern würde. Hierbei würde die Universität weiterhin der Patenteigentümer sein: Die NFTs stehen lediglich im Zusammenhang mit dem Formular der Patentoffenlegung der Universität, bei dem es sich um ein internes Dokument handelt, welches von der Universität für Forschende genutzt wird, um Erfindungen offenzulegen.[153] 85 % der durch die gesamte Kollektion entstandenen Einnahmen sollten laut der entsprechenden Verlautbarung zur Forschungsfinanzierung verwendet werden.[154] Das als The Fourth Pillar (dt. „Die vierte Säule“) bezeichnete Werk wurde im Juni 2022 für 22 Ether (zum damaligen Zeitpunkt circa 54.000 US-Dollar) versteigert und von einer Gruppe Absolventen der UC Berkeley aufgekauft. Das Geld wurde für Forschungszwecke verteilt.[155]

Risiken

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Die Methode ist eine verhältnismäßig einfache, preiswerte, leicht verfügbare, punktgenaue und effiziente Technik. In den ersten Jahren war nicht geregelt, ob reine Deletionen, die auch durch zufällige Mutagenese im Rahmen einer Züchtung entstehen können (jedoch bei der Züchtung nicht zielgerichtet), als Gentechnik zu bewerten sind. Kritiker weisen darauf hin, dass es beispielsweise internationaler Standards und Vorsorgemaßnahmen bedürfe, um Wildwuchs und Missbrauch vorzubeugen. Hier bestehen auch Befürchtungen vor kriminellen oder terroristischen Anwendungen; das amerikanische FBI beispielsweise beobachtet entsprechende mehr oder weniger private Do-it-Yourself (DIY)-„Garagen-Bastler“ („Bio-Hacker“). In Bezug auf den Eingriff in die menschliche Keimbahn durch Verwendung einer CRISPR/Cas-Methode auf menschlichen Keimzellen in Verbindung mit einer In-vitro-Fertilisation im Rahmen einer Gentherapie gibt es bioethische Bedenken.[156] Der frankokanadische Neurologe Jean-François Gariépy warnt in der Monografie The revolutionary phenotype vor einer Genmodifizierung von Menschen. Aufgrund der Komplexität von Genmodifikationen sei eine auf Computerprogramme gestützte Änderung des menschlichen Erbguts unumgänglich. Ausgehend von der RNA-Welt-Hypothese, wonach RNA-basierte Lebensformen durch DNA-basierte abgelöst wurden, argumentiert Gariépy, dass eine solche Vorgehensweise auf lange Sicht ebenfalls zu einer revolutionären Umwandlung der menschlichen Lebensform mit nicht absehbaren Folgen führen könne.[157] Der Deutsche Ethikrat warnt vor „unerwünschten gesundheitlichen Folgen“ angesichts noch unausgereifter Verfahren. Zudem bestünden nicht absehbare ethische Folgen.[158]

Recht

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Der Europäische Gerichtshof (EuGH) entschied am 25. Juli 2018, dass grundsätzlich auch mit der CRISPR/Cas-Methode (Mutagenese) bearbeitete Pflanzen ohne Fremd-DNA als gentechnisch veränderte Organismen (GVO) anzusehen sind und grundsätzlich den in der GVO-Richtlinie vorgesehenen Verpflichtungen unterliegen (Az. C-528/16). Geklagt hatte die französische Bauerngewerkschaft Confédération paysanne und weitere acht Verbände gegen die französische Regierung.[159]

Das Urteil wurde von Umweltschützern gelobt, während Naturwissenschaftler die Auswirkungen kritisch beurteilten, da die Entfernung von DNA auch durch klassische Methoden der Züchtung erreicht würde, wie eine Behandlung mit radioaktiver Strahlung oder mit erbgutverändernden Chemikalien (deren Erzeugnisse nicht als GVO klassifiziert werden), allerdings erfolgen klassische Methoden nach dem Zufallsprinzip.[160] Es sei fraglich, ob von nun an noch Forschungsförderung für entsprechende Projekte gewährt werde. Zudem ist die Zulassung aufwändiger.[160] Auch sei die diesbezügliche Forschung innerhalb der EU für Unternehmen unter den neuen rechtlichen Rahmenbedingungen nicht mehr profitabel. Deshalb werde sie nicht mehr innerhalb der EU erfolgen.[161] Weiterhin wurden nachteilige Auswirkungen auf den Welthandel befürchtet.[162]

Die Europäische Kommission hat im Sommer 2023 vorgeschlagen, gen-editierte Pflanzen bei der Zulassung genauso zu behandeln wie herkömmliche Pflanzenzüchtungen. Das läuft auf eine Anmeldepflicht ohne weitere Sonderregeln hinaus. Bedingung ist, dass diese Pflanzen auch auf natürlichem Wege oder durch gezielte Züchtung – etwa durch Kreuzung oder Auslese – entstanden sein könnten.
Das Europäische Parlament hat sich am 8. Februar 2024 mit einer Mehrheit von 307 zu 263 Stimmen und 41 Enthaltungen hinter den Kommissionsvorschlag für die neue Gentechnik-Verordnung gestellt. Anders als die Kommission fordern die Europaabgeordneten allerdings eine Kennzeichnungspflicht von Waren (etwa im Einzelhandel), die durch neue genomische Techniken erzeugte Bestandteile enthalten. Die EU-Kommission hatte nur vorgeschlagen, das Saatgut zu kennzeichnen. Dies soll verhindern, dass das Saatgut versehentlich im Ökolandbau verwendet wird. Dort soll es, so auch der Beschluss des Europäischen Parlaments, verboten bleiben.[163]

Siehe auch

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Agrogentechnik

Literatur

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  • Marlene Belfort, Richard P. Bonocora: Homing endonucleases: from genetic anomalies to programmable genomic clippers. In: Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). Band 1123, 2014, S. 1–26, doi:10.1007/978-1-62703-968-0_1, PMID 24510256, PMC 4436680 (freier Volltext).
  • Jim Kozubek: Modern Prometheus. Cambridge University Press, 2016, ISBN 978-1-316-78098-5.
  • Jennifer A. Doudna, Samuel H. Sternberg: Eingriff in die Evolution: Die Macht der CRISPR-Technologie und die Frage, wie wir sie nutzen wollen. Springer Verlag, Berlin Heidelberg, 2018, ISBN 3-662-57444-6.
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Einzelnachweise

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  1. ↑ a b c d Martin Jinek, Krzysztof Chylinski, Ines Fonfara, Michael Hauer, Jennifer A. Doudna, Emmanuelle Charpentier: A Programmable Dual-RNA–Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity. In: Science. Band 337, Nr. 6096, 17. August 2012, ISSN 0036-8075, S. 816–821, doi:10.1126/science.1225829, PMID 22745249.
  2. ↑ H. Ochiai: Single-Base Pair Genome Editing in Human Cells by Using Site-Specific Endonucleases. In: International journal of molecular sciences. Band 16, Nummer 9, 2015, S. 21128–21137, doi:10.3390/ijms160921128, PMID 26404258, PMC 4613245 (freier Volltext) (Review).
  3. ↑ M. M. Mahfouz, A. Piatek, C. N. Stewart: Genome engineering via TALENs and CRISPR/Cas9 systems: challenges and perspectives. In: Plant biotechnology journal. Band 12, Nummer 8, Oktober 2014, S. 1006–1014, doi:10.1111/pbi.12256, PMID 25250853.
  4. ↑ E. Pennisi: The CRISPR craze. In: Science. Band 341, Nummer 6148, August 2013, S. 833–836, doi:10.1126/science.341.6148.833, PMID 23970676.
  5. ↑ Email Science: And Science’s Breakthrough of the Year is … In: news.sciencemag.org. 17. Dezember 2015, abgerufen am 17. Dezember 2015 (englisch).
  6. ↑ Jennifer Doudna, Emmanuelle Charpentier.: The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science 346(6213):1077 (2014), PMID 25430774, doi:10.1126/science.1258096.
  7. ↑ R. Sorek, V. Kunin, P. Hugenholtz: CRISPR–a widespread system that provides acquired resistance against phages in bacteria and archaea. In: Nature reviews. Microbiology. Band 6, Nummer 3, März 2008, S. 181–186, ISSN 1740-1534. doi:10.1038/nrmicro1793. PMID 18157154.
  8. ↑ D. Rath, L. Amlinger, A. Rath, M. Lundgren: The CRISPR-Cas immune system: biology, mechanisms and applications. In: Biochimie. Band 117, Oktober 2015, S. 119–128, doi:10.1016/j.biochi.2015.03.025, PMID 25868999 (Review).
  9. ↑ G. Gasiunas, R. Barrangou, P. Horvath, V. Siksnys: Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. In: Proceedings of the National Academy of Sciences. Band 109, Nummer 39, September 2012, S. E2579–E2586, ISSN 1091-6490. doi:10.1073/pnas.1208507109. PMID 22949671. PMC 3465414 (freier Volltext).
  10. ↑ V. Kunin, R. Sorek, P. Hugenholtz: Evolutionary conservation of sequence and secondary structures in CRISPR repeats. In: Genome biology. Band 8, Nummer 4, 2007, S. R61, ISSN 1465-6914. doi:10.1186/gb-2007-8-4-r61. PMID 17442114. PMC 1896005 (freier Volltext).
  11. ↑ F. Jiang, D. W. Taylor, J. S. Chen, J. E. Kornfeld, K. Zhou, A. J. Thompson, E. Nogales, J. A. Doudna: Structures of a CRISPR-Cas9 R-loop complex primed for DNA cleavage. In: Science. Band 351, Nummer 6275, Februar 2016, S. 867–871, doi:10.1126/science.aad8282, PMID 26841432.
  12. ↑ S. H. Sternberg, S. Redding, M. Jinek, E. C. Greene, J. A. Doudna: DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. In: Nature. Band 507, Nummer 7490, März 2014, S. 62–67, doi:10.1038/nature13011, PMID 24476820, PMC 4106473 (freier Volltext).
  13. ↑ E. Deltcheva, K. Chylinski, C. M. Sharma, K. Gonzales, Y. Chao, Z. A. Pirzada, M. R. Eckert, J. Vogel, E. Charpentier: CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. In: Nature. Band 471, Nummer 7340, März 2011, S. 602–607, doi:10.1038/nature09886, PMID 21455174, PMC 3070239 (freier Volltext).
  14. ↑ S. J. Brouns: Molecular biology. A Swiss army knife of immunity. In: Science. Band 337, Nummer 6096, August 2012, S. 808–809, doi:10.1126/science.1227253, PMID 22904002.
  15. ↑ M. Lu, S. Billerbeck: Improving homology-directed repair by small molecule agents for genetic engineering in unconventional yeast?-Learning from the engineering of mammalian systems. In: Microbial biotechnology. Band 17, Nummer 2, Februar 2024, S. e14398, doi:10.1111/1751-7915.14398, PMID 38376092, PMC 1087801 (freier Volltext).
  16. ↑ M. Liu, S. Rehman, X. Tang, K. Gu, Q. Fan, D. Chen, W. Ma: Methodologies for Improving HDR Efficiency. In: Frontiers in genetics. Band 9, 2018, S. 691, doi:10.3389/fgene.2018.00691, PMID 30687381, PMC 6338032 (freier Volltext).
  17. ↑ H. Yang, S. Ren, S. Yu, H. Pan, T. Li, S. Ge, J. Zhang, N. Xia: Methods Favoring Homology-Directed Repair Choice in Response to CRISPR/Cas9 Induced-Double Strand Breaks. In: International Journal of Molecular Sciences. Band 21, Nummer 18, September 2020, S. , doi:10.3390/ijms21186461, PMID 32899704, PMC 7555059 (freier Volltext).
  18. ↑ S. A. Smirnikhina, M. I. Zaynitdinova, V. A. Sergeeva, A. V. Lavrov: Improving Homology-Directed Repair in Genome Editing Experiments by Influencing the Cell Cycle. In: International Journal of Molecular Sciences. Band 23, Nummer 11, Mai 2022, S. , doi:10.3390/ijms23115992, PMID 35682671, PMC 9181127 (freier Volltext).
  19. ↑ W. Sun, H. Liu, W. Yin, J. Qiao, X. Zhao, Y. Liu: Strategies for Enhancing the Homology-Directed Repair Efficiency of CRISPR-Cas Systems. In: The CRISPR journal. Band 5, Nummer 1, Februar 2022, S. 7–18, doi:10.1089/crispr.2021.0039, PMID 35076280.
  20. ↑ Researchers establish new viable CRISPR-Cas12b system for plant genome engineering In: phys.org. Abgerufen am 6. April 2020 (amerikanisches Englisch). 
  21. ↑ Meiling Ming, Qiurong Ren, Changtian Pan, Yao He, Yingxiao Zhang, Shishi Liu, Zhaohui Zhong, Jiaheng Wang, Aimee A. Malzahn, Jun Wu, Xuelian Zheng, Yong Zhang, Yiping Qi: CRISPR–Cas12b enables efficient plant genome engineering. In: Nature Plants. 6. Jahrgang, Nr. 3, März 2020, S. 202–208, doi:10.1038/s41477-020-0614-6, PMID 32170285.
  22. ↑ RNA editing with CRISPR-Cas13. In: Science. 358. Jahrgang, Nr. 6366, November 2017, S. 1019–1027, doi:10.1126/science.aaq0180, PMID 29070703, PMC 5793859 (freier Volltext), bibcode:2017Sci...358.1019C.
  23. ↑ CRISPR-Cas3 innovation holds promise for disease cures, advancing science In: Cornell Chronicle. Abgerufen am 24. Oktober 2021 (englisch). 
  24. ↑ Adam E. Dolan, Zhonggang Hou, Yibei Xiao, Max J. Gramelspacher, Jaewon Heo, Sara E. Howden, Peter L. Freddolino, Ailong Ke, Yan Zhang: Introducing a Spectrum of Long-Range Genomic Deletions in Human Embryonic Stem Cells Using Type I CRISPR-Cas. In: Molecular Cell. 74. Jahrgang, Nr. 5, 6. Juni 2019, ISSN 1097-2765, S. 936–950.e5, doi:10.1016/j.molcel.2019.03.014 (englisch).
  25. ↑ Researchers develop an engineered 'mini' CRISPR genome editing system In: phys.org. Abgerufen am 18. Oktober 2021 (englisch). 
  26. ↑ Xiaoshu Xu, Augustine Chemparathy, Leiping Zeng, Hannah R. Kempton, Stephen Shang, Muneaki Nakamura, Lei S. Qi: Engineered miniature CRISPR-Cas system for mammalian genome regulation and editing. In: Molecular Cell. 3. September 2021, ISSN 1097-2765, doi:10.1016/j.molcel.2021.08.008 (englisch).
  27. ↑ a b Heidi Ledford: Alternative CRISPR system could improve genome editing. In: Nature. 526, 2015, S. 17, doi:10.1038/nature.2015.18432.
  28. ↑ UniProt T0D7A2: cas12b – CRISPR-associated endonuclease Cas12b – Alicyclobacillus acidoterrestris (strain ATCC 49025 / DSM 3922 / CIP 106132 / NCIMB 13137 / GD3B) – cas12b gene (uniprot.org) (englisch) vom 16. Oktober 2013, abgerufen am 24. Januar 2019
  29. ↑ M. R. O’Connell, B. L. Oakes, S. H. Sternberg, A. East-Seletsky, M. Kaplan, J. A. Doudna: Programmable RNA recognition and cleavage by CRISPR/Cas9. In: Nature. Band 516, Nummer 7530, Dezember 2014, S. 263–266, ISSN 1476-4687. doi:10.1038/nature13769. PMID 25274302.
  30. ↑ C. R. Hale, P. Zhao, S. Olson, M. O. Duff, B. R. Graveley, L. Wells, R. M. Terns, M. P. Terns: RNA-guided RNA cleavage by a CRISPR RNA-Cas protein complex. In: Cell. Band 139, Nummer 5, November 2009, S. 945–956, doi:10.1016/j.cell.2009.07.040, PMID 19945378, PMC 2951265 (freier Volltext).
  31. ↑ Rodolphe Barrangou, A. Birmingham, S. Wiemann, R. L. Beijersbergen, V. Hornung, A. v. Smith: Advances in CRISPR-Cas9 genome engineering: lessons learned from RNA interference. In: Nucleic acids research. Band 43, Nummer 7, April 2015, S. 3407–3419, doi:10.1093/nar/gkv226, PMID 25800748, PMC 4402539 (freier Volltext).
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