Luciferine

aus Wikipedia, der freien Enzyklopädie
Wechseln zu: Navigation, Suche
Ein Glühwürmchen der Art Lampyris noctiluca. Durch eine biochemische Reaktion mit Hilfe eines artspezifischen Luciferins wird dabei Licht erzeugt.

Luciferine sind unterschiedliche Naturstoffe, die in verschiedenen biolumineszenten Organismen zur Erzeugung von Licht genutzt werden. Durch katalytische Aktivität des entsprechenden Luciferase-Enzyms reagieren sie mit Sauerstoff (Oxidation). Bei der Veränderung, meistens der Abspaltung von Teilgruppen an dem Luciferin, wird Energie in Form von Licht abgegeben. Sowohl Luciferine als auch Luciferasen sind art- oder taxonspezifisch, also für jede Lebewesengruppe kennzeichnend.

Geschichte[Bearbeiten]

Zu Beginn des 18. Jahrhunderts beobachtete René Réaumur, dass Pulver von getrockneten und gemahlenen biolumineszierenden Organismen bei Zugabe von Wasser leuchten. Die ersten Arbeiten auf Luciferin-Luciferase-Systeme gehen auf den Franzosen Raphael Dubois zurück. Er entdeckte bei Arbeiten an Leuchtkäfern 1885, dass ein Stoff in einer lichtgebenden Reaktion verbraucht wird. Dabei extrahierte er aus verschiedenen Organismen, die biologisches Licht erzeugten, diesen Stoff und bezeichnete ihn als Luciferin, da er auch durch Hitze nicht zerstört wird. Die andere, hitzelabile Komponente hat der Wissenschaftler als Luciferase bezeichnet. Heutzutage wird Luciferase allgemein als das Enzym bezeichnet, das das dazugehörende Luciferin umsetzt. Beim Mischen von Luciferin mit Luciferase in Gegenwart von Sauerstoff konnte Dubois die natürliche Biolumineszenz imitieren.[1]

Die nächsten Untersuchungen wurden von Newton Harvey Anfang des 20. Jahrhunderts durchgeführt.[2] Er fand heraus, dass es in jedem Luciferin-Luciferase-System eine Spezifität gibt. So können Luciferine der einen Spezies nicht durch die Luciferase einer artfremden Spezies umgesetzt werden. Schließlich benötigt jedes biolumineszente System Sauerstoff. Dies wurde aber schon im 18. Jahrhundert von Robert Boyle beobachtet.

Eigenschaften[Bearbeiten]

Biolumineszente Systeme sind nicht evolutionär konserviert, die Luciferasen teilen keine Sequenzhomologie. Luciferasen treten aber in 17 unterschiedlichen Stämmen und mindestens 700 meist marinen Gattungen auf.[3] Offenbar wurden sie oft „erfunden“, phylogenetische Studien wiesen darauf hin, dass Luciferin-Luciferase-Systeme mehr als 30 unabhängige Ursprünge besitzen.[4]

Definition[Bearbeiten]

Laut klassischer Definition ist das an der Luciferase gebundene Luciferin der Lichtemitter. Die Luciferase setzt unter Verbrauch von Sauerstoff das Luciferin hierbei um, manchmal werden dafür auch Cofaktoren wie ATP oder Ionen benötigt. Das oxidierte Luciferin befindet sich zunächst in einem Übergangszustand I und gelangt dann – häufig nach Decarboxylierung und weiteren Zwischenschritten – in einen elektronisch angeregten Zustand P*. Dieser fällt nach recht kurzer Zeit (wenige Nanosekunden) zurück in seinen Grundzustand P und emittiert währenddessen einen Lichtquant. Normalerweise sind die umgesetzten Luciferine auch Fluorophore, da sie durch Bestrahlen von Licht in einen angeregten Zustand gelangen können.

Luciferine (L) werden durch Luciferasen unter Verbrauch von Sauerstoff umgesetzt, dabei entsteht über ein Zwischenschritt I letztlich ein Molekül in einem elektronisch angeregten Zustand P*. Nach einer kurzen Lebenszeit wird ein Photon emittiert und der Grundzustand P erreicht.

Prinzipien[Bearbeiten]

Um in den angeregten Zustand P* zu gelangen, ist biochemisch gesehen viel Energie nötig. Die Emission von Photonen mit einer Wellenlänge von 500 nm (grün, Energie etwa 2 eV/Photon) benötigt etwa 250 kJ/mol – zum Vergleich: die Hydrolyse von ATP zu ADP und Phosphat setzt etwa 30 kJ/mol frei. Außerdem kann die Energie nur in einem Schritt freigesetzt werden.

Das häufigste Prinzip ist die Bildung eines Vierrings, eines Dioxetan bzw. Dioxetanon (α-Peroxylacton). Nach erfolgter Decarboxylierung bildet sich der elektronisch angeregte Zustand.

Ein Dioxetanon ist instabil und zerfällt unter Abspaltung von CO2. Dies erzeugt ein Keton im elektrisch angeregten Zustand.

Manchmal entspricht die Fluoreszenz nicht der erwarteten, zum Beispiel bei Studien in vitro (im Reagenzglas). Dafür gibt es verschiedene Ursachen. So emittieren an Enzyme gebundene Luciferine bei Oxidation anders als freie Luciferine nach Anregung durch Licht. Manchmal wird die Energie an einen zweiten Fluorophor übertragen, so wie es beispielsweise bei Aequorin zu GFP in Aequorea victoria geschieht.

Quantenausbeute Q[Bearbeiten]

Ob die Umsetzung eines Luciferins durch die korrespondierende Luciferase effizient ist, wird durch die sogenannte Quantenausbeute Q (quantum yield) bestimmt. Sie ist definiert als die Anzahl der emittierten Lichtquanten je dafür umgesetztes Molekül Luciferin.[5] Definitionsbedingt ist der Höchstwert von Q = 1, dies würde nämlich bedeuten, dass bei jedem umgesetzten Molekül Luciferin ein Lichtquant frei wird. Die bislang höchste Quantenausbeute wurde für das Leuchtkäferluciferin aus Photinus pyralis mit Q = 0,41 nachgewiesen.

Luciferin-Arten[Bearbeiten]

Luciferin-Luciferase-Systeme kommen in zahlreichen Arten vor. Es gibt vier Hauptklassen an Luciferin-Luciferase-Systeme, bei denen das Luciferin nach Umsetzung durch eine Luciferase in einen elektronisch angeregten Zustand überführt und damit der eigentliche Lichtemitter wird.

Das Firefly-Luciferin, ein Benzothiazolen[Bearbeiten]

Ein Glühwürmchen der Art Lampyris noctiluca
Photinus pyralis im Flug

Biolumineszente Insekten sind in den vier Ordnungen Collembola, Hemiptera, Coleoptera sowie Diptera vertreten. Jedoch wurden nur die Biolumineszenzsysteme aus Organismen der beiden letzt genannten Ordnungen untersucht. Bei Coleoptera (Käfer) können Vertreter aus drei Familien Licht erzeugen: Phengodidae (Federleuchtkäfer), Elateridae (Schnellkäfer) sowie Lampyridae (Leuchtkäfer).[6]

Der amerikanische Leuchtkäfer Photinus pyralis (engl. firefly) gehört zur Familie der Lampyridae. Er wurde bereits von Dubois zu seinen Studien über Luciferine-Luciferasen (vgl. oben) herangezogen. Wissenschaftliche erste Untersuchungen der Biolumineszenzreaktion bei P. pyralis wurden 1917 durch Harvey eingeleitet. Inzwischen ist dieses Luciferin-Luciferase-System das am besten untersuchte und wird im Folgenden vorgestellt.

Biolumineszenzreaktion[Bearbeiten]

Strukturformel von D-Luciferin (PubChem 5459882) aus Leuchtkäfern der Art Photinus pyralis. Es wird im Folgenden auch als LH2 abgekürzt.

Für die Reaktion setzt eine Luciferase das Substrat D-Luciferin (LH2), ein Benzothiazol, unter Verbrauch von Sauerstoff um. Die Arbeiten von William D. McElroy Ende der 1940er Jahre haben gezeigt, dass für die Reaktion ATP und Magnesiumionen als Cofaktoren benötigt werden:[6]

\mathrm{LH_2 + O_2 + ATP \xrightarrow[Mg^{2+}]{Luciferase} \ oxy\text{-}L + CO_2 + AMP + PP_i + h\nu}

Im Vergleich zu Luciferinen anderer Systeme (siehe unten) ist das Luciferin aus Leuchtkäfern eine relativ stabile Verbindung. Der Schmelzpunkt liegt bei 205–210 °C. Sein molarer Extinktionskoeffizient bei 328 nm beträgt ε = 18.200 M−1·cm−1. Luciferin fluoresziert und zeigt ein Emissionsmaximum bei λmax = 537 nm.

Die Luciferase (EC 1.13.12.7) der Leuchtkäfer hat eine Molekularmasse von ca. 60–62 kDa, bei P. pyralis genau 61 kDa und ist aus 550 Aminosäuren aufgebaut. Sie katalysiert die oxidative Decarboxylierung von Luciferin zu Oxyluciferin (oxy-L, vgl. auch untenstehende Abbildung, Kasten). Die Reaktion läuft in den Peroxisomen der Lichtorganzellen ab.[7] Die Struktur der Luciferase aus P. pyralis wurde erstmals 1956 mit einer Auflösung von 200 pm dargestellt. Für diese Analyse wurden große Mengen an Leuchtkäfern durch hilfsbereite Kinder gesammelt, die für jedes abgelieferte Exemplar einen Cent Belohnung erhalten hatten.

Ohne gebundenes Substrat liegt die Luciferase in einer offenen Konformation vor; ein großer N-terminaler und ein kleiner C-terminaler Bereich bilden eine tiefe Furche. Bei Substratbindung führt eine Konformationsänderung zum Schließen der Furche.[8] Mitte der 1980er Jahre konnte Luciferase erfolgreich in das Genom des Bakteriums E. coli eingebaut und dort exprimiert werden. Luciferasen aus Leuchtkäfern der Familie Lampyridae sind sehr ähnlich aufgebaut. Die Unterschiede bestimmen aber die Farbe des emittierten Lichts.[9][10] Je nach Art liegt das Emissionsmaximum λmax des freigesetzten Lichts zwischen 530 nm (grün) und 635 nm (rot).

Die Reaktion läuft in vitro am besten bei einem pH-Wert von 7,8 und bei Temperatur von 23–25 °C ab. In vivo ist die Farbe des emittierten Lichts gelbgrün bis gelb (552–582 nm). Im Labor zeigt die Reaktion einen größeren Farbbereich. Im sauren Milieu erscheint das Licht rötlich (615 nm), im neutralen Milieu grün-gelb.

Reaktionsmechanismus[Bearbeiten]

Reaktionsmechanismus der Luciferinreaktion (Erklärungen im Text)

Der genaue Reaktionsmechanismus der Reaktion ist bekannt. Durch ATP wird das D-Luciferin zunächst an der Carboxygruppe adenyliert, wobei Pyrophosphat als Abgangsgruppe freigesetzt wird (1, vgl. Abbildung). Durch diese Aktivierung kann das Proton am C4-Atom abstrahiert werden, es bildet sich ein Carbanion (2). Anschließend kann das Luciferin am C4-Atom oxygeniert werden, es bildet sich ein lineares Hydroperoxid (3). Dieses bildet unter Abspaltung von AMP ein Dioxetanonring (4). Nach Decarboxylierung bildet sich daraus Oxyluciferin, was entweder als Monoanion (Ketoform, 5) oder Dianion (Enolform) vorliegen kann. In beiden Fällen ist das Oxyluciferin in einem energetisch angeregten Zustand. Es fällt unter Abgabe eines Photons (rotes Licht oder gelb-grünes Licht) in seinen Grundzustand zurück. Das Oxyluciferin selbst wurde noch nicht in Reinform isoliert, da es extrem instabil ist.

Der Reaktionsmechanismus mit Bildung eines Dioxetanons wurde am Ende der 1970er Jahre zweifelsfrei durch die Arbeiten von Shimomura belegt.[11] Hierbei wurde isotopenmarkiertes 18O bei der Reaktion verwendet (H218O bzw. 18O2). Die Ergebnisse dieser Arbeit lösten die bis dahin postulierte Hypothese ab, dass Oxyluciferin durch lineare Bindungsspaltungen entstehe.[12][13] Falls diese wirklich erfolgte, würde der freiwerdende Kohlenstoffdioxid ein Sauerstoffatom enthalten, der aus Wasser stammt. Tatsächlich kommt er aber aus dem Sauerstoff.

Die Lichtausbeute dieser Reaktion ist hoch, da die Quantenausbeute Q bei einem pH von 8,5 bei 0,41 liegt.[14]

Synthese[Bearbeiten]

Zwei vorgeschlagene Mechanismen für die Regeneration D-Luciferins aus Oxyluciferin (siehe hierbei auch Text). Abkürzungen: LH2 Luciferin; HS-CoA Coenzym A; 2C6HB 2-Cyano-6-hydroxybenzothiazol; L Oxyluciferin; Cys Cystein; TGA Mercaptoessigsäure.

Wie die Insekten – oder mikrobielle Symbionten – das Luciferin herstellen, ist nicht ganz geklärt. Man weiß, dass D-Luciferin nicht direkt vom Käfer aufgenommen wird (es sei denn bei weiblichen Käfern der Art Photuris, die ihre männlichen Artgenossen fressen).[15] Eine Möglichkeit besteht darin, das nach der Lichtreaktion entstandene Oxyluciferin zurück zu Luciferin zu recyclen. Hierbei soll zunächst das Oxyluciferin zu 2-Cyano-6-hydroxybenzothiazol (2C6HB) umgewandelt werden, was durch das Luciferin-regenerierende Enzym (LRE)[16], z. B. in Photinus pyralis, katalysiert wird. 2C6HB kondensiert dann mit einem D-Cystein zu D-Luciferin. Diese Kondensationsreaktion wird auch bei der chemischen Luciferinsynthese genutzt (vgl. Abbildung rechter Weg).

Eine seit kurzem diskutierte Möglichkeit geht indes davon aus, dass 2C6HB mit L-Cystein zunächst L-Luciferin bildet. Dieses wird dann über Zwischenschritte zu D-Luciferin racemisiert (vergleiche auch Abbildung linker Weg).[17]

Beide Möglichkeiten dieser Biosynthese weisen noch einige Probleme auf:

So wird das Luciferin-regenerierende Enzym in den lichtproduzierenden Organen biolumineszenter Käfer nicht überproduziert. Da Oxyluciferin in wässrigen Lösungen instabil ist, müsste man gerade dort erwarten, LRE in größeren Mengen vorzufinden. Außerdem kann das reaktive 2C6HB nicht nur mit Cystein, sondern auch mit anderen Metaboliten reagieren. Es ist ferner nicht klar, woher beispielsweise das D-Cystein stammt und wie zwischen L-Cystein und D-Cystein diskriminiert werden könnte. Aus L-Cystein reagiert 2C6HB nämlich auch zu L-Luciferin. Dieses kann zwar die Luciferase als Substrat aufnehmen, hemmt aber die Lichtreaktion.[18] Außerdem konnte man noch nicht das Enzym verifizieren, das die Racemisierung katalysiert.

Es ist darüber hinaus unklar, wie die Käfer (oder Symbionten) Benzothiazolene herstellen können.

Evolutionäre Ursprünge[Bearbeiten]

Die bevorzugten Konformationen von Arachidonsäure (oben) und Luciferin aus Leuchtkäfern (unten) zeigen Ähnlichkeiten. Beide werden durch die Luciferase mit Coenzym A umgesetzt.

Möglicherweise hat sich die Luciferin-Luciferase-Reaktion bei Leuchtkäfern aus einer ganz anderen biologischen Funktion heraus entwickelt. Es wird vermutet, dass das Luciferinmolekül erst in einem späteren evolutionären Ergebnis aufgetreten ist und zu einer Lichtreaktion geführt hatte.[9] Dafür spricht, dass die Luciferase auch effizient Coenzym A an das Luciferinmolekül kondensieren kann und somit die Funktion einer klassischen Fettsäure-CoA-Ligase erfüllt.[19] Die Luciferase kann in diesem Zusammenhang auch Fettsäuren wie beispielsweise Arachidonsäure verwenden, die ähnliche strukturelle Eigenschaften mit dem Luciferin teilt.

Aufgrund dieser zusätzlichen katalytischen Eigenschaft könnte die ursprüngliche Luciferase eine Fettsäure-CoA-Ligase gewesen sein. Durch das Auftreten des Luciferins und der damit verbundenen Lichtreaktion ergab sich ein Selektionsvorteil: Die Adenylierungsreaktion hatte sich im Laufe der Zeit durchgesetzt. Diese These wurde am nicht lumineszierenden Mehlwurm Tenebrio molitor demonstriert. Dieser besitzt kein Luciferin, aber Fettsäure-CoA-Ligasen. Interessanterweise kann durch Zugabe von Luciferin auch dort eine Lichtreaktion beobachtet werden. Aber ohne Kenntnisse darüber, wie die Biosynthese des Leuchtkäferluciferins abläuft, ist eine genauere evolutionäre Analyse schwierig.

Lumineszenz anderer Insekten[Bearbeiten]

Auch bei lumineszierenden Insekten der beiden anderen Familien Phenogodidae und Elateroidae kommt das Leuchtkäfer-Luciferin vor.[6] So ist das Biolumineszenzsystem aus Federleuchtkäfern (z. B. Phrixothrix, engl. „railroad worm“) oder Schnellkäfern (z. B. die Feuerfliege Pyrophorus noctilucus) mit denen aus Leuchtkäfern nahezu identisch. Bei den Federleuchtkäfern zeigen aber nur die Larven Biolumineszenz, die adulten Tiere nicht.

Dagegen weisen lumineszierende Zweiflügler (Diptera) (Arachnocampa oder Orfelia) keine Gemeinsamkeiten mit dem Luciferin aus Leuchtkäfern auf. Das von den Larven der nordamerikanischen Pilzmücke (Orfelia fultoni) emittierte Licht ist im Übrigen das blaueste (λmax = 460 nm), das von Insekten generiert wird.[6] Diese leben beispielsweise in den Waitomo Caves.

Dehydroluciferin[Bearbeiten]

In vitro wurde gezeigt, dass enzymgebundenes, adenyliertes D-Luciferin (D-LH2·AMP) auch in einer Dunkelreaktion umgesetzt werden kann. Hierbei reagiert dieses durch Sauerstoff zu Wasserstoffperoxid und Dehydroluciferin (L·AMP). Letzteres kann aus der Luciferase mittels Pyrophosphat freigesetzt werden, dabei entsteht ATP.

L·AMP ist ein potenter Inhibitor der Luciferase. Ob die Bildung von Dehydroluciferin auch unter physiologischen Bedingungen stattfindet, ist unbekannt. Zumindest könnte das dabei entstehende Wasserstoffperoxid (H2O2) in den Peroxisomen schnell entgiftet werden.[20]

Tetrapyrrol, das Luciferin von Dinoflagellaten und Euphausiidae[Bearbeiten]

Das Luciferin in dieser Gruppe entspricht dem chemischen Grundbau eines linearen, offenen Tetrapyrrols und findet sich unter anderem bei Dinoflagellaten (Noctiluca, Gonyaulax, Pyrocystis). Meeresleuchten, welches früher fälschlicherweise als Phosphoreszenz bezeichnet wurde, geht größtenteils auf diese einzelligen Algen zurück.[21] Die Untersuchungen des Luciferin-Luciferase Systems begannen Ende der 1950er Jahre an der Dinoflagellate Lingulodinium polyedrum (synonym: Gonyaulax polyedra) durch die Arbeiten von J. Woodland Hastings und Mitarbeitern.

Das Luciferin aus Dinoflagellaten (R = H) bzw. aus Euphausiidae (R = OH). Dort wird es als Komponente F bezeichnet.

Für die Lichtemission sind neben dem Luciferin und einer korrespondieren, ca. 135 kDa großen Luciferase (LCF) auch ein sogenanntes Luciferin-Bindeprotein (luciferin-binding protein (LBP)) notwendig.[22][23] LBD ist ein Homodimer, eine Untereinheit ist 72 kDa groß. Das Luciferin dieser Familie ist extrem instabil bei niedrigen pH-Werten (< pH 4), hohen Salz- und bereits niedrigen Sauerstoffkonzentrationen. Es konnte gezeigt werden, dass das LBD bei pH 8,0 an das Dinoflagellaten-Luciferin bindet, nicht aber bei pH 6,3.[24] Dadurch soll das Substrat bis zur Reaktion geschützt werden, die am besten bei pH 6,3 abläuft, zumal die Luciferase im leicht alkalischem Milieu (pH 8,0) inaktiv ist.[25] Für die Umsetzung des Luciferins mit Sauerstoff wurde vorgeschlagen, dass diese über mehrere Zwischenstufen über Radikale abläuft.[21] Die Reaktion selbst findet dabei in speziellen Organellen statt, die sogenannten Scintillone.[26] Diese sind im Durchschnitt 0,4 µM groß und enthalten hauptsächlich Luciferasen, Luciferine und LBPs.[10] Das Licht, das bei dieser Reaktion entsteht, erscheint blau-grünlich (Anregungsmaximum bei λmax = 390 nm, Emissionsmaximum von bei ca. λmax = 470 nm).[21] Als Lichtemitter dient ein enzymgebundenes Intermediat des zu umsetzenden Luciferins.[10]

Biolumineszenzreaktion von Dinoflagellat-Luciferin. Bei der sog. „Lichtreaktion“ (unten) wird nach Oxidation Licht freigesetzt (λmax ≈ 470 nm). Durch Autooxidation kann jedoch auch ohne Luciferase eine sogenannte „Dunkelreaktion“ (oben) ablaufen, bei der kein Lichtquant emittiert wird.[27]
Biolumineszenz von Euphausia superba, antarktischem Krill.

Es ist heute noch nicht geklärt, ob sich das Luciferin wegen seiner Verwandtschaft zu Chlorophyll a aus diesem ableitet oder erst aus mehreren Aminosäuren (Glycinen und Glutaminsäuren) schrittweise aufgebaut werden muss.[28] Außerdem ist es paradox, dass das bei der Lichtreaktion entstehende oxy-Luciferin kein Fluorophor ist.[27]

Komponente F bei Krill[Bearbeiten]

Ein Luciferin mit nahezu identischer Struktur wurde auch bei lumeszierenden Euphausiidae (Krill) gefunden, z. B. bei Meganyctiphanes norvegica oder Euphausia pacifica. Dort wird es als Komponente F bezeichnet, welches über die Nahrung aufgenommen wird.[29] Der Reaktionsmechanismus entspricht dem der Dinoflagellaten.

Flavin, ein bakterielles Luciferin[Bearbeiten]

Bakterielles Luciferin, ein reduziertes Flavinmononukleotid (Riboflavin-5-phosphat).

Lumineszierende Bakterien nutzen reduziertes Flavinmononukleotid (FMNH2, was auch als Riboflavin-5-phosphat bezeichnet wird) für eine lichtgebende Reaktion. Sie kommen entweder terrestrisch vor (Vibrio und Xenorhabdus)[30] oder frei lebend im Meer (Beneckea, Vibrio). Außerdem sind sie für die Biolumineszenz vieler leuchtender Tiefseefische verantwortlich, dort werden sie als Symbionten in speziellen Leuchtorganen (Photobacterium) gehalten. Die bisher identifizierten biolumineszierenden Bakterien sind alle Gram-negativ. Ein bekanntes Bakterium mit Biolumineszenzeigenschaft ist beispielsweise Vibrio fischeri.

Die Untersuchung der bakteriellen Biolumineszenz führte in den 1950er Jahren zu besonderen Fortschritten. Die Forscher Milton J. Cormier und Bernard L. Strehler fanden heraus, für die Biolumineszenzreaktion vier Faktoren notwendig sind: Neben dem FMNH2 wird eine Luciferase, molekularer Sauerstoff und ein langkettiger Aldehyd eines gesättigten Kohlenwasserstoffes benötigt. Der Aldehyd, Hexadecanal, wurde vor seiner chemischen Identifizierung als „kidney cortex factor“ bezeichnet, da der Aldehyd aus der Nebennierenrinde von Schweinen isoliert wurde. Für die Lichtreaktion können auch andere Aldehyde verwendet werden, beispielsweise Decanal oder Dodecanal. Folgende Tabelle gibt die Zusammensetzung aus 40 g isolierter Bakterien wieder. Es wird angenommen, dass hauptsächlich Tetradecanal umgesetzt wird.

Aldehyd P. phosphoreum A. fischerii
10C-Atome (Decanal) < 1 nmol < 1 nmol
11C-Atome < 1 nmol < 1 nmol
12C-Atome (Dodecanal) 30 nmol 32 nmol
13C-Atome 6 nmol 2 nmol
14C-Atome (Tetradecanal) 380 nmol 29 nmol
15C-Atome 6 nmol 6 nmol
16C-Atome (Hexadecanal) 180 nmol 18 nmol
17C-Atome < 1 nmol 2 nmol
18C-Atome < 1 nmol < 1 nmol

FMNH2 und der Aldehyd werden sauerstoffabhängig zu FMN und einer Carbonsäure umgesetzt, gemäß (vgl. auch Abbildung):

\mathrm{FMNH_2 + O_2 + R\text{-}CHO \longrightarrow FMN + H_2O + R\text{-}COOH + h\nu}

Diese Reaktion katalysiert eine bakterielle Luciferase, eine Flavin-abhängige Monooxygenase. Da diese gleichzeitig den Aldehyd zur Carbonsäure oxidiert, handelt es sich um eine Oxidase mit gemischter Funktion. In allen lumineszierenden Bakterien ist die Luciferase ein Heterodimer mit 76±4 kDa Größe. Sie setzt sich aus einer α- und β-Protein-Untereinheit (40–42 kDa bzw. 37–39 kDa) zusammen, die getrennt kaum Aktivität zeigen.[31] Das katalytische Zentrum befindet sich wahrscheinlich in der α-Untereinheit. Die Luciferase ist bei pH-Werten zwischen 6,0–8,5 (Photobacterium phosphorerum, V. fischeri) bzw. 6,0–9,5 (Benecka harveyi) aktiv, jedoch nicht bei Temperaturen über 30–35 °C.[30] Eine Kristallstruktur der Luciferase aus Vibrio harveyi wurde mit einer Auflösung von 150 pm gelöst.[32]

Umsetzung von bakteriellem Luciferin (FMNH2) unter Verbrauch von Tetradecanal, einem langkettigen Aldehyd. R: D-Riboserest, der am 5’-C-Atom phosphoryliert ist.

FMNH2 in freier Lösung ist instabil und oxidiert leicht. Enzymgebunden jedoch erhöht sich dessen Stabilität und wird durch Sauerstoff an Position C4a nukleophil angegriffen. Dabei entsteht ein 4a-Hydroperoxid, welches ungewöhnlich stabil vorliegt.[30] Dieses reagiert mit dem Aldehyd zu einem Peroxyhemiacetal, was schließlich zur Fettsäure und einem 4a-Hydroxyflavin zerfällt. Letzteres ist in einem angeregten Zustand und fällt unter Lichtabgabe in den Grundzustand zurück. Damit ist das 4a-Hydroxyflavin der eigentliche Lichtemitter. Im Grundzustand wird dieses zu FMN hydrolysiert.

Leuchtorgane des Tiefseefisches Photostomias guernei (hinter dem Auge).

Bei der durch die Luciferase katalysierten Reaktion wird blau-grünes Licht emittiert, das in vitro ein Emissionsmaximum bei ca. λmax = 490 nm hat. In vivo wurden indes Wellenlängenmaxima von 472 nm bis 545 nm beobachtet. Der Grund dafür ist die Übertragung der Anregungsenergie auf fluoreszierende Proteine via FRET.[30] Es wurde zwei Klassen an fluoreszierenden Proteinen identifiziert: blaufluoreszierende Lumazinproteine (LumPs) mit Lumazin als Chromophor (P. phosphoreum, P. fischeri). Alternativ bilden die gelbfluoreszierenden Proteine (YFPs) die zweite Klasse, die als Chromophor FMN oder Riboflavin aufweisen (P. fischeri Stamm Y-1). Mit den LumPs verschiebt sich das Emissionsmaximum von 490 nm nach 476 nm, bei YFPs von 484 nm nach 534 nm. Für eine Energieübertragung gemäß FRET muss der Luciferin-Luciferase-Komplex an den jeweiligen fluoreszierenden Proteinen gebunden sein. Die Quantenausbeute liegt bei 0,10–0,16.[30]

Das FMNH2 für die Biolumineszenzreaktion wird durch eine Riboflavinkinase unter ATP-Verbrauch aus Riboflavin (Vitamin B2) gewonnen. Nach der Reaktion wird FMNH2 aber aus FMN regeneriert, was eine Flavinreduktase[33] unter NAD(P)H-Verbrauch katalysiert. Da die Menge vorkommender Aldehyde in der Bakterienzelle (vgl. Tabelle oben) nur für eine sehr kurze Biolumineszenz reicht, werden die Aldehyde ständig regeneriert.[30] Hierbei wird das langkettige Aldehyd aus der bei der Reaktion entstandenen Fettsäure zurückgewonnen, was im sogenannten Fettsäure-Reduktase-Komplex[34] unter Verbrauch von ATP und NAD(P)H katalysiert wird.

Die Biolumineszenzreaktion verbraucht viel Energie, da für die Regenerierung der Komponenten bereits zwei Moleküle NAD(P)H und ein Molekül ATP benötigt werden. Infolgedessen muss diese Lichtreaktion entsprechend kontrolliert werden.[31] Zudem haben Flavinreduktasen eine höhere Wechselzahl als die Luciferase. Bei einer unkontrollierten Aktivität wird zu viel FMNH2 produziert. Durch dessen schnelle Oxidation (vgl. oben) würde somit viel NAD(P)H verschwendet werden. Dies betont die Notwendigkeit einer Regulation.

Lux-Gene[Bearbeiten]

Alle Proteine, die etwas mit der Biolumineszenzreaktion zu tun haben, werden durch sogenannte lux-Gene kodiert (lat. lux Licht). Die Untereinheiten der Luciferase werden von den luxA bzw. luxB-Genen kodiert, wobei das luxB-Gen wahrscheinlich durch Genduplikation aus dem luxA-Gen entstanden ist.[27] LuxA und LuxB wurden bereits erfolgreich als Marker kloniert. LuxC,D und E kodieren für den Fettsäurereduktasekomplex.

Coelenterazin, die gemeinsame chemische Komponente vieler biolumineszenter Meeresorganismen[Bearbeiten]

Strukturformel von Coelenterazin.

Durch die Arbeiten von Milton J. Cormier an der Seefedernart Renilla reniformis und von Frank H. Johnson an der Qualle A. victoria wurde das Luciferin Coelenterazin entdeckt. Dieses ist unter biolumineszenten Meeresorganismen sehr weit verbreitet, beispielsweise bei Vertretern der Nesseltiere (Cnidaria) Rippenquallen (Ctenophora), Weichtiere (Molusca), Gliederfüßer (Atropoda) und Chordatiere (Chordata).[35][36][37] Coelenteratzine wurde aber nicht in terrestrischen Lebewesen oder Ringelwürmern (Annelida) entdeckt. Manchmal kommen sie auch in geringen Mengen in nicht-biolumineszenten Organismen vor, wie beispielsweise im Feuerschwamm Microcina prolifera. Dieser enthält auch keine Luciferase.

Coelenetrazin weist eine Aminopyrazingrundstruktur auf und liegt als lichtgebende Komponente als bona fide Luciferin vor. Häufig ist es auch als Chromophor gebunden in Photoproteinen wie z. B. Aequorin, Obelin oder Symplectin. Auch Derivate von Coelenterazin werden von zahlreichen marinen Lebewesen genutzt.

Allgemeine Umsetzung eines Celentreazins durch eine korrespondierende Luciferase zu einem Coelenteramid.

Unmodifiziert ist Coelenterazin kaum in neutral-wässrigen Lösungen stabil, dort oxidiert es leicht durch Luftsauerstoff. In Methanol liegt es stabiler vor. Dort fluoresziert es gelblich (ε = 9800 M−1·cm−1, λmax = 435 nm). Allgemein reagieren Coelenterazine mit Sauerstoff zu Coelenteramiden. Hierbei tritt eine Decarboxylierung ein, es bildet sich das Anion eines Coelenteramides. Dieses ist auch der Lichtemitter, so dass allgemein blaues Licht emittiert wird. Diese Reaktion kann biokatalysiert werden (Biolumineszenz), findet aber auch spontan statt (Chemolumineszenz). Die biolumineszente Reaktion wird im folgenden Absatz erläutert.

Mechanismus[Bearbeiten]

Mechanismus der Biolumineszenz von Aequorin.

1962 wurde das Photoprotein Aequorin aus Aequorea victoria isoliert und dabei 1974 Coelenterazin als das Luciferin identifiziert.[38][39] Wie nun die biochemischen Mechanismen für das Luciferin-Luciferase-System mit Imidazolpryazinen ablaufen, wurde 2000 anhand von A. victoria gezeigt.[40] Hierbei spielt das Aequorin eine wesentliche Rolle. Aequorin ist ein kleines Photoprotein und befindet sich am Rand des Schirmes in der Qualle. Bei Aequorin ist das Luciferin (Coelenterazin) bereits durch eine Peroxidbrücke mit dem Proteinteil verbunden. Infolgedessen führt das Photoprotein bereits das oxidierende Agens O2 mit sich. In enzymgebundener Form kann Coelenterazin so auch längere Zeit aufbewahrt werden. Aequorin besitzt drei Bindestellen für Calciumionen. Wenn Calciumionen daran binden, ändert sich die Konformation des Proteins derart, dass eine intramolekulare Reaktion mit dem Coelenterazin ausgelöst wird. Dieses reagiert zunächst zu einem instabilen Dioxetanonring, so dass nach Abspaltung von CO2 schließlich das Anion von Coelenteramid entsteht. Nach Relaxation in den Grundzustand wird ein Lichtquant mit einer Wellenlänge von λmax = 465 nm emittiert. Wegen dieses blauen Leuchtens wird das Protein auch als das blaufluoreszierende Protein (blue fluorescent protein) (BFP)[41] bezeichnet. Das Photoprotein wird in Anwesenheit von Coelenterazin und molekularem Sauerstoff schließlich regeneriert.

Aequorea victoria fluoresziert aber nicht blau, sondern grün. Das liegt daran, dass das blau fluoreszierende Protein die Energie der Biolumineszenzreaktion strahlungslos auf das sogenannte grün fluoreszierende Protein (GFP) überträgt.

Watasenia-Luciferin[Bearbeiten]

Der biolumineszente Tiefseetintenfisch Watasenia scintillans wurde erstmals 1905 beschrieben (damals noch als Abraliopsis scintillans).[42] Er besitzt zahlreiche Photophore am gesamten Körper, die bläulich wie ein Sternenhimmel leuchten. Für die Biolumineszenzreaktion ist ein modifiziertes Coelenterazin nötig. Dieses ist ein Disulfat von Coelenterazin und wurde 1976 aus der Leber des Tintenfisches isoliert.[43] Es wird als Watasenia-Luciferin bezeichnet. In neutral wässrigen Lösungen ist es instabil und neigt zur Autooxidation (Chemolumineszenz), was insbesondere durch Anwesenheit durch Wasserstoffperoxid und Eisen(II)-ionen induziert wird. In wässrigen Lösungen ist das Luciferin stark fluoreszierend (λmax = 400 nm).[44]

Das Watasenia-Luciferin wird durch eine noch nicht isolierte, membrangebundene Luciferase umgesetzt, in dessen Folge blaues Licht emittiert wird (λmax = 470 nm). Die Reaktion hat ein pH Optimum bei 8,8 und benötigt neben molekularem Sauerstoff ATP und Mg2+.[45] Für den Reaktionsmechanismus wurde vorgeschlagen, dass das Luciferin mittels ATP adenyliert wird, damit dieses an die Luciferase binden kann. Der weitere Reaktionsverlauf beinhaltet die Bildung eines Dioxetanonringes und schließlich die des Coelenteramidanions, so wie oben allgemein dargestellt.[44] Es entsteht dabei Licht zwischen 400 bis 580 nm (λmax = 470 nm).[46]

Vargula-Luciferin[Bearbeiten]

Das Luciferin aus Vargula hilgendorfii, auch als Vargula- bzw. Cypridina-Luciferin bekannt, besteht aus einer Tryptophan- (A), einer Arginin- (B) sowie einer Isoleucineinheit (C).

Die Muschelkrebse der Art Vargula hilgendorfii (auch als Cypridina hilgendorfii bezeichnet) scheiden eine lumineszierende Flüssigkeit ins Meerwasser aus, falls diese sich bedroht fühlen. Biochemische Untersuchungen über das bei in diesen Muschelkrebsen enthaltene Luciferase-Luciferin-System wurden Anfang des 20. Jahrhunderts von Harvey eingeleitet. Inzwischen ist es genau untersucht.

Das Luciferin, Vargulin, wurde 1957 isoliert und 1966 als Imidazolpryazinkomponente identifiziert. Es ist in Wasser, Methanol und alkoholischen Lösungsmitteln löslich. Vargulin hat in neutralen Lösungen eine gelbe Farbe und zeigt in Methanol ein Absorptionsmaximum bei λmax = 432 nm mit einem molaren Extinktionskoeffizienten von ε = 9000  M−1·cm−1. In wässrigen Lösungen ist es zudem leicht fluoreszierend (Anregungsmaximum bei λmax = 540 nm). Vargulin ist sehr instabil und wird besonders durch Luftsauerstoff, aber auch Blei(IV)-oxid, oxidiert. Dabei kann auch Licht ausgesendet werden, so dass hier – besonders in organischen Lösungsmitteln wie Diglym – eine Chemolumineszenzreaktion vorliegt.

In den Muschelkrebsen wird Vargulin durch eine Luciferase zum Coelenteramid, dem Oxyluciferin, umgesetzt, wobei blaues Licht freigesetzt wird (λmax = 463 nm). Die Luciferase ist 60–70 kDa großes Monomer mit 555 Aminosäuren. Es weist viele Cysteine auf und ist ein saures Protein (isoelektrischer Punkt von 4,35).

Etioluciferin, ein Hydrolyseprodukt aus Vargulin. Dabei wird aber kein Licht erzeugt.

Bei der Biolumineszenzreaktion wird Vargulin an die Luciferase gebunden und am C2-Atom oxygeniert. Dabei entsteht ein Peroxidanion, welches zum Dioxetanonring zyklisiert. Dieses decarboxyliert spontan und bildet das Anion des Coelenteramids, was in einem angeregten Zustand vorliegt. Nach Aussendung eines Lichtquants fällt dieses wieder in den Grundzustand zurück, Oxyluciferin wird freigesetzt. Der Lichtemitter der Reaktion ist das an der Luciferase gebundene Oxyluciferin. Die Quantenausbeute ist temperatur- und pH-Wert-abhängig und liegt bei Q = 0,30.[47] Als Nebenreaktion entsteht zu 10 bis 15 % auch Etioluciferin, dabei wird aber kein Licht ausgestrahlt.

Bereits 1966 wurde vermutet, dass jenes Luciferin aus L-Arginin, L-Isoleucin und L-Tryptophan aufgebaut wird. Hierfür gibt es mittlerweile immer mehr Hinweise.[48][49]

Dehydrocoelenterazin aus Symplectoteuthis oualaniensis[Bearbeiten]

Dehydrocoelenterazin, was in manchen Tintenfischen als Luciferin verwendet wird.

Symplectoteuthis oualaniensis (japanischer Name Tobi-ika) ist ein im Pazifik und Indischen Ozean weit verbreiteter Tintenfisch. Die erste Studie über seine Biolumineszenz wurde 1981 veröffentlicht.[50] Der Tintenfisch setzt Dehydrocoelenterazin durch ein spezielles Photoprotein um, was als „Symplectin“ bezeichnet wird. Dort liegt es wie bei andere Photoproteinen (Aequorin, Obelin) als Chromophor über ein Cystein kovalent gebunden vor. Das bei der Umsetzung emittierte Licht ist bläulich, es wurden verschiedene Emissionsmaxima λmax angegeben (456 nm, 470 nm, 480 nm). Gebundenes Dehydrocoelenterazin wird an der C2-Position oxygeniert, nach der Biolumenszenzreaktion entsteht Coelenteramid und Apo-„Symplectin“. Letzteres wird durch ein Molekül Dehydrocoelenterazin wieder zu „Symplectin“ regeneriert.

Der nahe verwandte Tintenfisch Symplectoteuthis luminosa (japanischer Name Suji-ika) zeigt auch eine Biolumineszenz. Die involvierten chemischen Komponenten und der Mechanismus der Biolumineszenzreaktion ähneln bzw. gleichen denen von S. oualaniensis. Aus der Leber des Tintenfisches können größere Mengen an Dehydrocoelenterazin isoliert werden.

Nicht klassische Luciferin-Luciferase-Systeme[Bearbeiten]

Das Latia-Luciferin[Bearbeiten]

Das bei der Süßwasserschnecke Neuseelands (Latia neritoides) vorkommende Luciferin[51] ist ein terpenoides Aldehyd und wird als Latia-Luciferin bezeichnet.[52][53] Das Luciferin ist stark hydrophob, fettlöslich und eine farblose Flüssigkeit. Sein Absorptionsmaximum liegt bei λmax = 207 nm, der molare Extinktionskoeffizient bei 13,700 M−1.[54] Da es instabil ist, kann es spontan zu Ameisensäure und einem Aldehyd hydrolysieren. Für die Biolumineszenzreaktion ist letzterer jedoch nicht aktiv. Falls die Enol-Formylgruppe durch eine Enol-Ethergruppe ersetzt wird, ist das Luciferin ebenso nicht mehr aktiv.

Das Latia-Luciferin wird katalytisch zu einem Keton (oxy-Luciferin) umgesetzt, was durch eine 173 kDa große, farblose und nichtfluoreszierende Luciferase (EC 1.14.99.21) katalysiert wird.[55] Es ist ein Homohexamer, die einzelnen Untereinheiten sind ca. 30 kDa groß.[54]

Für die Reaktion wird neben dem Luciferin, der Luciferase und Sauerstoff auch ein Cofaktor benötigt, das 39 kDa große purple protein (purpurfarbenes Protein).[52][53] Dieses ist rot fluoreszierend und scheint eine Art Aktivator für die Biolumineszenzreaktion zu sein.[54] Es ist für diese aber nicht unbedingt nötig[55], da es beispielsweise durch Ascorbat und NADH ersetzt werden kann. Auch ohne purpurfarbenes Protein kann die Biolumineszenzreaktion ablaufen. Bei der Reaktion entstehen aus einem Molekül Luciferin, Sauerstoff und Wasser jeweils ein oxidiertes Molekül Luciferin und zwei Moleküle Ameisensäure:

\mathrm{Ln + O_2 + H_2O \longrightarrow ox\text{-}Ln + 2\ HCOOH + h\nu}

Dabei wird Licht freigesetzt, dessen Emissionsmaximum bei λmax = 536 nm liegt.[56] Daher erscheint der Schleim der Schnecke, der z. B. nach mechanischen Reizen abgesondert wird, hellgrün zu lumineszieren. Die Reaktionseffizienz dieser Biolumineszenzreaktion ist sehr gering, da die Quantenausbeute Q bei ca. 0,003 (25 °C) bzw. 0,0068 (8 °C) liegt.[55][54] Um die Quantenausbeute zu erhöhen, kann man der Reaktion NADH (0,25 mM) und Ascorbat (1 mM) zusetzen, so dass diese auf 0,009 (25 °C) steigt. Hierbei entstehen jedoch andere Reaktionsprodukte, was durch folgende Gleichung dargestellt wird:

\mathrm{Ln + 2\ O_2 + XH_2 \xrightarrow{NADH, Ascorbat} ox\text{-}Ln + HCOOH + CO_2 + X + H_2O + h\nu}

Ob bei den Reaktionen als Intermediat ein Dioxetanring gebildet wird, wird noch diskutiert. Das entstehende oxy-Luciferin ist aber im Gegensatz zu oxy-Luciferin des Leuchtkäfers kein Fluorophor. Es wird vermutet, dass die bei dieser Reaktion freiwerdende Energie auf den eigentlichen Emitter übertragen wird, einem proteingebundenen Flavin bzw. einer Flavin-ähnlichen Gruppe.[55][57]

Luciferinreaktion des Luciferins von Latia neritoides. Die reduzierende Komponente X sowie der eigentliche Lichtemitter der Reaktion müssen noch identifiziert werden.

Luciferin aus Diplocardia longa[Bearbeiten]

Das Luciferin des Wurmes Diplocardia longa ist ein einfacher Aldehyd, das N-Isovaleryl-3-aminopropanal. Dieses ist löslich in polaren Lösungsmittel (Methanol, Ethanol, Aceton, Methylacetat), jedoch nicht in unpolaren Lösungsmitteln wie Hexan oder Tetrachlormethan.[58] Das Besondere bei der Biolumineszenzreaktion ist die Tatsache, dass Wasserstoffperoxid an Stelle von molekularen Sauerstoff benötigt wird. Die korrespondierende Luciferase, eine etwa 300 kD großes, stark asymmetrisches Enzym, setzt dann die aktivierte Form, ein Peroxid-Addukt, um. Die Luciferase benötigt wahrscheinlich Kupfer, es wird blau-grünes Licht emittiert (l max = 507 nm). Man weiß jedoch nicht, welchen Zweck die Biolumineszenz bei Würmern generell haben kann.[59][60] Auch hier muss der eigentliche Emitter der Biolumineszenzreaktion noch identifiziert werden.

Die Quantenausbeute dieser Reaktion ist mit Q = 0,002 sehr gering.[58]

Im Gegensatz zu den meisten Luciferinen wird das Luciferin des Wurmes Diplocardia longa mittels Wasserstoffperoxid oxidiert und dann durch die Luciferase umgesetzt, in Ab- oder Anwesenheit von Sauerstoff.

Anwendungen[Bearbeiten]

Diagnostik[Bearbeiten]

Mit Hilfe des Luciferin-Luciferase-System aus Leuchtkäfern kann die Anwesenheit von ATP in Proben schnell überprüft werden.[61] Dies nutzt man beispielsweise in der Lebensmittelindustrie aus, um bakterielle Kontaminationen zu detektieren.[62] ATP kommt nur bei lebenden Organismen vor, welches bei Lebensmittel durch die Biolumineszenzreaktion nachgewiesen werden kann.

Da die Lichtreaktion Aequorins von Calciumionen abhängig ist, kann durch dieses System die Konzentration an Calciumionen gemessen werden. Die erste Anwendung datiert sich auf 1967, als man mit Hilfe von Aequorins intrazelluläre Änderungen der Calciumkonzentrationen in Muskelzellen detektiert hat. Nach Klonierung von Aequorin in Bakterien konnte man die Calciumkonzentration bakteriellen Zytosols messen.[63] Außerdem ist es möglich, Aequorin in eukaryontische Zellen klonieren.[64] So konnte man beispielsweise bei transgenen Pflanzen die Änderung der cytosolischen Calciumkonzentration nach Berühren der Pflanze oder nach einem Kälteschock messen.[65]

Gentechnik/ Biotechnologie[Bearbeiten]

Luciferasen werden in der Molekularbiologie oft als Marker eingesetzt: Organismen, die das Gen erhalten und in ihr Genom eingebaut haben, leuchten bei Zufuhr von Luciferin. So könnte man beispielsweise nachweisen, ob Gene, die man in Organismen einbringen möchte, auch wirklich exprimiert werden. Dafür wird einfach das zu exprimierende Gen mit dem einem Gen gekoppelt, das für eine Luciferase kodiert. Durch solch ein Reportergen kann man auch Promotorregionen im Genom identifizieren. Kommerziell genutzt werden meist die Luciferase-Gene von Photinus pyralis und Renilla reniformis. Dabei kommen beide Enzyme häufig im selben Ansatz zur Verwendung ("Dual-luciferase-assay").[66][67][68]

Außerdem ist es möglich, durch die Lichtreaktion Protein-Protein-Interaktionen, Signale bei Signaltransduktionsprozessen und die Aktivität von zellulären Rezeptoren zu messen.[20]

Für lebende tierische Modellorganismen (Bioimaging) wurde die Verwendung von Luciferasereportern auch etabliert. Im Bereich der Krebsforschung kann mit Hilfe von Markern das Wachstum von Tumoren oder die Bildung von Metastasen verfolgt werden.[69] Außerdem kann an lebenden Tieren die Proteinexpression durch Luciferase-Luciferin-Systemen visualisiert werden.[70]

Literatur[Bearbeiten]

  • Osamu Shimomura: Bioluminescence: Chemical Principles and Methods. Word Scientific Publishing Company 2006; ISBN 981-256-801-8.
  • T. Wilson and JW. Hastings (1998): Bioluminscence, in: Annu. Rev. Cell Dev., 14; 197–230; PMID 9891783.
  • Greer III., LF. und Szalay, AA. (2002): Imaging of light emission from the expression of luciferases in living cells and organisms: a review, in: Luminescence, 17, 43–74; PMID 11816060; doi:10.1002/bio.676.
  • K. Teranishi (2007): Luminescence of imidazo[1,2-a]pyrazin-3(7H)-one compounds, in: Bioorg Chem., 35(1); 82–111; PMID 17007903.

Einzelnachweise[Bearbeiten]

  1.  Waldemar Adam: Biologisches Licht. In: Chemie in unserer Zeit. 7, Nr. 6, 1973, ISSN 0009-2851, S. 182–192, doi:10.1002/ciuz.19730070605.
  2. Harvey, EN. Bioluminescence. Academic, New York 1952.
  3. Hastings, JW. Bioluminescence. (N. Sperelakis, ed.)., in: Cell Physiology, Dritte Edition, Academic Press, NY., 1115–1131.
  4. Herring PJ. (1987): Systematic distribution of bioluminescence in living organisms, in: J Biolumin Chemilumin, 1 (3); 147–163; PMID 3503524.
  5. E. H. White et al.: The chemi- and bioluminescence of firefly luciferin: an efficient chemical production of electronically excited states. In: Bioorg. Chem. Bd. 1, Nr. 1–2, 1971, S. 92–122, doi:10.1016/0045-2068(71)90009-5.
  6. a b c d Osamu Shimomura, S. 1ff.
  7. Keller, GA. et al. (1987): Firefly luciferase is targeted to peroxisomes in mammalian cells, in: Proc Natl Acad Sci USA, 84 (10): 3264–3268; PMID 3554235; PMC 304849 (freier Volltext, PDF).
  8. Fraga, H. (2008): Firefly luminescence: a historical perspective and recent developments. In: Photochem Photobiol Sci. 7(2); 146–158; PMID 18264582; doi:10.1039/b719181b.
  9. a b Day, JC. et al. (2004): Evolution of beetle bioluminescence: the origin of beetle luciferin. In: Luminescence, 19(1); 8–20; PMID 14981641; doi:10.1002/bio.749.
  10. a b c Hastings JW. (1996): Chemistries and colors of bioluminescent reactions: a review. In: Gene, 173(1 Spec No); 5–11; PMID 8707056; doi:10.1016/0378-1119(95)00676-1.
  11. Shimomura, O. et al. (1977): Source of oxygen in the CO2 produced in the bioluminescent oxidation of firefly luciferin. In: Proc Natl Acad Sci USA, 74(7); 2799–2802; PMID 16592418; PMC 431296 (freier Volltext, PDF).
  12. DeLuca, M. und Dempsey, ME. (1970): Mechanism of oxidation in firefly luminescence. In: Biochem Biophys Res Commun, 40(1); 117–122; PMID 5456946; doi:10.1016/0006-291X(70)91054-5.
  13. Tsuji, FI. et al. (1977): Mechanism of the enzyme-catalyzed oxidation of Cypridina and firefly luciferins studied by means of 17O2 and H218O. In: Biochem Biophys Res Commun, 74(2); 606–613; PMID 836314; doi:10.1016/0006-291X(77)90346-1.
  14. Ando, Y. et al. (2008): Firefly bioluminescence quantum yield and colour change by pH-sensitive green emission, in: Nat. Photonics 2; 44–47; doi:10.1038/nphoton.2007.251.
  15. Eisner T. et al. (1997): Firefly »femmes fatales« acquire defensive steroids (lucibufagins) from their firefly prey, in: Proc Natl Acad Sci USA, 94 (18), 9723–9728; PMID 9275191; PMC 23257 (freier Volltext, PDF).
  16. Gomi K. und Kajiyama N. (2001): Oxyluciferin, a luminescence product of firefly luciferase, is enzymatically regenerated into luciferin, in: J Biol Chem, 276 (39); 36508–36513; PMID 11457857; PDF (freier Volltextzugriff, engl.)
  17. Niwa, K. et al. (2006): Stereoisomeric bio-inversion key to biosynthesis of firefly D-luciferin, in: FEBS Lett, 580 (22); 5283–5287; PMID 16979628; PDF (freier Volltextzugriff, engl.)
  18. Lembert N. (1996): Firefly luciferase can use L-luciferin to produce light, in: Biochem J, 317 (Pt 1); 273–277; PMID 8694774; PMC 1217473 (freier Volltext, PDF).
  19. Oba, Y. et al. (2003): Firefly luciferase is a bifunctional enzyme: ATP-dependent monooxygenase and a long chain fatty acyl-CoA synthetase. In: FEBS Lett, 540(1–3); 251–254; PMID 12681517; PDF (freier Volltextzugriff, engl.)
  20. a b Marques, SM. und Esteves, da Silva JC. (2009): Firefly bioluminescence: a mechanistic approach of luciferase catalyzed reactions. In: IUBMB Life, 61(1):6–17; PMID 18949818; doi:10.1002/iub.134.
  21. a b c Osamu Shimomura, S. 249ff.
  22. Morse, D. et al. (1989): Role of a luciferin-binding protein in the circadian bioluminescent reaction of Gonyaulax polyedra, in: J Biol Chem, 264 (20), 11822–11826; PMID 2745419; PDF (freier Volltextzugriff, engl.)
  23. Morse, D. und Mittag, M. (2000): Dinoflagellate luciferin-binding protein, in: Methods Enzymol, 305, 258–276; PMID 10812606.
  24. Fogel, M. und Hastings, JW. (1971): A substrate-binding protein in the Gonyaulax bioluminescence reaction, in: Arch Biochem Biophys, 142(1): 310–321; PMID 5545485.
  25. Schultz, LW. et al. (2005): Crystal structure of a pH-regulated luciferase catalyzing the bioluminescent oxidation of an open tetrapyrrole, in: Proc Natl Acad Sci USA, 102(5): 1378–1383; PMID 15665092; PDF (freier Volltextzugriff, engl.).
  26. Fogel M und Hastings JW. (1972): Bioluminescence: mechanism and mode of control of scintillon activity, in: Proc Natl Acad Sci USA, 69(3):690–369; PMID 4501583; PMC 426536 (freier Volltext, PDF).
  27. a b c T. Wilson and JW. Hastings (1998): Bioluminscence, in: Annu. Rev. Cell Dev., 14; 197–230; PMID 9891783.
  28. Wu, C. et al. (2003): Tracer studies on dinoflagellate luciferin with [15N]-glycine and [15N]-l-glutamic acid in the dinoflagellate Pyrocystis lunula, in: Tetrahedron Letters, 44(6); 1263–1266; doi:10.1016/S0040-4039(02)02815-0.
  29. Greer III., LF. und Szalay, AA. (2002): Imaging of light emission from the expression of luciferases in living cells and organisms: a review, in: Luminescence, 17, 43–74; PMID 11816060; doi:10.1002/bio.676.
  30. a b c d e f Osamu Shimomura, S. 30ff.
  31. a b Tu, SC. (2008): Activity coupling and complex formation between bacterial luciferase and flavin reductases. In: Photochem Photobiol Sci, 7(2); 183–188; PMID 18264585; doi:10.1039/b713462b
  32. Fisher, AJ. et al. (1996): The 1.5-A resolution crystal structure of bacterial luciferase in low salt conditions. In: J Biol Chem, 271(36); 21956–21968; PMID 8703001; PDF (freier Volltextzugriff, engl.)
  33. Duane, W. und Hastings, JW. (1975): Flavin mononucleotide reductase of luminous bacteria, in: Mol Cell Biochem. 6(1); 53–64; PMID 47604.
  34. Rodriguez A. et al. (1983): Purification of the acyl coenzyme A reductase component from a complex responsible for the reduction of fatty acids in bioluminescent bacteria. Properties and acyltransferase activity, in: J Biol Chem, 258(8); 5233–5237; PMID 6833298; PDF (freier Volltextzugriff, engl.)
  35. Shimomura, O. et al. (1980): Widespread occurrence of coelenterazine in marine bioluminescence, in: Comp. Biochem. Physiol., 65B, 435–437(doi:10.1016/0305-0491(80)90044-9).
  36. Campbell, AK. und Herring, PJ. (1990): Imidazolopyrazine bioluminescence in copepods and other marine organisms, in: Mar. Biol. 104(2); 219–225; doi:10.1007/BF01313261.
  37. Shimomura, O. (1987): Presence of coelenterazine in non-bioluminescent marine organisms, in: Comp Biochem Physiol, 86B (1987); 361–363 (doi:10.1016/0305-0491(87)90306-3).
  38. Shimomura, O. et al. (1963): Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea, in: J Cell Comp Physiol, 59; 223–239; PMID 13911999.
  39. Shimomura, O. et al. (1974): Mechanism of the luminescent intramolecular reaction of aequorin, in: Biochemistry, 13(16); 3278–3286; PMID 4152180.
  40. Head JF. et al. (2000): The crystal structure of the photoprotein aequorin at 2.3 Å resolution, in: Nature, 405 (6784); 291–293; PMID 10830969; PDF (freier Volltextzugriff, engl.)
  41. Shimomura, O. und Johnson, FH. (1970): Calcium binding, quantum yield, and emitting molecule in aequorin bioluminescence, in: Nature, 227 (5265); 1356–1357; PMID 4393938.
  42. S. Watasé (1905): The luminous organ of firefly squid, in: Dobutsugaku Zasshi, 17, 119–123 (Jap.)
  43. Inoue, S. et al. (1976): Squid bioluminescence III. Isolation and structure of Watasenia luciferin. In: Tetrahedron Lett, 17(34); 2971–2972; doi:10.1016/S0040-4039(01)85503-9.
  44. a b Osamu Shimomura, S. 200ff.
  45. Tsuji, FI. (1985): ATP-dependent bioluminescence in the firefly squid, Watasenia scintillans. In: Proc Natl Acad Sci USA, 82(14); 4629–4632; PMID 16593580; PMC 390439 (freier Volltext, PDF).
  46. Tsuji FI. (2005): Role of molecular oxygen in the bioluminescence of the firefly squid, Watasenia scintillans, in: Biochem Biophys Res Commun, 338(1): 250–253; PMID 16165097.
  47. Johnson, FH. und Shimomura, O. (1972): Enzymatic and nonenzymatic bioluminescence, in: Photophysiology, (7); 275–334; PMID 4376836.
  48. Kato, S. et al. (2004): Identification of the biosynthetic units of Cypridina luciferin in Cypridina (Vargula) hilgendorfii by LC/ESI-TOF-MS, in: Tetrahedron 60(50); 11427–11434; doi:10.1016/j.tet.2004.09.080.
  49. Kato S. et al. (2006): Stereoselective incorporation of isoleucine into Cypridina luciferin in Cypridina hilgendorfii (Vargula hilgendorfii), in: Biosci Biotechnol Biochem, 70(6); 1528–1532; PMID 16794342; doi:10.1271/bbb.60066; PDF (freier Volltextzugriff, engl.)
  50. Tsuji, FI. und Leisman, GB. (1981): K/Na-triggered bioluminescence in the oceanic squid Symplectoteuthis oualaniensis. In: Proc Natl Acad Sci USA, 78(11); 6719–6723; PMID 16593119; PMC 349121 (freier Volltext, PDF).
  51. PubChem 5280505 (Latia-Luciferin).
  52. a b Shimomura, O. und Johnson, FH. (1968): The structure of Latia luciferin, in: Biochemistry 7(5): 1734–1738; PMID 5650377.
  53. a b Shimomura, O. et al. (1972): Reactions Involved in Bioluminescence Systems of Limpet (Latia neritoides) and Luminous Bacteria, in: Proc Natl Acad Sci USA, 69 (8), 2086–2089; PMID 4506078; PMC 426874 (freier Volltext, PDF).
  54. a b c d Osamu Shimomura, S. 182ff.
  55. a b c d Ohmiya, Y. et al. (2005): Bioluminescence in the Limpet-Like Snail, Latia neritoides, in: Bull. Chem. Soc. Jpn., 78 (7); 1197–1205; doi:10.1246/bcsj.78.1197.
  56. Nakamura, M. et al. (2004): Synthesis of Latia luciferin benzoate analogues and their bioluminescent activity, in: Tetrahedron Letters, 45 (10), 2203–2205, doi:10.1016/j.tetlet.2004.01.027.
  57. Vadim R. Viviani: The Biological and Biochemical Diversity of Terrestrial Bioluminescence.
  58. a b Osamu Shimomura, S. 238ff.
  59. Rudie, NG. et al. (1976): Purification and properties of luciferin from the bioluminescent earthworm, Diplocardia longa, in: Photochem Photobiol, 23 (1): 71–75; PMID 1265130.
  60. Rudie, NG. et al. (1981): Earthworm bioluminescence: characterization of high specific activity Diplocardia longa luciferase and the reaction it catalyzes, in: Biochemistry, 20 (2): 344–350; PMID 6258637.
  61. Neufeld HA. et al. (1975): A rapid method for determining ATP by the firefly luciferin-luciferase system, in: Experientia, 31 (3), 391–392; PMID 1116561.
  62. Hawronskyj, J.-M. und Holah, J. (1997): ATP: a universal hygiene monitor. In: Trends Food Sci. Tech., 8; 79–84; doi:10.1016/S0924-2244(97)01009-1.
  63. Knight, MR. et al. (1991): Recombinant aequorin as a probe for cytosolic free Ca2+ in Escherichia coli, in: FEBS Lett., 282 (2); 405–408; PMID 2037058; PDF (freier Volltextzugriff, engl.)
  64. Kendall, JM et al. (1992): Targeting aequorin to the endoplasmic reticulum of living cells., in: Biochem. Biophys. Res. Commun., 189 (2); 1008–1016; PMID 1472014.
  65. Knight, MR. et al. (1991): Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium, in: Nature, 352(6335); 524–526; PMID 1865907.
  66. Hampf M, Gossen M: A protocol for combined Photinus and Renilla luciferase quantification compatible with protein assays. Anal Biochem. 2006 Sep 1;356(1):94–99, PMID 16750160.
  67. pjk-gmbh.com: Reportergene Assays.
  68. promega.de: Dual Luciferase Reporter Assay System.
  69. Lim, E. et al. (2009): In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. In: J Vis Exp, 26. pii: 1210. PMID 19404236; doi:10.3791/1210; mit Video (engl).
  70. O’Connell-Rodwell, CE. et al. (2008): In vivo analysis of heat-shock-protein-70 induction following pulsed laser irradiation in a transgenic reporter mouse. In: J Biomed Opt. 13(3); 030501; PMID 18601518; PDF (freier Volltextzugriff, engl.).

Weblinks[Bearbeiten]

Siehe auch[Bearbeiten]

Dies ist ein als lesenswert ausgezeichneter Artikel.
Dieser Artikel wurde am 24. Juli 2013 in dieser Version in die Liste der lesenswerten Artikel aufgenommen.